פיגומים דיווח עצמי לתרבית תאים 3-Dimensional

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא לייצר ננו-חיישנים המגיבים ל-pH ופיגומים בעלי דיווח עצמי שניתן לניטור בזמן אמת וב-in situ, וזאת כדי לסייע בהבנת התנאים המשפיעים על צמיחה תאית. דבר זה מושג תחילה על ידי הכנת ננו-חיישנים תואמי-ביולוגית המגיבים לאנליט, אשר יכולים לנטר pH באמצעות פלואורסצנציה. כשלב שני, ננו-חיישנים המגיבים ל-pH משולבים בפיגומים פולימריים המיוצרים בשיטת electro spun, ליצירת סביבה בתלת-ממד שבה ניתן לתרבת ולנטר תאים.

בשלב הבא, תאי יונקים מושבצים על פיגומים שיוצרו בשיטת אלקטרו-ספינינג (electrospun), וננו-חיישנים מוחדרים לסביבתם התוך-תאית על מנת לנטר את ה-pH התוך-תאי. במהלך הניסויים התקבלו תוצאות המראות את יכולתם של ננו-חיישנים תוך-תאיים ושל פיגומים בעלי יכולת דיווח עצמי לנטר את ה-pH בתוך סביבות של הנדסת רקמות, בהתבסס על יחסי פלואורסצנציה שנרכשו באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון שימוש בחסוני pH אלקטרוניים, הוא שניתן לבצע את המדידות in situ ובזמן אמת ללא צורך בהפרעת הצמיחה התאית.

כדי להתחיל, הכין את הפלואורופורים על ידי המסה של 1.5 milligrams של fam SE בתוך one milliliter של dimethylformamide, הידוע כ-DMF, בתוך בקבוק תחתית עגולה. בבקבוק שני, המס 1.5 milligrams של Tamara SE בתוך one milliliter של DMF. לאחר מכן, הוסף 1.5 milliliters של three amino propyl triethyl לכל בקבוק וערבב ברציפות בחושך תחת אטמוספירת חנקן יבשה בטמפרטורה של 21 °C למשך 24 שעות.

בשלב הבא, הוסף 250 µL מכל אחד מפתרונות הצבע לתערובת המכילה ששה מיליליטרים של אתנול וארבעה מיליליטרים של ammonium hydroxide בבקית עגולה. ערבב תערובת זו בטמפרטורה של 21 °C למשך שעה אחת. הוסף לאט לתערובת 0.5 מיליליטר של tetraethyl orthos silicate, והמשך בערבוב למשך שעתיים נוספות.

במהלך זמן זה, צפו שהתערובת תהפוך לעכורה, ולאחר מכן אספו את הננו-חיישנים באמצעות אידוי סיבובי ואחסנו אותם בבקבוק זכוכית בטמפרטורה של 4 °C לשימוש עתידי. לאחר מכן, הוסיפו את ננו-חשייני ה-pH המיובשים בריכוז של 5 mg/mL בתוך בופרי פוספט של Sorenson, בטווח של pH 5.5 עד pH 7.5 במרווחים של pH 0.5. תלו את הננו-חיישנים מחדש על ידי ערבוב במערבל וורטקס (vortexing) של הדגימות למשך שלוש דקות ולאחר מכן בצעו סוניקציה למשך חמש דקות או עד שהתמיסה תהפוך לעכורה.

אסוף נתוני כיול על ידי מדידת הדגימות באורך גל עירור של 488 nanometers עבור FAM ו-568 nanometers עבור Tamara. עבור Tamara, אסוף את הפליטות בטווח של 500 עד 530 nanometers עבור FAM ו-558 עד 580 nanometers עבור Tamara, וחשב את היחס בין מקסימומי הפליטה שהתקבלו בכל ערך pH. לאחר מכן, הכן את הדגימה לדימוי SEM על ידי הנחת דגימה של ננו-חיישנים על גבי תומך (stub) של מיקרוסקופ אלקטרוני מצופה פחמן, וביצוע ציפוי ספרטר (sputter coating) של החלקיקים בזהב למשך חמש דקות תחת אטמוספירה של argon.

לאחר הציפוי, הכניסו את הדגימות למיקרוסקופ האלקטרונים וכוון את מרחק העבודה, המתח וההגדלה כדי למזער את טעינת האלקטרונים ולהפיק את התמונות הטובות ביותר בתוך מנדף כימי. הכינו תמיסה של 20% PLGA בדיכלורומתאן עם 1% perfluorooctanoic acid. העמיסו את התמיסה למזרק של 10 milliliters עם מחט מילוי קהה במידה 18 והצמידו אותו באופן מאובטח למשאבת מזרקים.

