CometChip: תפוקה גבוהה 96-ובכן פלטפורמה למדידת נזק לדנ"א בתאי Microarrayed אדם

המטרה הכוללת של הליך זה היא להדגים כיצד להשתמש בשבב COMET כדי לבצע מדידות נזק ל-DNA בתפוקה גבוהה בתאי יונקים. זה מושג על ידי טעינת תאי יונקים תחילה לשבב COMET. השלב השני הוא לטפל בתאים בכימיקלים שידועים כגורמים לנזק לדנ"א.

לאחר מכן, התאים עוברים ליזה ואלקטרו איסט באמצעות פרוטוקולי בדיקת COMET מסורתיים. השלב האחרון הוא הדמיה פלואורסצנטית של DNA תאי כדי להמחיש את נדידת ה-DNA הפגום. בסופו של דבר, תוכנת ניתוח תמונות משמשת לכימות היקף הנזק ל-DNA.

אז מבחן ה-com קיים כבר הרבה מאוד זמן וזה מבחן שימושי מאוד לבחינת הרבה סוגים שונים של נזק ל-DNA. אבל הבעיה הייתה שהתפוקה שלו ממש נמוכה והיא חסרת רגישות. אז יצרנו את שבב COMET, שהוא בעצם גרסת תפוקה גבוהה מאוד של בדיקת COMET שמאפשרת לבצע סינון תפוקה גבוהה לבדיקת תרופות, למשל, ולמחקרים אפידמיולוגיים.

סטודנט לתואר שני ב-Jing GA במעבדה שלי ידגים את ההליך. שבב התרדמת הוא ג'ל עם מערך של בארות מיקרו המיוצרות מחותמת מיקרו מפוברקת עם עמודי מיקרו בקוטר קטן כמו זה של תא בודד כדי להתחיל למקם לתוך צלחת מלבנית אחת עם צלחת מלבנית עם הצד כלפי מטה. לאחר שטיפת הג'ל פעמיים ב-25 מיליליטר ב-XPBS אחד, הצב את שבב הפסיק על צלחת זכוכית, ולאחר מכן סמן את כיוון הג'ל בהתאם.

כעת לחץ בעדינות צלחת הפוכה ללא תחתית של 96 בארות לתוך הג'ל וודא שכל 96 הבארות נמצאות באזור הג'ל. לאחר מכן מהדקים את שני צידי צלחת 96 הבאר לצלחת הזכוכית עם קליפס קלסר בגודל 1.5 אינץ'. לבסוף, שאפו את כל ה-PBS העודף מכל אחד מהם.

ובכן קצרו תרחיף או תאים דבקים על פי נהלים סטנדרטיים ודללו את התאים במדיה לריכוז סופי של 100, 000 עד מיליון תאים למיליליטר. ודא שמתקבל מתלה תא בודד על ידי מעבר דרך מסנן תאים במידת הצורך. פיפטה 100 מיקרוליטר של תרחיף תאים לכל באר, שבב השביט 96 צלחת באר בסיום.

מכסים את הצלחת בסרט קשר הג'ל למניעת אידוי, ולאחר מכן מניחים באינקובטור המוגדר על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות לאחר הוצאת הצלחת מהחממה. לאחר שחלפו 30 הדקות, שאפו את המדיה מכל אחד מהם, ובכן הסירו את תפסי הקלסר ואת צלחת 96 הבאר ללא תחתית החזיקו את שבב השביט עם צלחת הזכוכית בזווית ושטפו בעדינות עם XPBS אחד כדי להסיר תאים עודפים על גבי הארוס. כעת צפה בצלחת דרך עדשת אובייקטיבית פי ארבעה במיקרוסקופ שדה בהיר כדי לבדוק את עומס התאים האופטימלי לאחר טעינת תאים מספיקים, הנח שבב com על משטח אחיד, שכבת-על עם אגרוס נקודת התכה נמוכה של 1% שהתחמם מראש ל-37 מעלות צלזיוס.

הניחו לכיסוי להתמצק בטמפרטורת החדר למשך שלוש דקות ולאחר מכן הניחו אותו ארבע מעלות צלזיוס למשך חמש דקות למינון מלא של התאים בכימיקלים מעניינים. ראשית, יישר בזהירות את הבארות של שבב השביט עם הבארות של צלחת חדשה ללא תחתית של 96 בארות ולחץ כלפי מטה. אבטח את צלחת 96 הבאר לצלחת הזכוכית בעזרת קליפסים קלסר כמו קודם.

לאחר מכן הניחו את הצלחת על קרח והוסיפו 100 מיקרוליטר של הכימיקל המעניין במינון הרצוי לכל באר אפשרו לכימיקל הנחקר להישאר על התאים עם פרק הזמן הרצוי לאחר המינון, שאפו את התמיסה הכימית מכל באר ושטפו עם XPBS אחד במידת הצורך. חותכים את הג'ל לחתיכות נפרדות. לאחר מכן כדי ללמוד קינטיקה של תיקון, הוסף אמצעי תרבית לבארות הדגירה והמשך לליזה של תאים בנקודות זמן ספציפיות לתאי LY לבדיקת השביט האלקליין.

הכן כ-25 מיליליטר של מאגר ליזה אלקליין עובד עבור כל שבב על ידי הוספת 1% Triton X 100 לתמיסת מלאי הליזיס האלקליין. לאחר מכן מצננים מראש בארבע מעלות צלזיוס. שפכו את מאגר הליזה האלקליין למיכל גדול יותר משבב השביט.

