Name: הר שלם ברזולוציה גבוהה באתרו הכלאה בתוך עוברי דג הזברה לחקר ביטוי גנים ותפקוד (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-19T18:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 6 s
Description: חקור ביטוי גנים מרחבי וזמני בעוברי דג זברה באמצעות הכלאה בתוך הר שלם ברזולוציה גבוהה. הפרוטוקול משפר את זיהוי תעתיקים נדירים ומפחית רעשי רקע לניתוח מדויק של תפקוד גנים בהתפתחות חולייתנים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol><li>Lieschke, G. J., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+human+disease%3A+zebrafish+swim+into+view%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Animal models of human disease: zebrafish swim into view.</a> Nat. Rev. Genet. 8, 353-367 (2007).</li>
<li>Wolman, M., Granato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+genetics+in+larval+zebrafish%3A+learning+from+the+young%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Behavioral genetics in larval zebrafish: learning from the young.</a> Dev. Neurobiol. 72, 366-372 (2010).</li>
<li>Lawson, N. D., Wolfe, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forward+and+reverse+genetic+approaches+for+the+analysis+of+vertebrate+development+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Forward and reverse genetic approaches for the analysis of vertebrate development in the zebrafish.</a> Dev. Cell. 21, 48-64 (2011).</li>
<li>Arkhipova, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+regulation+of+the+hb9%2Fmnx1+beta-cell+progenitor+specific+enhancer+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Characterization and regulation of the hb9/mnx1 beta-cell progenitor specific enhancer in zebrafish.</a> Dev. Biol. 365, 290-302 (2012).</li>
<li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).</li>
<li>Chitramuthu, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+cloning+and+embryonic+expression+of+zebrafish+PCSK5+co-orthologues%3A+functional+assessment+during+lateral+line+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Molecular cloning and embryonic expression of zebrafish PCSK5 co-orthologues: functional assessment during lateral line development.</a> Dev. Dyn. 239, 2933-2946 (2010).</li>
<li>Liao, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SCL%2FTal-1+transcription+factor+acts+downstream+of+cloche+to+specify+hematopoietic+and+vascular+progenitors+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">SCL/Tal-1 transcription factor acts downstream of cloche to specify hematopoietic and vascular progenitors in zebrafish.</a> Genes Dev. 12, 621-626 (1998).</li>
<li>Stainier, D. Y., Weinstein, B. M., Detrich, H. W. 3rd, Zon, L. I., Fishman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloche%2C+an+early+acting+zebrafish+gene%2C+is+required+by+both+the+endothelial+and+hematopoietic+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cloche, an early acting zebrafish gene, is required by both the endothelial and hematopoietic lineages.</a> Development. 121, 3141-3150 (1995).</li>
<li>Detrich, H. W. 3rd, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraembryonic+hematopoietic+cell+migration+during+vertebrate+development%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Intraembryonic hematopoietic cell migration during vertebrate development.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 10713-10717 (1995).</li>
<li>Liao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+gene+cloche+acts+upstream+of+a+flk-1+homologue+to+regulate+endothelial+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The zebrafish gene cloche acts upstream of a flk-1 homologue to regulate endothelial cell differentiation.</a> Development. , 124-381 (1997).</li>
<li>Krauss, S., Concordet, J. P., Ingham, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functionally+conserved+homolog+of+the+Drosophila+segment+polarity+gene+hh+is+expressed+in+tissues+with+polarizing+activity+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A functionally conserved homolog of the Drosophila segment polarity gene hh is expressed in tissues with polarizing activity in zebrafish embryos.</a> Cell. 75, 1431-1444 (1993).</li>
<li>Akimenko, M. A., Ekker, M., Wegner, J., Lin, W., Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+expression+of+three+zebrafish+genes+related+to+distal-less%3A+part+of+a+homeobox+gene+code+for+the+head%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Combinatorial expression of three zebrafish genes related to distal-less: part of a homeobox gene code for the head.</a> J. Neurosci. 14, 3475-3486 (1994).</li>