תמיסה זו תשמש להכנת פיגומים של PLGA כביקורת; מקמו את קצה המחט במרחק של 20 centimeters מלוח איסוף אלומיניום בגודל 20 על 15 centimeters, וחברו את האלקטרודה של ספק כוח במתח גבוה לקצה המזרק והאריקו את החוט ללוח האיסוף מאלומיניום. לאחר מכן, הפעילו את ספק הכוח וכווננו את המתח ל-12 kilovolts. לאחר מכן, הפעילו את משאבת המזרקים והובילו את התמיסה בקצב זרימה קבוע של 3.5 milliliters per hour למשך שעתיים.

פעולה זו תיצור עובי פיגום של כ-60 מיקרון. עם סיום התהליך, כבו את המכשיר והשאירו את הפיגום במבתח העשביים למשך 24 שעות כדי לאפשר לשאריות הממס להתאדות. להכנת פיגומים המטמיעים ננו-חיישנים רגישים ל-pH, הכינו את תמיסת ה-PLGA כפי שנעשה קודם לכן, אך הפעם הוסיפו גם חמישה מיליגרם למילליליטר של הננו-חיישנים.

לאחר מכן, בצעו אלקטרו-ספינינג (electro spin) של החומר המגיב ל-pH בהתאם להגדרות הקודמות. בשלב הבא, כיילו את התגובתיות של הפיגום ל-pH על ידי הנחת דגימות קטנות של הפיגום המיובש, המכיל ננו-חיישנים, בתוך פלטות תרבית של 35 מילימטר והטבעתן בשני מיליליטר של בופרי פוספט סורנסן (Sorensen phosphate buffers) בטווח pH שבין 5.5 ל-7.5, במרווחים של 0.5, תחת מיקרוסקופ קונפוקאלי. השתמשו בלייזר ארגון של 488 ננומטר כדי לעורר את FAM ובלייזר קריפטון של 568 ננומטר כדי לעורר את Tamara בתוך הננו-חיישנים.

עקוב אחר הפליטה ב-500 עד 530 ננומטר עבור FAM וב-558 עד 580 ננומטר עבור Tamara, ולאחר מכן חשב את היחס בין מקסימומי הפליטה שהתקבלו בכל ערך pH. ראשית, סטריל את פני השטח של הפיגומים באמצעות מקור אור UV במרחק של שמונה סנטימטרים למשך 15 דקות מכל צד. לאחר מכן, העבר את הפיגומים באופן סטרילי לפלטה לתרבית בעלת 12 בארות והנח טבעת פלדה בעלת קוטר פנימי של סנטימטר אחד וקוטר חיצוני של שני סנטימטרים מעל הפיגום.

לאחר מכן, יש להוסיף PBS עם 5% pen strip לחלק הפנימי והחיצוני של טבעת הפלדה ולהדגיר את הדגימות למשך לילה. למחרת, יש להסיר את ה-PBS עם 5% pen strep ולשטוף את הפיגומים ב-PBS.

לאחר מכן, הוסיפו 500 µL של מצע גידול תאים לחלק הפנימי והחיצוני של טבעת הפלדה וחממו מראש את הפלטה באינקובטור. בשלב הבא, קצרו את התאים הרלוונטיים והכינו תרחיף תאים בריכוז של 1×10⁶ תאים למילליטר. כאשר התאים מוכנים, הסירו את המצע מהבאר והוסיפו 1 mL של מצע טרי לחלק החיצוני של טבעת הפלדה.

לאחר מכן, הוסיפו 300 µL של תרחיף התאים לתוך טבעת הפלדה ונערו בעדינות את הפלטה כדי להפיץ את התאים באופן שווה. הכניסו את הפלטה לאינקובטור בטמפרטורה של 37 °C עם 5%CO2, והדגירו את התאים למשך הזמן הנדרש. תוך כדי רענון המצע בכל יומיים עד שלושה ימים, זרעו תאים על הפיגומים כפי שתואר בסעיף הקודם, ואפשרו להם לגדול ללא הפרעה במשך 72 שעות.

לאחר מכן שטפו את התאים ב-PBS והוסיפו 500 microliters של מצע ללא סרום למסביב הטבעת ו-300 microliters לתוך הטבעת. דגרו את הצלחת למשך שעה אחת ב-37 degrees Celsius. הכינו את תמיסה A על ידי הוספת חמישה milligrams של הננו-חיישנים ל-50 microliters של optimum וערבבו קצרה.

לאחר מכן, ערבבו את תמיסה B על ידי הוספת 5 µL של lipectomy 2000 ל-45 µL של Optum, והמתינו לדגירה של התערובת בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. בשלב הבא, הוסיפו את תמיסה A לתערובת תמיסה B ולאחר מכן דגרו בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות ליצירת תמיסה C, שהיא קומפלקס הליפוזום של הננו-חיישן. הוציאו את הפלטה מהדגירה והוסיפו 100 µL מתמיסת הקומפלקס אל תוך טבעת הפלדה.

