פיגומים דיווח עצמי לתרבית תאים 3-Dimensional

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לייצר ננו-חיישנים מגיבים ל-pH ופיגומים המדווחים על עצמם שניתן לנטר בזמן אמת ובאתרם על מנת לסייע בהבנת התנאים המשפיעים על צמיחת התאים. זה מושג על ידי הכנת ננו-חיישנים מגיבים לאנליטים תואמים ביולוגית, שיכולים לנטר את ה-pH באמצעות יציאות פלואורסצנטיות. כשלב שני, ננו-חיישנים מגיבים ל-pH משולבים בפיגומים מסובבים אלקטרו פולימריים היוצרים סביבה תלת מימדית שעליה ניתן לגדל ולנטר תאים.

לאחר מכן, תאי יונקים יושבים על הפיגומים המסתובבים של האלקטרו, וננו-חיישנים מועברים גם הם לסביבה התוך-תאית שלהם על מנת לנטר את ה-pH התוך-תאי. במהלך הניסוי מתקבלות תוצאות המראות את יכולתם של ננו-חיישנים תוך-תאיים ופיגומים המדווחים על עצמם לנטר את ה-pH בסביבות מהונדסות רקמות על סמך יחסי פלואורסצנטיות הנרכשים במיקרוסקופיה קונפוקלית. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון שימוש בבדיקות pH אלקטרוניות, הוא שניתן לבצע מדידות באתרן ובזמן אמת מבלי להפריע לצמיחת התאים.

כדי להתחיל, הכינו את הפלואורופורים על ידי המסה של 1.5 מיליגרם של fam SE למיליליטר אחד של דימתילפורממיד המכונה DMF בתחתית עגולה. בקבוק גם ממיס 1.5 מיליגרם של Tamara SE למיליליטר אחד של DMF בבקבוק שני. לאחר מכן מוסיפים 1.5 מיליליטר של שלושה אמינו פרופיל טריאתיל לכל בקבוק ומערבבים ברציפות בחושך תחת אטמוספירת חנקן יבשה בטמפרטורה של 21 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות.

לאחר מכן, הוסף 250 מיקרוליטר משתי תמיסות הצבע לתערובת המכילה שישה מיליליטר אתנול וארבעה מיליליטר אמוניום הידרוקסיד הכלולים בבקבוק תחתון עגול. מערבבים את התערובת החדשה הזו בחום של 21 מעלות צלזיוס לאחר שעה. מוסיפים לאט לאט 0.5 מיליליטר טטראתיל אורטוס סיליקט לתערובת, וממשיכים לערבב אותה עוד שעתיים.

במהלך תקופה זו, צפו שהתערובת תהפוך לעכורה, ואז אספו את הננו-חיישנים על ידי אידוי סיבובי ואחסנו אותם בבקבוקון זכוכית בארבע מעלות צלזיוס לשימוש עתידי. לאחר מכן, הוסף את ננו-חיישני ה-pH המיובשים בחמישה מיליגרם למיליליטר במאגרי הפוספט של סורנסון, הנעים בין pH 5.5 ל-pH 7.5 במרווחים של pH 0.5. השעו מחדש את הננו-חיישנים על ידי מערבולת הדגימות למשך שלוש דקות ולאחר מכן סוניקציה שלהן למשך חמש דקות או עד שהתמיסה הופכת לעכורה.

אסוף נתוני כיול על ידי מדידת הדגימות באורך גל עירור של 488 ננומטר עבור FAM ו-568 ננומטר. עבור תמרה, אספו את הפליטות ב-500 עד 530 ננומטר עבור FAM ו-558 עד 580 ננומטר עבור תמרה, וחשבו את היחס בין מקסימום הפליטה המיוצרת בכל ערך pH. לאחר מכן הכינו את הדגימה להדמיית SEM על ידי הנחת דגימה של ננו-חיישנים על מיקרוסקופ אלקטרונים מצופה פחמן, בדל ומקרטע המצפים את החלקיקים בזהב למשך חמש דקות מתחת לאטמוספירה של ארגון.

לאחר הציפוי, הנח את הדגימות במיקרוסקופ האלקטרונים והתאם את מרחק העבודה, המתח וההגדלה כדי למזער את טעינת האלקטרונים ולהפיק את התמונות הטובות ביותר במכסה אדים. הכינו תמיסת PLGA של 20% בכלורו מתאן עם פורמט פרינאום 1%. טען את התמיסה למזרק של 10 מיליליטר עם מחט מילוי קהה בגודל 18 והתקן אותה היטב על משאבת מזרק.