<li>Alexander, J., Rothenberg, M., Henry, G. L., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((casanova+plays+an+early+and+essential+role+in+endoderm+formation+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">casanova plays an early and essential role in endoderm formation in zebrafish.</a> Dev. Biol. 215, 343-357 (1999).</li>
<li>Milewski, W. M., Duguay, S. J., Chan, S. J., Steiner, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conservation+of+PDX-1+structure%2C+function%2C+and+expression+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Conservation of PDX-1 structure, function, and expression in zebrafish.</a> Endocrinology. 139, 1440-1449 (1998).</li>
<li>Argenton, F., Walker, M. D., Colombo, L., Bortolussi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+characterization+of+the+trout+insulin+promoter%3A+implications+for+fish+as+a+favorable+model+of+pancreas+development%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Functional characterization of the trout insulin promoter: implications for fish as a favorable model of pancreas development.</a> FEBS Lett. 407, 191-196 (1997).</li>
<li>Biemar, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreas+development+in+zebrafish%3A+early+dispersed+appearance+of+endocrine+hormone+expressing+cells+and+their+convergence+to+form+the+definitive+islet%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Pancreas development in zebrafish: early dispersed appearance of endocrine hormone expressing cells and their convergence to form the definitive islet.</a> Dev. Biol. 230, 189-203 (2001).</li>
<li>Thisse, C., Thisse, B., Schilling, T. F., Postlethwait, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+zebrafish+snail1+gene+and+its+expression+in+wild-type%2C+spadetail+and+no+tail+mutant+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Structure of the zebrafish snail1 gene and its expression in wild-type, spadetail and no tail mutant embryos.</a> Development. 119, 1203-1215 (1993).</li>
<li>Cadieux, B., Chitramuthu, B. P., Baranowski, D., Bennett, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+progranulin+gene+family+and+antisense+transcripts%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">The zebrafish progranulin gene family and antisense transcripts.</a> BMC Genomics. 6, 156(2005).</li>
<li>Chitramuthu, B. P., Bennett, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+zebrafish+and+knockdown+technology+to+define+proprotein+convertase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Use of zebrafish and knockdown technology to define proprotein convertase activity.</a> Methods Mol. Biol. 768, 273-296 (2011).</li>
<li>Thisse, C., Thisse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+in+situ+hybridization+on+whole-mount+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">High resolution in situ hybridization on whole-mount zebrafish embryo.</a> Nat. Protoc. 3, 59-69 (2008).</li>
</ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

פיתחנו שיטות משופרות כדי להמחיש RNA עם רזולוציה גבוהה. בנהלי הכלאה באתר מתבצעים באמצעות סלי מחוייט פשוטים עם תחתית נקבובית (איור 1). עוברים מעובדים פתרונות RNase ללא שימוש בצלחות 6 גם בטמפרטורת חדר בתנאים סטריליים. סלי עוברים להפריד עשויים מצינורות Eppendorf בצבעים שונים. סלסלות עם או בלי שפה משמשות להתמצאות קלה ולזהות את העוברים בתוך הסל כמקביל לבדיקה מסוימת. <p class="jove...

דג הזברה (Danio rerio) התפתחה כמודל חיה רב עוצמה לפיתוח המחקר של החולייתנים, מחלות, התנהגות, ובשימוש בסמים ההקרנה 1-3. ניתן להשיג עוברי דג הזברה במספרים גדולים ממעבר אחד. הפריה והתפתחות מתרחשת ברחם לשעבר ואת העוברים הברורים אופטי לפתח במהירות. אירועי התפתחות קריטיים מתרחשים במהלך 48 שעות הראשונה לאחר ההפריה (hpf). זה כולל את המראה של האיבר primordia וייזום של cytodifferentiation. ניתן להשיג מציאה או על ביטוי של חלבונים באמצעות microinjection של עוברים עם antisense morpholino (MO) oligonucleotides או mRNA בהתאמה בשלב תא אחד או שניים (0.75 hpf). משאלתו של עוברי דג הזברה מאפשרת המחקר של ביטוי מרחב ובזמן של גנים ספציפיים של עניין. יישום של טכניקת המאחלים בעקבות microinjection של עוברים עם mRNA או MO ליותר מ-exprESS או רמות חלבון ספציפיות מציאה מגלה רגולציה ההפרש של גנים אחרים. שינויים בדפוסי ביטוי גנים יכולים להיות מתואמים עם שינויים פנוטיפי ולחשוף את הפונקציה של גני המטרה במהלך organogenesis מוקדם. מאז ניתן להכין בדיקות ומאוחסנות מראש, ניתן ליישם את טכניקת ש כדי לחשוף דפוסי ביטוי גנים לפחות 20 גנים בכל פעם, באמצעות צלחות שש היטב וסלים בהתאמה אישיות.

