Name: בידוד של ראשוני myofibroblasts מעכבר ורקמות מעי גס אנושיים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-12T19:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 59 s
Description: למד שיטה לבידוד ראשוני של מיופיברובלסטים מרקמת מעי גס של עכברים ואנשים באמצעות טיפולים אנזימטיים וגידול תאי. שיטה זו מאפשרת מחקר מעמיק של תפקיד התאים בפיזיולוגיה ובמחלות מערכת העיכול.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי לבריאות גרנט 5KO8DK085136-02 לJY.

1. השג רקמות מעי גס עכבר פרוטוקול לביצוע ניסויים בבעלי חיים, המפרט את הרציונל ומטרות של המחקר, הוגש ואושר על ידי המשרד המוסדי שלנו של בעלי החיים פיקוח מחקר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את העכבר עם isoflurane בשאיפה אחריו נקע בצוואר הרחם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביצוע חתך קו האמצע הגחון, לחזור בו המעי הדק משם ולזהות את המעי הגס. לחזור בו שלפוחית ​​השתן ורחם (אם קיימים) רוחבי ולזהות את עצם הערווה ולחתוך אותו עם מספריים עדינים לחשוף את פי הטבעת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את לפדר הגב של פי הטבעת משל המעי הגס ולגייס את מעי גס מפי הטבעת לcecum, ותחצה אותו לנתק את המעי הגס מהמעי הדק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הדגימה בופר פוספט קר כקרח (PBS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממלאי מזרק 10 מיליליטר עם PBS קר כקרח ולשטוף את מעי גס לומן מספר פעמים כדי לנקות את התוכן שלה, ולאחר מכן לחתוך את אופ המעי הגסn אורך חכם באמצעות מספריים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את המעי הגס בצינור חרוטי 50 מיליליטר מכיל 20 מיליליטר של PBS קר כקרח. המעי הגס אינו חייב להיות ממוקם בכל אורינטציה מסוימת. לשטוף את המעי הגס על ידי החלפת PBS עד שהנוזל הוא ברור ללא חומר חלקיקים. </li></ol> אנושי פרוטוקול להשיג רקמה אנושית מחולים כירורגי, המפרט את החשיבות של השגת רקמה זו, כמו גם הערכה של סיכונים ויתרונות פוטנציאליים, הוגש ואושר על ידי המשרד המוסדי תכנית אדם הגנת המחקר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שיתוף פעולה מחקרי עם מנתח מעי גס הוא הכרחי כדי להיות מסוגל להשיג רקמה אנושית למחקר שלך. פרוטוקול להשיג רקמת מעי גס אנושית יש להגיש ואושר על ידי דירקטוריון הסקירה המוסדי שלך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כתב הסכמה מהדעת מתקבלת מהמטופל לפני ההליך כירורגי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המנתח יבצע כריתת מעי גס בדוכןאופנה ארד. ברגע שהמעי הגס הוסר מהמטופל, הדגימה נלקחת מייד לפתולוגיה. 0.5 בסעיף בעובי מלא של קיר מעי גס אין צורך להערכה פתולוגית מסופק וממוקמים באופן מיידי על PBS קר כקרח. דגימה זו לא צריכה לכלול את לפדר המעי הגס, ונספחי חלקי איטום יש להסירם, כמו גם, שכן הנוכחות של שומן תשפיע על תהליך העיכול. </li></ol> 2. לחשוף תאי אפיתל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה המעי הגס כולו עכבר ב25 מיליליטר של 5 מ&quot;מ EDTA בHBSS (טמפרטורת חדר) בצינור חרוטי 50 מיליליטר. מניחים את צינור חרוטי באמבט 37 מעלות צלזיוס רועדות אוויר (250 סל&quot;ד) במשך 15 דקות. , לאחר 15 דקות יוצקים בזהירות את הנוזל ולמלא את הצינור עם 25 מיליליטר של 5 מ&quot;מ EDTA, חזור עבור סכום כולל של 5 שטיפות. למעי גס אנושי, לאחר קבלת רצועת סנטימטר וחצי מקיר מעי גס מפתולוג לחתוך את המעי הגס במספריים לארבעה חלקים שווים בגודלם. הנח שתי החתיכות לתוך צינור חרוטי 50 מיליליטר