לאחר מכן, החזיר את הפלטה לדגרה והדגר את התאים עם קומפלקסי ריאגנט הליפקטומיה למשך שלוש שעות לאחר הדגרה. שאב את המצע ושטוף את התאים פעמיים ב-PBS מחומם לפני טבילת הפיגום עליו ממוקמים התאים בבאפרים בערכי pH שונים כדי לנטר את תגובת הננו-חיישנים. כעת, בתוך התאים, דמיין את התאים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית פלואורסצנטית כדי לעקוב אחר מיקום הננו-חיישנים בתוך תאי יונקים.

ראשית, הכין והחדף רק nanosensors המכילים fam לתאים המושבבים על פיגומים מסוג PLGA. לאחר מכן, הוסף 2 µL של LysoTracker Red בריכוז 50 nM ל-300 µL של מצע גידול והדגר בטמפרטורה של 37 °C למשך שעה אחת. בסיום תקופת ההדגרה, הסר את מצע הגידול ושטוף את התאים פעמיים עם PBS.

לאחר מכן, הוסיפו שני מיקרוליטרים של PBS או מצע אחר ללא פנול אדום כדי לכסות את התאים במהלך הדמיון הקונפוקאלי. לאחר מכן, הוסיפו חמישה מיקרומול של הצבע הגרעיני, drac five, ל-PBS והדגרימו יחד עם התאים למשך שלוש דקות ב-37 degrees Celsius. לאחר שלוש דקות, הוציאו את הפלטה מהמדגרה והניחו אותה על הבמה הקונפוקאלית לצורך הדמיה; הדמיפו את הננו-חיישנים, את האורגנאלים החומציים ואת הגרעין באמצעות אורכי גל שונים של עירור ופליטה כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט הנלווה, תוך שימוש בסריקה סדרתית כדי למנוע איסוף של אורכי גלי עירור. התפלגות הגדלים של הננו-חיישנים המגיבים ל-pH שהוכנו אופיינה באמצעות SEM, כאשר אוכלוסיית הננו-חיישנים שהודמייתה נמדדה ונמצאה בעלת ממדים ננומטריים בטווח של 240 עד 470 nanometers.

משמאל מוצגת תמונה של סיבי PLGA שנוצרו בשיטות אלקטרו-ספינינג (electrospinning), ומימין סיבי PLGA שנוצרו באותו אופן עם ננו-חיישנים. מיקרוגרפים של ה-SEM של הסיבים מספקים ראיות לשיוך של הננו-חיישנים על פני השטח של הסיבים. עם זאת, הם עשויים להיות מוטמעים גם בתוך סיבי הפיגום.

לאחר התהליך של electrospinning, הננו-חיישנים שומרים על יכולתם להישאר פעילים מבחינה אופטית וכימית, וכאן הם מוצגים כקשורים לסיבי הפיגום. משמאל מופיע צבע ה-fam בירוק, ומימין צבע ה-Tamara באדום. יחס העוצמה הפלואורסצנטית יוצר עקומת כיול כפי שמוצג כאן.

ננו-חיישנים שנבדקו לבדם וכאשר שולבו בתוך פיגומים של PLGA שיוצרו בשיטת אלקטרוספינינג שיקפו זה את זה, ובכך הוכיחו כי הננו-חיישנים שומרים על פעילותם האופטית לאחר השילוב בפיגומים. הננו-חיישנים המשולבים הגיבו גם הם באופן הפיך ובצורה טובה לשינויים בערכי pH, כאשר התמיסות המבופרות הוחלפו לסירוגין בין pH של 5.5 ל-7.5. יחס ה-fam Tamra הגיב באופן צפוי בכל פעם שהוצג.

להלן תמונות קונפוקאליות של פיברובלסטים שקיבלו ננו-חיישנים בתוך התא באמצעות ריאגנט טרנספקציה. קולוקליזציה נקודית של צבעי ה-fam וה-Tamara מעידה על כך שהצבעים נותרו כלואים במטריקס של הננו-חיישן. ניתן לאשר את ההחדרה התוך-תאית של הננו-חיישנים על ידי מדידת יחס ה-fam Tamara של תאים שהוצבו בבפ푅ים שונים.

כפי שניתן לראות כאן, היחס עולה בעת מדידת הננו-חיישנים המבוססים על הפיגום, אך נותר יציב בעת מדידת החיישנים בתוך התאים. לאחר פיתוח טכניקה זו, חוקרים בתחום הנדסת הרקמות יוכלו לחקור in situ ובזמן אמת שינויים ב-pH התוך-תאי של המיקרו-סביבה בתוך מבני תאים בתלת-ממד, מבלי להפריע לניסוי המתבצע.