בידוד של hepatocytes האנושי על ידי שני שלבים Collagenase זלוף נוהל
3 בספטמבר 2013
הליך זלוף collagenase שני שלבים שונה לבידוד של hepatocytes אדם מתואר. שיטה זו יכולה להיות מיושמת גם לכבדים של יונקים אחרים. Hepatocytes מבודד זמינים בתשואה גבוהה וכדאיות, מה שהופך אותם המודל מתאים למחקר מדעי בתחומים כגון התחדשות כבד, פרמקוקינטיקה וטוקסיקולוגיה.
המטרה הכללית של הליך זה היא לבודד תאי כבד אנושיים (hepatocytes) באמצעות הליך פרפוזיה של קולגנאז בשני שלבים. זאת מושג תחילה על ידי קנולציה של כלי הדם בחלק מהכבד באמצעות קנולה לשטיפה. לאחר מכן מבוצעות פרפוזיה ועיכול של חלק הכבד באמצעות קולגנאז.
השלב השלישי הוא הסרת קפסולת הגליסנס (glistens), השחררה את תאי הכבד המופרדים. השלב האחרון הוא סנטריפוגה במהירות נמוכה המבודדת הפטוציטים. לבסוף, ניתן לזהות הפטוציטים באמצעות מיקרוסקופיה בניגוד מופע (phase contrast) או על ידי צביעת אלבומין באמצעות אימונו-ציטוכימיה, כאשר החיוניות והניב של ההפטוציטים נקבעים באמצעות מבחן הדחיה של trypan blue.
הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, מכיוון ששלבי הקניולציה והעיכול קשים ללמידה. זאת משום שהקניולציה דורשת מיומנות רבה, וניתן להתקשות בזיהוי סיום תהליך העיכול. עבור מי שאינם בקיאים בטכניקה, את הפרוצדורה תדגים נטלי לון, טכנאית מהמעבדה שלי.
בהדגמה זו, נשתמש בנתח כבד של כבש במקום בנתח כבד אנושי. הגדירו את הציוד לביצוע פרפוזיה של נתח הכבד באופן הבא: כווננו את מקלח המים לטמפרטורה מתאימה, כך שהתמיסות יהיו בטמפרטורה של 37 degrees Celsius בעת הגעתן לנתח הכבד. טמפרטורה של 41 degrees Celsius מתאימה עבור תמיסות אחת, שתיים ושלוש; לעומת זאת, עבור המעבה הזכוכיתית בעלת המעטפת, תמיסות ארבע צריכה להיות בטמפרטורה של 37 degrees Celsius כדי להפחית את אובדן הפעילות של הקולגנאז. זמן קצר לפני תחילת הפרפוזיה, הפעילו את ווסת הגז עבור מכשיר החמסנה. קבלו מפתולוג נתח כבד שקפסולת גליסון שלו שלמה ברובה או במלואה, ובעל משטח חיתוך אחד בלבד.
יש להניח את פיסת הכבד על משפך בוכנר המכיל דיסק סינון מחורר, וכעת יש להחיל primed למערכת הפרפוזיה באמצעות תמיסה 1 בקצב זרימה נמוך. יש להחדיר קנולות השקיה מעוקלות עם קצוות זית אל תוך כלי הדם הגדולים שעל פני השטח החתוכים של פיסת הכבד. ככל שהדם נשטף החוצה מהכבד, הרקמה הופכת לבהירה יותר באזורים בעלי פרפוזיה טובה. מספר הקנולות שנעשה בהן שימוש משתנה בהתאם לגודל הכבד.
בדרך כלל, יש להשתמש בארבע עד שמונה קנולות עבור כבדים שמשקלם נע בין פחות מ-20 גרם ליותר מ-80 גרם. יש לבחור את קוטר הקנולה כך שתהיה התאמה הדוקה ומאובטחת. השאירו את כלי הדם הקטנים פתוחים כדי לאפשר לתמיכה להתנקז מהרקמה.
כעת, הגבירו את קצב הזרימה במשאבה הפריסטלטית לבין 110 ל-460 milliliters per minute. הפרפוזיה נחשבת טובה אם נחיתה של פיסת הכבד היא בהירה לאורך כל קצב הזרימה שנעשה בו שימוש. הדבר תלוי בגודל הכבד, כאשר עבור כבדים גדולים יותר נעשה שימוש בקצבי פרפוזיה גבוהים יותר.
באופן כללי, מהירות פרפוזיה ממוצעת של 44 מיליליטר לדקה לכל קנולה היא אידיאלית עבור טווח של משקלי כבד שונים. קצב הזרימה הנבחר צריך להוביל לנפיחות קלה של נתח הכבד. יש לשמור על נתח הכבד לח במהלך הפרפוזיה על ידי כיסויו בפיסת גזה ספוגה בתמיסת סליין.