לאחר מכן טבלו את השבב האלקליין במקום מאגר הליזיס האלקליין העובד במקרר ואפשרו לליזה להמשיך למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס. למחרת, הסר את שבב השביט ממאגר הליזיס והשתלב במהירות עם XPBS אחד. לאחר מכן הנח את השבב בתא אלקטרופורזה כשצד סרט הג'ל פונה כלפי מטה ואבטח בעזרת סרט דו צדדי.

קח את החדר לחדר הקירור של ארבע מעלות צלזיוס ומלא את החדר במאגר אלקטרופורזה אלקליין קר לרמה שמכסה רק את הג'ל. לאחר מכן השאירו את השבב בארבע מעלות צלזיוס למשך 40 דקות כדי לאפשר התפרקות אלקליין. לבסוף, הפעל את הג'ל בוולט לסנטימטר אחד ו -300 מיליאמפר למשך 30 דקות.

בחדר הקירור, כוונן את נפח מאגר האלקטרופורזה בתא כדי להשיג זרם ריצה רצוי. עבור בדיקת השביט הנייטרלי, הפוך את מאגר הליזיס הנייטרלי עובד על ידי הוספת 1% טריטון X 110% DMSO לתמיסת מלאי ליזה ניטרלית. שוב, הכנת כ-25 מיליליטר של מאגר ליזה עובד לכל שבב.

הנח את מאגר הליזיס הנייטרלי העובד בחממה המכוונת ל-43 מעלות צלזיוס לחימום מראש. לאחר חימום מאגר הליזיס הנייטרלי, טבלו את שבב הפסיק במאגר הליזיס הנייטרלי והניחו בחממה של 40 מעלות צלזיוס למשך הלילה. למחרת, הסר את מאגר הליזיס הנייטרלי ולאחר מכן הפעל פעמיים עם מאגר אלקטרופורזה ניטרלי למשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס בכל פעם, אבטח את השבב בתא האלקטרופורזה והעביר לחדר הקירור.

כמו קודם, מלאו את תא האלקטרופורזה במאגר אלקטרופורזה ניטרלי קר לרמה שמכסה רק את הג'ל ואפשרו לג'ל לשבת בחדר קירור למשך 60 דקות, הפעל את הג'ל ב-0.6 וולט לסנטימטר ושישה מיליאמפר למשך 60 דקות בחדר הקירור. שוב, כוונן את נפח מאגר האלקטרופורזה בתא כדי להשיג זרם ריצה רצוי במידת הצורך. לאחר הוצאת שבב הקום מחדר הקירור, נטרלו את הג'לים על ידי שטיפה ונטרול מאגר פעמיים למשך 15 דקות כל אחד בארבע מעלות צלזיוס.

הישאר בשבב עם כתם DNA פלואורסצנטי כגון זהב סייברג או אירידיום ברומיד. על פי הוראות היצרן ותמונתו באמצעות נציג מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, שביטי Microwell מ-TK לא מטופלים, שישה לימפובלסטים מוצגים בלוח העליון של תרשים זה. אלה מ-TK שישה תאים נחשפו ל-50 מי חמצן מיקרו-מולאריים בפאנל האמצעי ו-100 מי חמצן מיקרו-מולרי בפאנל התחתון.

כל החשיפות היו במשך 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס. גרף קו זה מציג את תגובת מינון מי החמצן של TK שישה תאים. כל נקודת נתונים היא הממוצע של שלושה ניסויים בלתי תלויים שבהם הושג האחוז החציוני של לפחות 50 שביטים בודדים בכל ניסוי.

גרף זה מציג וריאציה של דגימה לדגימה של בדיקת שבב הפסיק עבור TK שישה תאים חשופים למי חמצן אחוז זנב נתוני DNA של כל באר מוצגים כאן. כל קופסה מייצגת את החציון של לפחות 50 שביטים בודדים מכל באר. הממוצע של 12 בארות הוא 77 נקודות, 53%סטיית התקן היא 3.99% ומקדם השונות הוא 5.2%גרף זה מראה ניסוי לניסוי שונות.

אותה חשיפה למי חמצן חזרה על עצמה שש פעמים, והנתונים של כל חזרה מוצגים כפס אפור. כל קופסה מייצגת את האחוז החציוני של דנ"א הזנב של לפחות 100 שביטים בודדים מכל חזרה. הממוצע של שש חזרות הוא 49.57% המוצג כסרגל האחורי כאן.

סטיית התקן של שש חזרות היא 4.99% וסרגל השגיאה של הממוצע הוא 2.04% המיוצג כפס האוויר באיור כמו הבדיקה הנפוצה המסורתית. החוקרים חופשיים לבצע שינויים בהליך זה או להשתמש בבלגן אחר, כגון הכללת אנזימים ספציפיים לנגעים מטוהרים כדי לענות על שאלות נוספות לגבי סוג הנזק ל-DNA המיוצר בתאים. טכניקת שבב השביט סללה את הדרך למחקרים על תאי יונקים כדי ללמוד על נזק ותיקון DNA.

ומכיוון שיש לו תפוקה גבוהה, הוא מאפשר לבצע מחקרים קליניים ואפידמיולוגיים שפשוט לא היו אפשריים בעבר בגלל מספר הדגימות.