אחד, והנח את שתי החתיכות של רקמת מעי גס שנותרו לתוך צינור חרוטי 50 מיליליטר נפרד. ואז דגירה עם 25 מיליליטר של 5 מ&quot;מ EDTA בHBSS ולבצע שטיפות, כפי שתואר לעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את מעי גס פעמיים ב20 מיליליטר של PBS קר כקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את רקמת מעי גס עכבר בצינור חרוטי 50 מיליליטר חדש המכיל 20 מיליליטר של RPMI-5, 10 U של dispase, ו -2,000 U של collagenase D (בטמפרטורת חדר). לרקמת המעי הגס האנושית, השתמש בכמות כפולה של dispase וcollagenase (20 dispase U, 4,000 ד collagenase U). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצינור באמבטית אוויר 37 C ° רועד בכיוון אנכי (אם בצורה אופקית, יש אוורור יותר מדי ונזק לתאים). לנער ב250 סל&quot;ד עד 60 דקות. לאחר החשיפה לdispase וcollagenase D, רקמת המעי הגס תתחיל לעכל ורקמת המעי הגס תתחיל נראית קשה. זה בדרך כלל לוקח סביב 30 דקות. כאשר המעי יש מראה זה, להסיר את המעי הגס מהאנזימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Shake צינור אחד למעלה ולמטה 2-4 פעמים כדי לשבור את הרקמה. Pellet הרקמה ב XG 200 בצנטריפוגה שולחן (4 מעלות צלזיוס) במשך 5 דקות. יוצק בזהירות את supernatant וזורק. </li></ol> 3. בידוד Myofibroblast ותרבות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend כל גלולה על ידי הוספת 10 חיץ מיליליטר ACK תמוגה (47 מעלות צלזיוס). צנטריפוגה שוב XG 200 במשך 5 דקות (4 מעלות צלזיוס), יוצקת את וזורקים supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend כל גלולה על ידי הוספת 10 מיליליטר RPMI-5 עם טפטפת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר מחצית מהשעית התא (5 מיליליטר) דרך מסננת רשת 70 מיקרומטר באמצעות פיפטה 10 מיליליטר לתוך צלחת שטופלה TC 100 מ&quot;מ. לאחר מכן להוסיף 15 מיליליטר נוסף של RPMI-5. חזור עם 5 מיליליטר הנותר של השעיה תא לתוך צלחת שטופלה TC 100 מ&quot;מ שונה. מעי גס עכבר אחד ולכן יניבו שתי מנות שטופלה TC 100 מ&quot;מ. רצועה אחת וחצי סנטימטר של רקמת מעי גס אנושית תניב בסך הכל ארבע מנות שטופלה TC 100 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הכלים בתרבית רקמה ב10% CO 2 באינקובטור ב 37 ° C. תנאי התרבות הם אותו Fאו עכבר ותאים ראשוניים של אדם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי 3 שעות, לשטוף בעדינות את תאים שאינם חסיד עם שני שינויים של HBSS. צף הפסולת צריך לשטוף בעדינות. תאים חסיד מורכבים של תאים, מקרופאגים וmyofibroblasts אפיתל. שבוע לאחר זריעה, רק myofibroblasts פער, מקרופאגים ותאי האפיתל להזדקן לאחר המעבר הראשון. להוסיף RPMI-5 טריים ולגדל את התאים בתרבית תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי passaged ידי trypsinization למשך 5 דקות ומפוצלות 2:1. </li></ol> סימני קצור HBSS: תמיסת מלח מאוזנת של האנק; RPMI-5: תקשורת רוזוול הפארק ממוריאל מכון; ACK: אמוניום כלוריד-אשלגן-; FCS: עגל בסרום עוברי; טופלו TC: תרבית רקמה שטופל פתרונות מאגר תמוגה ACK - (4.15 גרם NH 4 Cl, 0.5 גרם KHCO 3, 18.6 מ&quot;ג Na 2 EDTA, 400 מיליליטר H 2 O, כדי להתאים את pH 7.2-7.4 עם 1 N HCl). steriliz סינוןדואר דרך מסנן 0.2 מיקרומטר ולאחסן ב 4 ° C. RPMI-5 - (כדי להפוך 500 מיליליטר: 454.5 מיליליטר RPMI, FCS 25 מיליליטר, 5 מיליליטר 200 L-גלוטמין מ&quot;מ, 5 מיליליטר 1 M HEPES, pH 7.4, 5 מיליליטר 100 פירובט נתרן מ&quot;מ, 5 מיליליטר 100x עט סטרפטוקוקוס, 500 מיליליטר 50 מ&quot;מ B-ME PBS).