<table><tbody>ערכת שיבוט <tr><td>Taq Polymerase</td><td>Invitrogen</td><td>10342053</td><td></td></tr><tr><td>TopoTA- מקדם כפול pCRII-TOPO</td><td>Invitrogen</td><td>K4650-01</td><td></td></tr><tr><td>HQ מיני ערכת טיהור פלסמיד</td><td>Invitrogen</td><td>K2100-01</td><td></td></tr><tr><td>אגרוז</td><td>רוש</td><td>11 685 660 001</td><td></td></tr><tr><td>Not1 ואנזימי הגבלה HindIII</td><td>Invitrogen</td><td>15441-025, 15207-012</td><td></td></tr><tr><td>פנול רווי Buffer,</td><td>Invitrogen</td><td>15513039</td> טהור במיוחד <td>יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. יש לנקוט בזהירות בזמן הטיפול.</td></tr><tr><td>כלורופורם</td><td>פישר</td><td>C607-1</td><td>רעיל וחשוד כמסרטן. עבוד מתחת למכסה המנוע.</td></tr><tr><td>DNAse ללא RNase I</td><td>Roche</td><td>4716728001</td><td>הכן מנות קטנות ואחסן בטמפרטורה של -20&deg;C.</td></tr><tr><td>תערובת תיוג DIG-RNA עם Sp6, T7 ו- T3 RNA פולימראז</td><td>רוש</td><td>11277073910</td><td></td></tr><tr><td>מעכב RNase</td><td>Roche</td><td>10777-019</td><td></td></tr><tr><td>3.0 M נתרן אצטט (pH 5.5)</td> <td>פישר</td><td>50-751-7355</td><td></td></tr><tr><td>100% אלכוהול</td><td></td><td></td><td>אתנול אלכוהול מסחרי</td></tr><tr><td>דיאתיל פירוקרבונט (DEPC)</td> <td>סיגמא</td><td>40718-25 מ"ל</td><td>DEPC הוא מגרה עיניים, עור ונשימה. יש להימנע ממגע עם העור והעיניים. השתמש במשקפי בטיחות, כפפות ומסכה.</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Fisher</td><td>SS255-1</td><td></td></tr><tr><td>EDTA 0.5 M (pH 8.0)</td><td>Fisher</td><td>50-751-7404</td><td></td></tr><tr><td>מערכות אקווריום</td><td>מלח אוקיינוס מיידי</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>מי מלח חוצץ פוספט (PBS)</td><td>Fisher</td><td>FL-03-0900</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA)</td><td>Sigma</td><td>P6148-1KG</td><td>מכינים ומאחסנים בטמפרטורה של -20&deg; C כ-40 מ"ל אליקוטים לשימוש מאוחר יותר. PFA רעיל. השתמש במשקפי בטיחות, כפפות ומסכת אבק.</td></tr><tr><td>פנילתיוקרבומיד (PTC)</td><td>Sigma</td><td>P7629-25G</td><td>PTC רעיל מאוד. השתמש במשקפי בטיחות, כפפות ומסכת אבק.</td></tr><tr><td>מתנול</td><td>פישר</td><td>A947-4</td><td></td></tr><tr><td>דומונט (שען' s) דפוס מלקחיים מס '5</td> כלי <td></td><td></td><td>מדע עדינים</td></tr><tr><td>אשכול תרבית תאים בעל שש בארות</td><td>Sarstedt</td><td>83.1839</td><td></td></tr><tr><td>סלים עשויים רשת ניילון וצינורות אפנדורף</td><td>הכנה</td><td></td> פנימית <td>להכנת הסלים, חותכים צינורות אפנדורף (1.5 מ"ל) עם או בלי חישוקים כדי להסיר את הקצה החרוטי. חותכים רשת ניילון לחתיכות קטנות המתאימות לגודל של&nbsp; הקצוות החתוכים של צינורות אפנדורף. מניחים צינורות עם רשת הניילון המכסה את הקצה החתוך על חשמל&nbsp; פלטה חמה עד שגם הצינור וגם רשת הניילון נדבקים זה לזה (מבצעים במכסה אדים). חותכים את עודפי הרשת מהסלים ומאחסנים אותם ב-100% מתנול עד לשימוש.