הדפסת תבניות היפוך Thermoresponsive ליצירת בדוגמת הידרוג דו רכיבים-תרבות תאי 3D

המטרה הכוללת של הליך זה היא להדפיס תבנית הפוכה ליצירת הידרוג'לים דו-רכיביים בדוגמת תרבית תאים תלת מימדית. זה מושג על ידי הדפסה ראשונה של תבנית הפוכה מפולימר תרמו הפיך, שהוא נוזל בארבע מעלות צלזיוס, אך ג'ל רך בטמפרטורת החדר. מאוחר יותר ניתן לחמוק מהתבנית ההפוכה הזו.

השלב השני הוא למלא את התבנית ההפוכה בביופולימר לבחירה. כאן השתמשנו ב-aros. ניתן לקשר את הביופולימר על ידי קישור צולב אנזימטי, UV או טמפרטורה.

לאחר מכן, התבנית ההפוכה נרמזת על ידי טבילת התבנית במים קרים. לאחר שלב זה, תבנית ה- AROS המתקבלת מוכנה להמשך עיבוד. השלב האחרון הוא למלא את החללים בביופולימר שני, שיכול להכיל תאים וניתן לקשר אותו באמצעות אנזימים, אור UV או טמפרטורה.

בסופו של דבר, הקמנו שיטה הניתנת לשחזור ליצירת פיגומים מאורגנים מרחבית לתרבית תאי D. הרעיון לשיטה זו עלה לראשונה כאשר עמית הציע שנוכל לנצל את התכונות התרמו-רספונסיביות של Oxr על ידי שימוש בו כתבנית קורבן. מי שידגים את ההליך יהיה מישה מואה, סטודנט לתואר שני מהמעבדה שלי.

כדי להתחיל, הוסף 60 מיליליטר תמיסת PBS קרה כקרח לבקבוק זכוכית וערבב במרץ באמצעות ערבוב מגנטי. לאחר מכן שקלו 24.5 גרם של Paul ER והוסיפו אותו בכמויות קטנות ל-PBS הקר. המתן עד שה-Paul Oxr יתמוסס חלקית ב-PBS לפני שתוסיף עוד.

המשיכו לערבב את התמיסה עד שכל Paul Oxr נמס. לאחר מכן, הוסף PBS קר כקרח נוסף עד שמגיעים לנפח סופי של 100 מיליליטר, מה שמייצר ריכוז סופי של 24.5% משקל לנפח. לאחר מכן מערבבים את התערובת עד שהיא מעורבבת היטב.

הפסיקו לערבב את התמיסה ותנו לה לנוח על ארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה עד שהבועות והקצף בתמיסה נעלמו. בועות שנלכדות בתוך הג'ל מועברות למחסנית המדפסת ויובילו לפגמים בתבניות ההקרבה המודפסות. סטרילי סנן את התמיסה ישירות לתוך מחסנית ההדפסה באמצעות מסנן קירור מראש כדי להסיר חלקיקים לא רצויים שעלולים לסתום את המחט.

אחסן את המחסנית בארבע מעלות צלזיוס עד 30 דקות לפני הניסוי. הכן את שסתום הסולנואיד והמחט להדפסה על ידי הנחתם בצינורות מיקרו צנטריפוגה נפרדים של 1.5 מיליליטר מלאים במים טהורים במיוחד וסינדיקציה שלהם למשך 30 דקות. לאחר מכן שוטפים את השסתומים הנקיים באתנול ומייבשים אותם בעזרת אקדח חנקן.

לאחר מכן, התקן את שסתום הסולנואיד הנקי והמחט במדפסת. כמו כן, התקן מיכל דיו נקי ריק כדי לבדוק את המערכת. הפעל לחץ של שלושה בר על המערכת ופוצץ את כל הנוזלים שנותרו מהשסתום והמחט המותקנים באוויר דחוס.

לקוטר מחט קטן. התקן פילטר ביציאת האוויר הדחוס כדי למנוע כניסה של חלקיקים קטנים שעלולים לסתום את המחט. ואז כבה את הלחץ.

כאשר הלחץ ירד לאפס, התקן את המחסנית הטעונה מראש בפולי אוקסר יש להוציא את המחסנית מהמקרר כ-30 דקות לפני הרכבת המחסנית כדי שהפולי אוקסר הנוזלי עדיין יוכל להגיע לטמפרטורת החדר ולג'ל לפני ההדפסה. בדוק אם הפולי אוקסר צועק על ידי היפוך המחסנית.

לאחר מכן, הפעל שלושה מוטות לחץ על המערכת והוציאו את פול אמר, עד שהוא מגיע לקצה המחט ויוצא בגדיל רציף. באמצעות תוכנת ה-bio CAD, צייר קו בודד באורך זהה למבנה שבכוונתך להדפיס בתפריט הגדרות תוכנת המדפסת. הגדר את שסתום הסולנואיד לתדר גבוה של 50 הרץ בקטע הפרמטר וכוון ידנית את הגדרת הלחץ הגבוה לשלושה בר.

לאחר מכן, הגדר מיקרוסקופ זכוכית, החלק פנימה את המדפסת ואבטח אותה למקומה על ידי הפעלת הוואקום. לאחר מכן הדפס שכבה אחת של קו בודד במהירות שלב של 300 מילימטרים לדקה. השג את רוחב הקו הרצוי על ידי הפחתת הלחץ ביד והגדרות התדר בתוכנה עבור כל קו חדש, וודא שהקו נשאר רציף.