<ol><li>Armaka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+cell+targeting+by+TNF+as+a+common+pathogenic+principle+in+chronic+inflammatory+joint+and+intestinal+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal cell targeting by TNF as a common pathogenic principle in chronic inflammatory joint and intestinal diseases.</a> J. Exp. Med. 205, 331-337 (2008).</li>
<li>Powell, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paracrine+cells+important+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Paracrine cells important in health and disease.</a> Am. J. Physiol. 277, C1-C9 (1999).</li>
<li>Yoo, J., Rodriguez Perez, C. E., Nie, W., Sinnett-Smith, J., Rozengurt, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+kinase+D1+mediates+synergistic+MMP-3+expression+induced+by+TNF-alpha+and+bradykinin+in+human+colonic+myofibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Protein kinase D1 mediates synergistic MMP-3 expression induced by TNF-alpha and bradykinin in human colonic myofibroblasts.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 413, 30-35 (2011).</li>
<li>Yoo, J., Chung, C., Slice, L., Sinnett-Smith, J., Rozengurt, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+kinase+D+mediates+synergistic+expression+of+COX-2+induced+by+TNF-%7Balpha%7D+and+bradykinin+in+human+colonic+myofibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Protein kinase D mediates synergistic expression of COX-2 induced by TNF-{alpha} and bradykinin in human colonic myofibroblasts.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 297, C1576-C1587 (2009).</li>
<li>Valentich, J. D., Popov, V., Saada, J. I., Powell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+characterization+of+an+intestinal+subepithelial+myofibroblast+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Phenotypic characterization of an intestinal subepithelial myofibroblast cell line.</a> Am. J. Physiol. 272, C1513-C1524 (1997).</li>
<li>Rodriguez Perez, C. E., Nie, W., Sinnett-Smith, J., Rozengurt, E., Yoo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TNF-alpha+potentiates+lysophosphatidic+acid-induced+COX-2+expression+via+PKD+in+human+colonic+myofibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Gastrointest.+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">TNF-alpha potentiates lysophosphatidic acid-induced COX-2 expression via PKD in human colonic myofibroblasts.</a> Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 300, G637-G646 (2011).</li>
<li>Yoo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TNF-alpha+induces+upregulation+of+EGFR+expression+and+signaling+in+human+colonic+myofibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Gastrointest.+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">TNF-alpha induces upregulation of EGFR expression and signaling in human colonic myofibroblasts.</a> Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 302, G805-G814 (2012).</li>
<li>Mahida, Y. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+human+colonic+subepithelial+myofibroblasts+express+extracellular+matrix+proteins+and+cyclooxygenase-1+and+-2%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Adult human colonic subepithelial myofibroblasts express extracellular matrix proteins and cyclooxygenase-1 and -2.</a> Am. J. Physiol. 273, G1341-G1348 (1997).</li>
<li>De Wever, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Priming+and+potentiation+of+DNA+damage+response+by+fibronectin+in+human+colon+cancer+cells+and+tumor-derived+myofibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Priming and potentiation of DNA damage response by fibronectin in human colon cancer cells and tumor-derived myofibroblasts.</a> Int. J. Oncol. 39, 393-400 (2011).</li>
<li>Edwards, R. A., Smock, A. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+arachidonate+release+and+PGE2+production+in+Gi+alpha2-deficient+intestinal+and+colonic+subepithelial+myofibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Inflamm.+Bowel+Dis%22%5BJournal%5D)">Defective arachidonate release and PGE2 production in Gi alpha2-deficient intestinal and colonic subepithelial myofibroblasts.</a> Inflamm. Bowel Dis. 12, 153-165 (2006).</li>
<li>Hoang, B., Trinh, A., Birnbaumer, L., Edwards, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decreased+MAPK-+and+PGE2-dependent+IL-11+production+in+Gialpha2-%2F-+colonic+myofibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Gastrointest.+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Decreased MAPK- and PGE2-dependent IL-11 production in Gialpha2-/- colonic myofibroblasts.</a> Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 292, G1511-G1519 (2007).</li>
<li>Li, Z. B., Kollias, H. D., Wagner, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myostatin+directly+regulates+skeletal+muscle+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Myostatin directly regulates skeletal muscle fibrosis.</a> J. Biol. Chem. 283, 19371-19378 (2008).</li>
<li>Saada, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subepithelial+myofibroblasts+are+novel+nonprofessional+APCs+in+the+human+colonic+mucosa%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Subepithelial myofibroblasts are novel nonprofessional APCs in the human colonic mucosa.</a> J. Immunol. 177, 5968-5979 (2006).</li>
<li>Lahar, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+subepithelial+myofibroblasts+support+in+vitro+and+in+vivo+growth+of+human+small+intestinal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Intestinal subepithelial myofibroblasts support in vitro and in vivo growth of human small intestinal epithelium.</a> PLoS One. 6, e26898(2011).</li>
</ol>