</td></tr><tr><td>פוליאוקסיאתילנסאורטן מונולאורט (Tween 20)</td><td>Sigma</td><td>P1379-500ML</td><td></td></tr><tr><td>פרוטאינאז K</td><td>Fermentas</td><td>EO0491</td><td></td></tr><tr><td>אצטי אנהידריד</td><td>סיגמא</td><td>242845</td><td></td></tr><tr><td>טריאתנולאמין</td><td>סיגמא</td><td>90279-100ML</td><td></td></tr><tr><td>פורממיד, דרגת טוהר גבוהה</td><td>Sigma</td><td>F9037</td><td></td></tr><tr><td>AG501-X8 שרף</td><td>Bio Rad</td><td>142-6424</td><td></td></tr><tr><td>חומצת לימון מונוהידראט</td><td>סיגמא</td><td>C0706-500G</td><td></td></tr><tr><td>מלח נתרן</td><td>הפרין סיגמא</td><td>H3393-25KU</td><td></td></tr><tr><td>חוצץ מלח-נתרן ציטראט (SSC)</td> <td>Sigma</td><td>S6639</td><td></td></tr><tr><td>tRNA משמרי אופים מסוג X</td><td>Sigma</td><td>R5636-1ML</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>S640-500</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Fisher</td><td>BP153-1</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Fisher</td><td>S25403</td><td></td></tr><tr><td>Levamisole Hydrochloride</td><td>Sigma</td><td>31742</td><td></td></tr><tr><td>N,N-Dimethylformamide נטול מים (DMF)</td><td>Sigma</td><td>227056</td><td>מגרה, רעיל, דליק וחשוד לטרטוגן. טפל בלבוש בטיחות מתאים כולל כפפות ומשקפי מגן.</td></tr><tr><td>5-Bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate (BCIP)</td><td>Sigma</td><td>N6639</td><td>הגן על תמיסה זו מפני אור.</td></tr><tr><td>Nitroblue tetrazolium (NBT)</td><td>Sigma</td><td>840W</td><td>הגן על תמיסה זו מפני אור.</td></tr><tr><td>אלבומין מסרום בקר, שבר מטוהר V (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A8806</td><td></td></tr><tr><td>כבשים אנטי-דיגוקסיגנין-AP שברי פאב</td><td>רוש</td><td>1093274910</td><td></td></tr><tr><td>גליצרול</td><td>סיגמא</td><td>G5516-500ML</td><td></td></tr><tr><td>96 בארות צלחות תרבית תאים</td><td>Sarstedt</td><td>83.1835</td><td></td></tr><tr><td>Tg(mnx1:GFP)ml2/Tg(hb9:GFP)ml2</td><td>ZIRC</td><td>Tg(mnx1:GFP)ml2</td><td></td></tr><tr><td>מערכות אקווריום</td> <td>אוקיינוס מיידי</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

הר שלם ברזולוציה גבוהה<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה בתוך עוברי דג הזברה לחקר ביטוי גנים ותפקוד

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

מאמר זה מתמקד בכל הר הכלאה באתרו (לוואי) של עוברי דג הזברה. הטכנולוגיה מאפשרת מאחלי ההערכה של ביטוי גנים הן במונחים של חלוקת רקמה ושלב התפתחותי. פרוטוקולים מתוארים לשימוש ברצון של עוברי דג הזברה באמצעות בדיקות RNA antisense שכותרתו עם digoxigenin. בדיקות נוצרות על ידי שילוב של נוקלאוטידים digoxigenin צמודים באמצעות שעתוק במבחנה של תבניות גנטיות שכבר משובטות ולינארית. את chorions של עוברים שנקטפו בשלבי התפתחות הוגדרו יוסרו לפני דגירה עם בדיקות ספציפיות. בעקבות הליך כביסה כדי להסיר את החללית עודפת, עוברים מודגרת עם נוגדן אנטי digoxigenin מצומדות עם phosphatase אלקליין. על ידי שימוש במצע chromogenic לphosphatase אלקליין, ניתן להעריך ביטוי ספציפי גן. בהתאם לרמה של ביטוי גני ההליך כולו יכול להסתיים תוך 2-3 ימים.