לאחר ביצוע פרפוזיה לרקמה עם ליטר אחד של תמיסה אחת, כדי לשטוף שאריות דם מנתח הכבד. החליפו את נוזל הפרפוזיה לתמיסה שתיים ובצעו פרפוזיה למשך 10 דקות. לאחר מכן, החליפו את נוזל הפרפוזיה לתמיסה שלוש ובצעו פרפוזיה עם חצי ליטר.
כעת החליפו את נוזל הפרפוזיה לתמיסה ארבע, המכילה collagenase. בצעו פרפוזיה זו באופן מחזוריי למשך 9 עד 12 דקות או עד שהכבד יעבור עיכול מספיק. רקמת הכבד צריכה להיראות כמתפרקת מעט תחת הקפסולה המבריקה.
הכבד צריך להרגיש גם הוא רך כאשר בוחנים אותו בצד הקהה של הסקלפל. חשוב לעכל את נתח הכבד למשך הזמן המדויק, שכן עיכול יתר עלול להוביל לחיוניות נמוכה של ההפטוציטים, ועיכול חסר עלול להוביל לתפוקה נמוכה של הפטוציטים. התחילו בכיבוי משאבת הפריסטלטיקה ובהוצאת הקנולה מנתח הכבד.
לאחר מכן, הניחו את הרקמה בתוך כלי התגבשות המכיל 100 עד 200 מיליליטר של תמיסה. חמישה. הוציאו בזהירות את קפסולת הברק (glistens capsule) ונערו בעדינות כדי לשחרר את התאים. אם ישנם אזורים שאינם מרוויים היטב, ניתן להשתמש בסכין מנתחים כדי לחתוך דרכם ולשחרר את התאים הכלואים בתוכם.
הוסיפו תמיסה חמישית נוספת לפי הצורך במהלך התהליך, ובסופו של דבר הגבירו את נפח התמיסה החמישית ל-500 milliliters. כעת סננו את תרחיף התאים פעמיים. ראשית, סננו את התאים דרך רשת ניילון של 210 micron אל תוך בקבוק קונוי של one liter.
לאחר מכן, סננו את התאים דרך רשת ניילון של 70 micron אל תוך בקבוק קוני בנפח של own liter. שפכו שני נפחים שווים של תרחיף התאים אל תוך מבחנות צנטריפוגה של 200 milliliter. לאחר מכן, בצעו צנטריפוגה לתרחיף התאים המסונן ב-72 Gs למשך חמש דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות Celsius.
שאבו את הנוזל העילאי והשביו בעדינות את משקע התאים בכ-200 milliliters של תמיסה. חמש. חזרו על הסרכזו והשביה שלושה פעמים; לאחר הסרכזו האחרון, השביו את התאים בתמיסת אחסון קרה לריכוז סופי של 2 עד 5 מיליון hepatocytes ל-milliliter. ניתן להשתמש בבדיקת trypan blue כדי למדוד במדויק את מספר התאים באמצעות hemocytometer.
מוצגים כאן הפטוציטים שנצבעו ב-trypan blue מ-648 בידודים. החיוניות הממוצעת של הפטוציטים האנושיים המבודדים הייתה 77 ± 10%. התפוקה הממוצעת של הפטוציטים הייתה 13 ± 11 מיליון הפטוציטים לגרם כבד, כפי שנמדד באמצעות אימונופלורסצנציה. הפטוציטים המבודדים שנצבעו בחיוב לאלבומין בירוק הראו טוהר של 94 ± 1% לקביעת טוהר ההפטוציטים.
צביעה אימונופלואורסצנטית בוצעה ארבע פעמים עם חמישה חזרות לכל ניסוי. מיקרוסקופיית ניגודיות פאזה מראה את המאפיינים המורפולוגיים של התאי הכבד (hepatocytes), כגון גודל התא הגדול והצורה הפוליגונית שלהם. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיו בעלי הבנה טובה לגבי אופן בידוד תאי כבד אנושיים באמצעות הליך פרפוזיה של קולגנז בשני שלבים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מתאר הליך מותאם של פרפוזיה בשני שלבי קולגנאז לבידוד הפטוציטים אנושיים, אשר ניתן להחיל גם על כבדים של יונקים אחרים. השיטה מניבה כמות גבוהה של הפטוציטים עם חיוניות גבוהה, מה שהופך אותם למתאימים למחקרים בתחומי התחדשות הכבד, פרמקוקינטיקה ורעילות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- ביולוגיה של התא
- הפטולוגיה
- פרמקולוגיה
רקע
- הפטוציטים אנושיים הם חיוניים להבנת תפקודי הכבד.
- טכניקות בידוד משפיעות על חיוניותן ועל התנובה של ההפטוציטים.
- פרפוזיה של קולגנאז היא שיטה נפוצה לבידוד תאים.
- הפטוציטים באיכות גבוהה נדרשים למגוון יישומים מדעיים.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה מהימנה לבידוד הפטוציטים אנושיים.
- שיפור התניב והחיוניות של התאים המבודדים.
- אספקת מודל למחקרים הקשוריים לכבד.