יש מחברים אין לחשוף.

הטכניקה הכללית היא דומה בעת שימוש או עכבר או מעי גס אנושי. גם טכניקה זו יכולה לשמש כדי לבודד myofibroblasts מהמעי הדק. פרטים ספציפיים עבור הבידוד של myofibroblasts מ1. עכבר ו2. מעי גס אנושי הם דנו בהמשך. 1. קולון מאוס השקיה של מעי גס העכבר היא הקל על ידי הצמדת 4 ב, מחט בוטה סוף 16 G פופר לקצה אחד של המעי הגס. זה גם עוזר בעת חיתוך המעי הגס לאורכו. א...

הרגולציה של תפקוד מערכת (GI) במערכת העיכול כוללת אינטראקציות מורכבות, דינמיות בין השכבה הרירית וmesenchyme הבסיסי שלה. אינטראקציות אלה בדרך כלל לשמש כדי לשמור על איזון, אך עשויה גם להוביל להתפתחות של מדינות מחלה בתנאים פתולוגיים 1. Myofibroblasts הוא subpopulation של תאי סטרומה ממוקמים subjacent לשכבת האפיתל המתקשרות באופן אוטוקריני עם סובבי אוכלוסיות תא לווסת את מספר תהליכי מערכת העיכול הקריטיים הכוללים התחדשות רירית, תיקון, וסיסטיק 2. שורת תאי 18Co היא דוגמא לקו אדם הגס myofibroblast תא שכבר בשימוש נרחב ללמוד לתפקד myofibroblast משום שהיא חולקת רבות ממאפייני העיקריים בmyofibroblasts אתרו. אלה כוללים את ביטוי החלבון של חלק אקטין שריר (α-SMA) וvimentin, כמו גם ביטוי של מספרשל קולטני תא שטח כגון צמיחת אפידרמיס גורם הקולטן, או קולטנים ל3,4 חומצת lysophosphatidic. בגלל מאפיינים אלה משותפים ultrastructural, כמו גם קווי הדמיון בתפקוד ביולוגי 5, שורת תאי 18Co כבר נעשה שימוש נרחב ללמוד לתפקד myofibroblast בהקשר של מדינות מחלה רבות כגון מחלת מעי דלקתית או 3,6 סרטן מעי גס. עם זאת, יש מגבלות וחששות בעת שימוש בקו סלולרי. אלה כוללים חוסר יציבות genotypic לאורך זמן שמבדיל את שורות תאים מהתאים ראשוניים, לשנות את הפנוטיפ ותפקוד ביולוגי של התא, כולל שיעורי צמיחה ואינטראקציות עם אוכלוסיות תאים אחרות. שורות תאים גם חוסר הרכיבים הרגילים של microenvironment GI (אפיתל, סטרומה, ורכיבים של כלי דם), שהיא מגבלה העיקרית לשימוש בו. לכן, המסקנות שהוסקה ממחקר קו הסלולרי ניסיוני דורשת אימות נוספת כדי לצמצם את ריsk של פרשנות שגויה. ניתן להשיג מרקמות מעי גס אנושיות ועכבר myofibroblasts העיקרי כדי לאשר את ממצאי ניסויים שזוהו בשורת תאי 7. השיטה שתוארה במקור על ידי Mahida, et al. 8, והפרוטוקול שלנו הוא אחת טכניקות רבות תיארו היטב, שניתן להשתמש כדי לבודד myofibroblasts העיקרי מעכבר והמעי גס אנושי 9. לכל מודל של עכברים של מחלה במעי הגס, טכניקה זו יכולה לשמש כדי לבודד myofibroblasts העיקרי כדי ללמוד כיצד הם פועלים עם תאי שכנים או לתרום לשניהם רגילים או במערכת העיכול פתולוגיים מעבדת 10,11. טכניקה זו יכולה לשמש גם כדי ללמוד איך myofibroblasts לתרום לריפוי רירי, סיסטיק, והפיתוח של אדנומות וקרצינומות של מעי גס. יכול גם להיות מושגת myofibroblasts העיקרי מרקמות מעי גס אנושיות שכבר עברו כריתה בזמן מבצע ל( מחלה דלקתית של מעי, מגבלות, דיברטיקוליטיס) שפיר או ממאיר גonditions. תאים ראשוניים מבודדים מרקמת מעי גס אנושית ועכבר ניתן לגדל בתרבית תאים ומנוצלים על מספר מוגבל של מעברים.