אם הקו ששורטט נשבר, הגבול התחתון הושג. לאחר השגת קו רציף ברוחב הרצוי, קבע את מהירות השלב האופטימלית ועובי השכבה על ידי בדיקת פגמים במבנים המודפסים. על מנת לכוונן את עובי השכבה, ייתכן שיהיה צורך להתאים מעט את הלחץ והתדירות.

על מנת לבדוק את הגדרת עובי השכבה, הדפיסו מספר שכבות זו על גבי זו וצפו כדי לוודא שהמחט נמצאת במיקום הנכון מעל השכבה הקודמת. התאם את עובי השכבה כך שכל שכבה תודפס ישירות על גבי הקודמת. כדי לייעל את מהירות הבמה התחל בהפחתת מהירות ה-stage מ-300 מילימטר לדקה צעד צעד כך שהשכבות המוחצנות מתחילות ומסתיימות באותם מיקומים כמו הקודמות.

אם הבמה זזה מהר מדי, תופיע תבנית דמוית גל בחלק העליון של השכבה. להדפסת מבני עמודים, צייר נקודה בודדת במקום קו בתוכנת ה-CAD. לאחר מכן כוונן את הלחץ והתדירות כדי לווסת את עובי השכבה וקוטר העמוד ואת זמן הצעד של ראש ההדפסה כדי למקסם את מהירות ההדפסה.

לאחר האופטימיזציה, שמור את הפרמטרים לשימוש מאוחר יותר. ראשית, הדפיסו את המבנה הפנימי כמו מערך העמודים הזה על שקופית מיקרוסקופ זכוכית ותנו לו להתייבש. ייבוש לילה מקטין את גודל ועובי המבנים ומספק הידבקות טובה יותר בין המבנה למצע.

למחרת, ציירו מבנה המורכב מקיר חיצוני המקיף את המבנים שאתם מתכוונים לחמוק מהם ומילאתם. יש להדפיס את קיר הפולימר במרחק של לפחות 3.5 מילימטרים מהמבנים הפנימיים בשל מידות המחט. לאחר מכן, הכינו תערובת של 1% במים נטולי יונים על ידי חימום במיקרוגל לאחר המסה מלאה.

מצננים את תמיסת האגרו בין 35 ל -45 מעלות צלזיוס. לאחר מכן מלאו את תבנית הקורבן בתמיסת האגרו בעזרת פיפטה. יש לעשות זאת לאט כדי למנוע הרס של המבנה בתוך הקיר.

לאחר המילוי, מניחים את התבנית על ארבע מעלות צלזיוס כדי למצק את הג'ל. לאחר כ-10 דקות, הוציאו את הג'ל מהמקרר והניחו אותו באמבט קרח למשך 10 דקות כדי להפיג את מבנה הפולימר. לאחר מכן הסר את המבנה בזהירות והסר שאריות מים על ידי ספיגתו ברקמת נייר.

לחץ את המבנה בזהירות על שקופית מיקרוסקופ זכוכית חדשה כדי ליצור אטימה טובה המונעת דליפה של ההידרוג'ל השלישי. לאחר מכן, הכינו תמיסה של 1% של אלגינט מתאקרילט בנתרן כלורי 0.15 מולרי. מערבולת את התמיסה להמסת האלגינט מתאקרילט.

לאחר מכן הוסף 2.5% נפח לנפח. אלקסה, 4 88 פיברינוגן מצומד, ו-0.05% משקל לנפח. ליתיום פניל 2 4 6 טרימתיל בנזואיל פוספט להשגת הידרוג'ל שלישי שניתן לדמיין בקלות באמצעות פלואורסצנטיות.

הכנס תמיסה זו למזרק של 0.3 מיליליטר המצויד במחט בגודל 30. לאחר מכן השתמש במזרק כדי למלא את החללים שהותיר הפולימר החמקמק. הקפד למלא לחלוטין כל עמודה על ידי הוצאת הפולימר כאשר המחט נשאבת מכל עמודה.

לבסוף, צילמו את הפולימר המוזרק עם מנורת UV בעוצמה גבוהה למשך חמש דקות, ולאחר מכן דמו את המבנה באמצעות מיקרוסקופ אפי פלואורסצנטי, או מיקרוסקופ קונפוקלי. מוצג כאן שחזור תלת מימד של זאק של מבנה דומה לזה שזה עתה יוצר, האלגינט המסומן בפלואורסצנט המשמש למילוי חוזר. צורות העמודים מופיעות כעמודות ירוקות והחלק החיצוני של המבנה שקוף.

הטכניקות המוצגות בסרטון זה ניתנות להתאמה נרחבת לסידורים תלת-ממדיים רבים ושונים, כגון המעגלים הקונצנטריים המוצגים כאן. הרזולוציה תלויה בקוטר המחט. המחט בקוטר 150 מיקרון המשמשת לעיצוב זה יכולה לייצר גדילים בקוטר שבין 120 ל-200 מיקרון.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב את השלבים הכרוכים בהדפסת oxr. הדגמנו את השימוש באוקסר כתבנית קורבן ליצירת הידרוג'לים דפוסיים, אך ניתן לייצב את האוקסר גם ב-UV אם משתמשים בגרסה הקשורה לייצור של הפולימר.