שיטות מעבדה שנעשה בהן שימוש
- קניולציה של כלי דם ברקמת כבד.
- פרפוזיה ועיכול של כבד באמצעות קולגנאז.
- הסרה של קפסולת גליסון לשחרור תאי כבד.
- צנטריפוגציה במהירות נמוכה לבידוד הפטוציטים.
תוצאות עיקריות
- בידוד מוצלח של הפטוציטים אנושיים חיים.
- ניבוב גבוה של הפטוציטים המתאימים למחקר.
- זיהוי של הפטוציטים באמצעות מיקרוסקופיית ניגודיות פאזה (phase contrast microscopy).
- הערכת חיוניות באמצעות מבחן הדירה של trypan blue.
מסקנות
- הפרוצדורה המשופרת מבודדת בצורה יעילה הפטוציטים.
- ניתן להשתמש בתאים המבודדים במגוון יישומים מחקריים.
- ניתן להתאים שיטה זו לכבדים של יונקים אחרים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
הפטיocytes אנושיים בעלי חיוניות גבוהה הם בסיסיים למידול פרמקוקינטיקה ניבוית, רעילות ומחלות כבד במחקר ופיתוח בביו-פרמה.&ד. הליך הפרפוזיה עם קולגנאז בשני שלבים מאפשר גישה מהימנה להפטוציטים ראשוניים של בני אדם, ובכך תומך בגילוי מוקדם, בהפחתת סיכונים מכניסטיים ובמחקר תרגומי. יכולת זו מחזקת את הביטחון בפורטפוליו על ידי אספקת מערכות תאיות רלוונטיות פיזיולוגית להערכת תרכובות ולפיתוח סמנים ביולוגיים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פארמה&ד'
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בדיקה של חילוף חומרים של תרופות ורעילות במערכת הרלוונטית לבני אדם.
- תומך בהסרת סיכונים מכניסטית על ידי אספקת הפטוציטים תפקודיים לניתוח מסלולים.
- מסייע בתיקוף מטרות באמצעות הערכה ישירה של תגובות כבדיות.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מספק hepatocytes בעלי חיוניות גבוהה ובסטנדרט אחיד עבור בדיקות in vitro הדירות.
- מאפשר הערכה כמותית של השפעות תרכובות על נקודות קצה ספציפיות לכבד.
- תומך ביכולת הרחבה של הבדיקה ובשימוש חוזר בפלטפורמה על פני תוכניות גילוי שונות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מסנכרן ממצאים במבחנה (in vitro) עם הביולוגיה של כבד האדם לצורך פיתוח ביומרקרים תרגומיים.
- מגשר בין שלב הגילוי לאישור הפרה-קליני על ידי אפשור קבלת החלטות מותאמות סיכון בנוגע לקידום הפיתוח.
- מפחית נשירה בשלבים מאוחרים על ידי שיפור הביטחון החזוי (predictive confidence) בבטיחות וביעילות הכבדית.
שילוב תהליכי עבודה וקוים (Pipeline & Workflow Integration)
שיטה זו לבידוד הפטוכטים משתלבת ברצף שבין השלב הגילוי לשלב הפרה-קליני, ומאפשרת מידול in vitro חזק ומחקרי תרגומיים המשכיים.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת השערות ובבירור מסלולים בתאי כבד אנושיים.
- סריקה: מספק תוצאות כמותיות הניתנות לשחזור לצורך הערכת תרכובות.
- אנליטיקה: מספק מדדי חיוניות, תפוקה וטוהר כדי להשוות את איכות הניסוי לרף ביצועים.
- מחקר תרגומי: מסייע בסנכרון ביומרקרים ובהמשכיות בין מחקרי in vitro למחקרי in vivo.
- שימוש חוזר ארגוני: קובע פרוטוקול סטנדרטי הניתן להתאמה בין מודלים שונים של כבד וצוותי מחקר.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית במחקרים כבדיים.
- ערך תפעולי: משפר את הסטנדרטיזציה, השחזוריות והניתנות להרחבה של תהליכי עבודה המבוססים על הפטוציטים.
- ערך אסטרטגי: משפר את איכות קבלת ההחלטות של go/no-go ואת יעילות ההון על ידי מתן אפשרות להפחתת סיכונים מוקדמת.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכונים ובקידום של תוכניות המכוונות לכבד.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות טכנית בקנולציה ופרפוזיה של רקמת כבד.
- נדרשת גישה למכשור אנליטי ולמכשור פרפוזיה ייעודי.
- נדרש תיאום וסטנדרטיזציה בין צוותים להבטחת בידוד תאים בר-שחזור ובקרת איכות.
- ניתן להתאים את הפרוטוקול למינים שונים בעלי כבד או כלי דם בגדלים דומים, כפי שמתומן בפרוטוקול.
- התוצאות תלויות באיכות הרקמה ובתזמון מדויק של תהליך העיכול לאופטימיזציה של התפוקה והחיוניות.