<table><tbody><tr><td>שם המגיב</td><td>מספר קטלוגי</td><td>של החברה</td><td>הערות (אופציונלי)</td></tr><tr><td>Dispase I</td><td>Invitrogen/GIBCO</td><td>#17105-041</td><td></td></tr><tr><td>קולגנאז D</td><td>Roche</td><td>#1 088 858</td><td></td></tr><tr><td>4 אינץ', 16 G פופר מחט קהה</td><td>פישר</td><td>#14-825-16K</td><td></td></tr></tbody></table>

בידוד של ראשוני myofibroblasts מעכבר ורקמות מעי גס אנושיים

Isolation of Primary Myofibroblasts from Mouse and Human Colon Tissue

Myofibroblast הוא תא סטרומה של מערכת העיכול (GI), שכבר צוברת תשומת לב רבה לתפקידה החיוני בפונקציות במערכת העיכול רבות. בעוד כמה שורות תאי myofibroblast זמינות מסחרי ללמוד תאים אלה במבחנה, יש תוצאות מחקר משורת תאים שנחשפה לתנאי תרבית תאים ניסיוניים מגבלות מובנות בשל האופי מדי רדוקציוניסטית של העבודה. שימוש בmyofibroblasts העיקרי מציע יתרון גדול במונחים של מאשר ממצאי ניסוי שזוהו בשורת תאים. בידוד של myofibroblasts העיקרי ממודל חיה מאפשר לחקר myofibroblasts בתנאים המחקים באופן הדוק יותר נחקרים מצב המחלה. בידוד של myofibroblasts העיקרי מרקמות מעי גס אנושיות מספק לטעון את נתוני ניסוי הרלוונטיים ביותר, שכן התאים מגיעים ישירות מחולים עם המחלה הבסיסית. אנו מתארים טכניקה מבוססת היטב כי יכול להיות utilized לבודד myofibroblasts העיקרי משני בעכבר ורקמת מעי גס אנושית. תאים מבודדים אלה מאופיינים להיות אקטין אלפא שריר החלק וvimentin חיובי, וdesmin שלילי, עולה בקנה אחד עם myofibroblasts המעיים subepithelial. ניתן לגדל תאי myofibroblast ראשוניים בתרבית תאים ומשמשים למטרות ניסוי על מספר מצומצם של מעברים.

ברגע בודד, ניתן לגדל myofibroblasts האנושי הראשוני בתרבית תאים ומשמש על מספר מצומצם של מעברים (עד חלוף 4). תאים אלה מתאפיינים כחלק אקטין שריר וvimentin חיובי, ו( ​​איור 1 א) desmin שלילי, עולים בקנה אחד עם myofibroblasts subepithelial המעיים 5,7. יש להם גם מורפולוגיה stellate אופיינית (איור 1). myofibroblasts העיקרי לאחר מכן ניתן להשתמש כדי לאשר את ממצאי ניסויים שזוהו בשורת תאים. גישה זו נוצלה על מנת להוכיח כי TNF-α הפרו דלקתי ציטוקינים...

Myofibroblast הוא תא סטרומה השפעה של מערכת העיכול המווסת את התהליכים פיסיולוגיים חשובים במדינות שניהם נורמליות ומחלה. אנו מתארים טכניקה המאפשרת בידוד של myofibroblasts העיקרי משני בעכבר ורקמת מעי גס אנושית, אשר יכול להיות מנוצל לניסויים במבחנה.