באמצעות הפרוטוקול עם 50 עוברים לסל (לגן / לתנאי ניסוי) דפוס הביטוי של גן שניתן להשיג בניסוי אחד. כמעט כל העוברים מראים דפוסי ביטוי דומים לגן מסוים. דוגמאות מייצגות של במכתים הכלאה באתר מוצגות איורים 3-6. riboprobes השכל ונגד התחושה היו מסונתז מcDNAs המתאים לPC5.1, PC5.2 6, 7, 8,9 SCL/tal-1 Gata-1, FLK / kdrl 10, 11 שש, dlx2 12, fkd7 / Foxa1 ...

דג הזברה, דגים טרופיים קטנים, הפכה לדגם פופולרי ללימוד תפקוד גן במהלך התפתחות מחלה וחוליות. הביטוי של הזמן ומרחב של גני המטרה יכול להיקבע על ידי<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה. הפרוטוקול המשופר שלנו מאפשר זיהוי של תמלילי שפע נמוכים עם אות רקע הלא ספציפית נמוכה.

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא להעריך את הביטוי המרחבי הזמני של גנים ספציפיים בעלי עניין בתוך עוברי דג זברה בשלבים. זה מושג על ידי יצירת בדיקות CD NA לראשונה על ידי שילוב חמצן דיגו בנוקלאוטידים מקושרים באמצעות שעתוק במבחנה. לאחר מכן, העוברים נקצרים בשלבי התפתחות מוגדרים.הקוריום מוסר והעוברים מאוחסנים במתנול בטמפרטורה שלילית של 20 מעלות צלזיוס. לאחר מכן לאחר העיכול ולאחר הקיבוע, העוברים מוכלאים עם הבדיקות המתאימות. לבסוף, העוברים מוכתמים בגן אנטיד ונוגדנים והאות מפותח עם מצעים לפוספטאז אלקליין.בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות המראות את התפלגות הרקמה של ביטוי גנים בשלב התפתחותי נתון באמצעות הכלאה והדמיה שלמה באתר. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות גדולות יותר לגבי הביטוי הנורמלי של גן המטרה, ניתן ליישם אותה גם במצבים אחרים כגון ביטוי גן מטרה במודל מחלה, וכאשר גנים אחרים באים לידי ביטוי יתר או חסר. שימוש בטכנולוגיית מיקרו-הזרקה באמצעות CDNA לגן מעניין, הגדר תגובת תיוג RNA לסינתזה של חמצן דיגו בבדיקות RNA מסומנות בבקבוקון תגובה חופשית של RNA על ידי הוספת 1 עד 5 מיקרוגרם של DNA תבנית מטוהר ל-RNA סטרילי ללא מים מזוקקים כפולים עד לנפח של 13 מיקרוליטר.מצננים את התגובה על קרח ומוסיפים את הריאגנטים הבאים לאחר ערבוב עדין של צנטריפוגה 2000 סל"ד למשך 30 שניות בטמפרטורת החדר לפני הדגירה של התגובה למשך שעתיים ב-37 מעלות צלזיוס לאחר הדגירה, הסר את ה-DNA של התבנית על ידי הוספת שני מיקרוליטרים של RNA חופשיים. DNA אחד דוגר במשך 30 דקות ב-37 מעלות צלזיוס ועוצר את התגובה על ידי הוספת שני מיקרוליטרים של 0.2 EDTA מולארי, מזרז את תוצרי התגובה על ידי הוספת 2.5 מיקרוליטר של ארבעה ליתיום כלוריד מולארי ו-75 מיקרוליטר של 100% אתנול. מערבבים את התמיסה ודוגרים בחום שלילי של 20 מעלות צלזיוס למשך 45 דקות או למשך הלילה.