פתרון זה ישמש כדי לגרום לפיגומי PLGA בקרה להרחיק את קצה המחט 20 סנטימטרים מלוח איסוף אלומיניום בגודל 20 על 15 סנטימטר, ולחבר את האלקטרודה של ספק כוח מתח גבוה לקצה המזרק ולקרקע את החוט לצלחת איסוף האלומיניום. לאחר מכן, הפעל את ספק הכוח והתאם את המתח ל -12 קילו-וולט. לאחר מכן הפעל את משאבת המזרק וספק את התמיסה באמצעות קצב זרימה קבוע של 3.5 מיליליטר לשעה למשך שעתיים.

זה יפיק עומק פיגום של כ-60 מיקרון. לאחר שתסיים, כבה את הציוד והשאיר את הפיגום במכסה האדים למשך 24 שעות כדי לאפשר לשאריות הממס להתאדות. להכנת פיגומים המשולבים עם ננו-חיישנים מגיבים ל-pH, הכינו את תמיסת ה-PLGA כמו קודם, אך הפעם הוסיפו גם חמישה מיליגרם למיליליטר של הננו-חיישנים.

לאחר מכן סובב את ה- pH המגיב באמצעות אותן הגדרות כמו קודם. לאחר מכן, כייל את תגובת ה-pH של הפיגום על ידי הנחת דגימות קטנות של הפיגום המיובש עם ננו-חיישנים משולבים בלוחות תרבית של 35 מילימטר וטבילתם בשני מיליליטר של חוצצי סורנסן פוספט בין pH 5.5 ל-7.5 במרווחים של 0.5 במיקרוסקופ קונפוקלי. השתמש בלייזר ארגון של 488 ננומטר כדי לעורר FAM ובלייזר קריפטון של 568 ננומטר כדי לעורר את תמרה בתוך הננו-חיישנים.

התבונן בפליטה ב-500 עד 530 ננומטר עבור FAM ו-558 עד 580 ננומטר עבור תמרה, ולאחר מכן חשב את היחס בין מקסימום הפליטה המיוצר בכל ערך pH. ראשית, יש לעקר את משטחי הפיגומים עם מקור אור UV במרחק של שמונה סנטימטרים למשך 15 דקות מכל צד. לאחר מכן העבירו באופן סטרילי את הפיגומים לצלחת תרבית של 12 בארות והניחו טבעת פלדה בקוטר פנימי של סנטימטר אחד וקוטר חיצוני של שני סנטימטרים מעל הפיגום.

לאחר מכן, הוסף PBS עם רצועת עט של 5% לחלק הפנימי והחיצוני של טבעת הפלדה ודגר את הדגימות למשך הלילה. למחרת. הסר את ה-PBS עם סטרפטוקוקוס עט של 5% ושטוף את הפיגומים עם PBS.

לאחר מכן הוסף 500 מיקרוליטר של אמצעי תרבית תאים לחלק הפנימי והחיצוני של טבעת הפלדה ולחמם את הצלחת בחממה. לאחר מכן, קצרו את התאים המעניינים והכינו תרחיף תאים של אחד כפול 10 עד ששת התאים למיליליטר. כאשר התאים מוכנים, הסר את המדיה מהבאר והוסף מיליליטר אחד של מדיה טרייה לחלק החיצוני של טבעת הפלדה.

לאחר מכן הוסף 300 מיקרוליטר של מתלה התא לחלק הפנימי של טבעת הפלדה ונדנד בעדינות את הצלחת כדי לפזר את התאים באופן שווה. הנח את הצלחת באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2, ודגר על התאים כל עוד נדרש. רענון המדיה כל יומיים-שלושה תאי זרע על הפיגומים כמתואר בסעיף הקודם, ומאפשר להם לגדול ללא הפרעה במשך 72 שעות.

לאחר מכן שטפו את התאים עם PBS והוסיפו 500 מיקרוליטר של מדיה נטולת סרום לחלק החיצוני של הטבעת ו -300 מיקרוליטר בתוך הטבעת. דגרו את הצלחת למשך שעה בחום של 37 מעלות צלזיוס במהלך הדגירה. הכן את פתרון A על ידי הוספת חמישה מיליגרם של הננו-חיישנים עם 50 מיקרוליטר של זנות אופטימלית וקצרה.

לאחר מכן ערבב את תמיסה B על ידי הוספת חמישה מיקרוליטרים של כריתת שומן 2000 עד 45 מיקרוליטר של Optum, ואפשר לתערובת לדגור בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. לאחר מכן, הוסיפו תמיסה A לתערובת תמיסה B ולאחר מכן דגרו בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות ליצירת תמיסה C, שהיא קומפלקס הליפוזום הננו-חיישני. הסר את הצלחת מהחממה והוסף 100 מיקרוליטר מהתמיסה המורכבת לחלק הפנימי של טבעת הפלדה.