The myofibroblast is  a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining  considerable attention for its critical role in many GI ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לבודד מיופיברובלסטים ראשוניים מרקמת מעי גס של עכבר או בן אדם. דבר זה מושג תחילה על ידי קצירת המעי הגס מהעכבר התורם ושטיפתו ב-PBS קר מאוד. לאחר מכן, התאים האפיתליאליים מוסרים באמצעות סדרת שטיפות וטיפולים אנזימטיים.לאחר מכן, תרחף התאים האפיתליים נזרע בצלחוני תרבית רקמות והושאר לדגירה. לבסוף, תאים שאינם נצמדים נשטפים כדי לבודד את המיופיברובלסטים. בסופו של דבר, ניתן לקבל תוצאות המראות בידוד של תאי מיופיברובלסטים ראשוניים באמצעות צביעה אימונוהיסטוכימית. את הפרוצדורה יעדיר טכנאי מהמעבדה שלי.כל הניסויים אושרו על ידי המשרד לפיקוח על מחקר בבעלי חיים של אוניברסיטת קליפורניה, תוך שימוש בעכבר שהורדמה באמצעות שאיפת isof fluorine, ולאחריה ביצוע פריקה גרשית. התחל בביצוע חתך בקו האמצע הבטני. הרחק את המעיים ואתר את המעי הגס, הרחק את שלפוחית השתן לצדדים, וזהה את עצם הפובוביס באמצעות מספריים עדינים.חתכו את העצם כדי לחשוף את הרקטום, הפרידו את המסנטרים הדורסליים מהרקטום ומהמעי הגס, וקבעו את המעי הגס מהפיטם ועד למעי העיוור. לאחר מכן, בצעו חיתוך רוחבי כדי לנתק את המעי הגס מהמעי הדק. העבירו את הדגימה ל-PBS קר בקרח.לאחר מילוי מזרק של 10 cc ב-PBS קר מאוד, שטפו את לומן המעי הגס מספר פעמים כדי לנקות את תוכנו. לאחר מכן, השתמשו במספריים כדי לחתוך את המעי הגס לאורכו והניחו אותו בת

isolation-of-primary-myofibroblasts-from-mouse-and-human-colon-tissue

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

סוגי התאים הדבקים העיקריים שמקורם בשריר אנושי הם תאים מיוגניים ופיברובלסטים. כאן, אוכלוסיות התאים מועשרות באמצעות מיון תאים מופעל מגנטי המבוסס על אנטיגן CD56. תיוג חיסוני לאחר מכן עם נוגדנים ספציפיים ושימוש בטכניקות ניתוח תמונה מאפשר כימות של מאפיינים ציטופלזמיים וגרעיניים בתאים בודדים.

בידוד וכמוני Immunocytochemical אפיון של תאים ראשוניים myogenic וFibroblasts משרירי שלד אדם

אנו מציגים פרוטוקול ליצירת תרביות ראשוניות של תאי סטרומה בוושט עכבריים ואנושיים עם פנוטיפ מיופיברובלסטים. לתאים מתורבתים יש מורפולוגיה בצורת ציר, מבטאים α-SMA ווימנטין, וחסרים סמני פני תא אפיתל, המטופויאטי ואנדותל. ניתן להשתמש בתאי סטרומה מאופיינים במחקרים פונקציונליים של אינטראקציות אפיתל-סטרומליות.

בידוד של myofibroblasts מעכבר והוושט אדם

מתואר פרוטוקול לחילוץ תאים אנושיים ראשוניים מגידול כירורגי במעי הגס ורקמות תקינות. לאחר מכן התאים המבודדים מתורבתים על מצעים אלסטיים רכים (הידרוג'לים פוליאקרילאמיד) המתפקדים על ידי חלבון מטריצה חוץ-תאי, ומשובצים במיקרו-חרוזים פלואורסצנטיים. ציטומטריית מתיחה מבוצעת כדי להעריך מתחי התכווצות תאים.

בידוד של תאי גידול במעי גס אנושיים ראשוניים מרקמות כירורגי וCulturing אותם ישירות על מצעים אלסטיים רכים לגרירה Cytometry

כאן אנו מתארים שיטה פשוטה לבידוד של תאי פני השטח של המעי הגס של עכברים מובחנים מרחבית מתאי בסיס הקריפטה הבסיסיים.