צנטריפוגה את המתלים למשך 30 דקות ב -13, 000 סל"ד וארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן שטפו את הגלולה בקור קרח, 70% אתנול לאחר סיבוב במשך 10 דקות. יבש את הגלולה במשך שתי דקות לפני החייאה, והשהה אותה ב-50 מיקרוליטר נוקלאז, מים מזוקקים כפולים חופשיים.ואז דגרו אותו למשך 30 דקות. בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, הפעל 1-2 מיקרוליטר של הגשושית על ג'ל 1%aros למשך כ-30 דקות כדי לוודא את איכותו ושלמותו. לאחר מכן השתמש בספקטרופוטומטר כדי לכמת את הגשושית כדי להחזיר לחות לעוברים קבועים ומוקפאים בעבר.התחל בהכנת סלים על ידי חיתוך הקצוות החרוטיים מצינורות מיקרו של 1.5 מיליליטר. ואז הסר את החישוקים העליונים ממחציתם. חותכים חתיכות קטנות של רשת ניילון כדי לכסות את הקצוות, ולאחר מכן בכמה מכסה מנוע, מחממים את קצוות הצינור על פלטה חשמלית ולוחצים אותם לרשת לאחר שהתקררו.הסר את רשת הניילון העודפת ואחסן את הסלים ב-100% מתנול בטמפרטורת החדר. לאחר הכנת דילול עוקב של מתנול ב-PBS, על פי פרוטוקול הטקסט והוספת ארבעה מיליליטר מכל אחד לבארות של צלחת שש בארות, הניחו עוברים בסלים בודדים לכל בדיקה ודגרו אותם בסדרת PBS מתנול למשך חמש דקות לכל באר והסתיימו בשלוש שטיפות ב-PBST. סלסול העוברים עם פרוטאינאז K בטמפרטורת החדר, תוך שימוש בזמני הדגירה הבאים לכל שלב התפתחותי.לאחר מכן מקבעים את העוברים ב-4% אלדהיד פרפורמי ב-PBS למשך 20 דקות ושוטפים אותם ב-PBST שלוש פעמים למשך חמש דקות כל אחד. לאחר מכן, הכינו את תערובת האצטילציה על פי פרוטוקול הטקסט ודגרו על העוברים פעמיים למשך 10 דקות כל אחד. לאחר מכן שטפו את העוברים ואת PBST פעמיים למשך 10 דקות כל אחד.העבירו את העוברים לצינורות מיקרו סטריליים ודגרו עם 200 מיקרוליטר של תערובת הכלאה או HM, באמבט מים של 70 מעלות צלזיוס למשך שעתיים עד ארבע שעות. הוסף לתמיסה 100 עד 200 ננוגרם של בדיקה ודגירה למשך הלילה בטמפרטורה של 70 מעלות צלזיוס באמבט מים. החלף את תמיסת הבדיקה ב-HM מחומם מראש ודגר את הדגימות ב-70 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.לאחר הכנסת הדגימות דרך סדרת H-M-S-S-C וחסימת העוברים על פי פרוטוקול הטקסט, דגרו את העוברים בדילול של 1 עד 5,000 של נוגדן אנטי-D AP בחסימת חיץ למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס עם תסיסה עדינה למחרת. שטפו את העוברים שש פעמים למשך 15 דקות כל אחד. לאחר צביעת העוברים, דגרו אותם ב-BCIP ו-NBT.