לאחר מכן הכניסו את הצלחת בחזרה לאינקובטור ודגרו את התאים עם קומפלקסים של ריאגנטים לכריתת שומן למשך שלוש שעות לאחר הדגירה. שאפו את המדיה ושטפו את התאים פעמיים עם PBS מחומם לפני טבילת הפיגום היושב בתא במאגרים של phs שונים כדי לפקח על תגובת הננו-חיישנים. כעת בתוך התאים, דמו את התאים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית פלואורסצנטית כדי לעקוב אחר מיקום הננו-חיישנים בתוך תאי יונקים.

ראשית, הכינו והעבירו רק משפחה המכילה ננו-חיישנים לתאים היושבים על פיגומי PLGA. לאחר מכן הוסף שני מיקרוליטר של 50 ננו טוחנת גשש ליו אדום ל-300 מיקרוליטר של מדיה ודגירה למשך שעה ב-37 מעלות צלזיוס לאחר תקופת הדגירה. הסר את המדיה ושטוף את התאים פעמיים עם PBS.

לאחר מכן הוסף שני מיקרוליטרים של PBS או מדיה אחרת ללא פנול אדום כדי לכסות את התאים במהלך הדמיה קונפוקלית. לאחר מכן, הוסיפו חמישה מיקרומולר של הכתם הגרעיני, דרקו חמישה ל-PBS ודגרו עם התאים במשך שלוש דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. לאחר שלוש דקות, הסר את הצלחת מהאינקובטור והנח אותה על הבמה הקונפקלית להדמיית הדמיה, הננו-חיישנים אברונים חומציים וגרעין באמצעות אורכי גל עירור ופליטה שונים כמתואר בפרוטוקול הטקסט הנלווה תוך שימוש בסריקה רציפה כדי למנוע איסוף של אורכי גל עירור, התפלגות הגודל של הננו-חיישנים המגיבים ל-pH המוכנים אופיינה באמצעות SEM שבו אוכלוסיית הננו-חיישנים שצולמו נמדדה ונמצאה יש מידות ננומטריות בטווח של 240 עד 470 ננומטר.

משמאל מוצגת תמונה של סיבי PLGA מסובבים אלקטרונים, ומימין סיבי PLGA מסובבים אלקטרונים עם ננו-חיישנים. מיקרוגרפי ה-SEM של הסיבים מספקים עדות לאסוציאציה של ננו-חיישנים על פני הסיבים. עם זאת, הם עשויים להיות משולבים גם בתוך סיבי הפיגום.

ברגע שהאלקטרו מסתובבים, הננו-חיישנים שומרים על יכולתם להישאר פעילים אופטית וכימית ומוצגים כאן קשורים לסיבי הפיגום. משמאל צבע המשפחה מוצג בירוק, ומימין צבע תמרה מוצג באדום. יחס עוצמת הפלואורסצנט מייצר עקומת כיול כפי שמוצג כאן.

ננו-חיישנים שהוערכו לבד וכאשר שולבו באלקטרו, פיגומי PLGA מסתובבים שיקפו זה את זה, והראו כי הננו-חיישנים שומרים על פעילותם האופטית לאחר שילובם בפיגומים. הננו-חיישנים המשולבים גם מגיבים היטב באופן הפיך לערכי pH משתנים כאשר המאגר הוחלף בין pH של 5.5 ל-7.5. יחס המשפחה טמרה הגיב כצפוי בכל פעם שהוצגה.

להלן תמונות קונפוקליות של פיברובלסטים שהיו להם ננו-חיישנים שהועברו תוך תאיים באמצעות ריאגנט טרנספקציה. הקולוקליזציה המנוקבת של צבעי המשפחה והתמרה מצביעה על כך שהצבעים נותרו לכודים במטריצת הננו-חיישנים. ניתן לאשר אספקה תוך-תאית של הננו-חיישנים על ידי מדידת יחס תמרה של תאים הממוקמים במאגרים שונים.

כפי שניתן לראות כאן, היחס גדל בעת מדידת ננו-חיישנים מבוססי פיגומים, אך נשאר יציב בעת מדידת החיישנים בתוך התאים. לאחר פיתוח טכניקה זו, חוקרים בתחום הנדסת הרקמות עשויים לחקור באתרם ובזמן אמת. שינויים מיקרו-סביבתיים ב-pH תוך-תאי בתוך מבנים תאיים תלת-ממדיים מבלי להפריע לניסוי המתמשך.