Cryosectioning שיטה לMicrodissection של Murine גס רירית

כאן, מוצג פרוטוקול לבידוד והקמת תרביות פיברובלסטים/מיופיברובלסטים ראשוניים (MF) מתאי קיבה, מעי דק ורקמות מעי גס קפואים עם פנוטיפ MF. תאים אלה מבטאים CD90, α-SMA ווימנטין. MFs יכולים לשמש למגוון בדיקות פונקציונליות כולל פעילות אנזימטית וייצור ציטוקינים.

בידוד של פיברובלסטים / myofibroblasts 90 + CD מאדם דוגמאות במערכת העיכול קפוא

המטרה של פרוטוקול זה היא לבודד את התאים המונונרורים השוכנים בתוך המעי הגס של הנקודתיים על ידי העיכול אנזימטית של הרקמה באמצעות קולגן. פרוטוקול זה מאפשר בידוד יעיל של תאים מוניוצלולים וכתוצאה מכך השעיית תא בודד אשר בתורו יכול לשמש עבור immunophenotyping קלדה חזקה.

בידוד של לינה קינאין תאים מונמוננקה מקולון מורלין באמצעות קולגנאז

אנו מציגים פרוטוקול כדי לבודד את הפיברוטים הראשוניים העיקריים באופן קל, מהיר ואמין, performable על ידי למתחילים (למשל, סטודנטים). הליך זה משלב את העיכול ברקמה אנזימטית ועצבנות מכנית עם גלי אולטרה סאונד כדי להשיג פיברוהטיות ראשונית. ניתן להתאים את הפרוטוקול בקלות לדרישות נסיוניות ספציפיות (לדוגמה, רקמת אדם).

אולטרה סאונד-מוגבר למבוגרים בידוד פיברוהפיצוץ

מיאוברוב הם מתרבים תאים מקודכי להבדיל לטופס מיונוקלאוטים מיופולימרים ובסופו של דבר שריר השלד סיבים. כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור בידוד יעיל והתרבות של myoblasts חזיקה הראשוני של השרירים העכבר המבוגר הצעיר. השיטה מאפשרת מחקרים מולקולריים, גנטיים ומטבוליים של תאי שריר בתרבות.

בידוד והבידול של מכשולים ראשוניים מתוך שריר השלד של העכבר Explants

קבלת אוכלוסייה טהורה של פיברותקיעות חיונית כדי ללמוד את תפקידם בתיקון פצעים פיברוזיס. המתואר כאן היא שיטה מפורטת כדי לבודד את הפיברוכדורים ומיוריסותליות מלבבות העכבר שנפגעו ונפצעו ולאחר מכן אפיון הטוהר והפונקציונליות שלהם על ידי immunofluorescence RTPCR, מיון תאים בסיוע פלואורסצנטית, ו התכווצות ג'ל לקולגן.

בידוד ואפיון של מבוגרים ופיברותקיעות לב ומיופיברופיצוצים

בפרוטוקול זה, אנו מתארים כיצד ליצור מונוליירים אפיתל ראשוניים של אפיתל ישירות מקריפטות מעיים. אנו מספקים גישות ניסיוניות כדי ליצור monolayers confluent על מסננים חדירים, monolayers confluent לריפוי פצעי גירוד ומחקרים ביוכימיים, ו monolayers דליל ונוח לניתוח כשל חיסוני.

דור של מונוליירים אפיתל המעי הגס הראשי מורין מקריפטות מעיים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבידוד mesenchyme המעי murine, כולל telocytes. אלה יכולים לשמש למספר יישומים, כגון תרבות משותפת עם עכבר או אורגנואידים שמקורם בבני אדם, כדי לתמוך בצמיחה ולשקף טוב יותר את המצב ברקמה המקורית.

בידוד של מזנכימה במעי מורין וכתוצאה מכך תשואה גבוהה של טלוציטים

למד שיטה לבידוד ראשוני של מיופיברובלסטים מרקמת מעי גס של עכברים ואנשים באמצעות טיפולים אנזימטיים וגידול תאי. שיטה זו מאפשרת מחקר מעמיק של תפקיד התאים בפיזיולוגיה ובמחלות מערכת העיכול.

בידוד של ראשוני myofibroblasts מעכבר ורקמות מעי גס אנושיים

גלה סרטונים נוספים