מוסיפים את טמפרטורת החדר בחושך למשך 30 דקות. השתמש במיקרוסקופ סטריאו כדי לעקוב אחר תגובת הצביעה כל 30 דקות כדי לעצור את התגובה. העבירו את סלי העוברים לבארות המכילות תמיסת עצירה פעמיים למשך 10 דקות כל אחת עם תסיסה עדינה.לאחר קיבוע העוברים עם 4%para formaldehyde ב-PBS למשך 20 דקות. הרכיבו את העוברים על ידי העברתם בכמה שפחות PBS לשש צלחות באר המכילות 100% גליצרול. נדנד בעדינות את העוברים בחושך בטמפרטורת החדר, תמונה לילה ב-100% גליצרול תחת מיקרוסקופ סטריאו.דוגמאות מייצגות של צביעה באתרו להכלאה מוצגות כאן. צביעה סגולה שנצפתה לאחר הכלאה עם בדיקת ריבו מעניינת מייצגת הן את השפע והן את אתרי הביטוי של גן מסוים. לדוגמה, PC 5.1 מראה ביטוי דיסקרטי מאוד בתוך החלק הקדמי והאחורי של השלפוחית האוטית והקו הצדדי הראשוני ב-24 שעות לאחר ההפריה והוא ממוקם חזק בתוך התרנים העצביים של הקו הצדדי הקדמי והאחורי עד 72 שעות לאחר ההפריה.לעומת זאת, PC 5.2 מראה לך ביטוי בכל מקום בתוך מערכת העצבים המרכזית עם אזוריות מובהקת בתוך שלפוחית האוטי של הסומיטים וצינור ה-fric הנוטה לשימוש, והוא מתבטא מאוד בכבד ובמעי ב-96 שעות לאחר ההפריה. היעדר ביטוי גנים בעת שימוש בבדיקות Ribo בהתאמה משמש כבקרה שלילית כפי שניתן לראות כאן. ניתוחי ביטוי של סמני דם הראו צביעה של SCL T אחד בתוך תאי הגולגולת הדו-צדדיים ובמסת תאי הביניים או ICM.למרות שהכתמים של gata one נראים גם בתוך ה-ICM, דפוס הביטוי שונה. הביטוי של F-L-K-K-D-R-L נצפה בתוך כלי הדם הראשיים והבין-סגמנטליים של המוח האחורי, וב-ICM נצפתה צביעה לקיפוד קולי ב-no cord. בדוגמאות אלה ביטוי של DLX 2 ב-34 שעות לאחר ההפריה ממוקם בקשתות Talon Cephalon hypothalamus ו-cranio mesenchymal וב-FK D seven Fox, ביטוי אחד ב-24 שעות לאחר ההפריה נראה בעיקר בצלחת הרצפה ובביטוי היפוכלור.דפוסים של סמני הלבלב הראו צביעת אינסולין בלבלב האנדוקריני וטריפסין בלבלב האקסוקריני. התוצאות המציגות דפוסי ביטוי ברזולוציה גבוהה מאשרות את הצלחת הפרוטוקול המתואר לזיהוי ביטוי של גנים בשפע גבוה ונמוך כאחד. להלן מספר דוגמאות מניסויים שבוצעו בתנאים אופטימליים מסוימים.לדוגמה, אות רקע גבוה עם ביטוי קיפוד קולי גרוע נבע מחוסר מספק, חדיר והכלאה בין 55 ל-60 מעלות צלזיוס. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבצע הרכבה שלמה בשתי הכלאות של עוברי דגי זברה באמצעות בדיקות RNA עם תווית תעלה, צביעה והדמיה לאחר הכלאה.

high-resolution-whole-mount-situ-hybridization-within-zebrafish

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

הר שלמים הכלאה באתרו היא אחת הטכניקות הנפוצה ביותר בביולוגיה התפתחותית. כאן, אנו מציגים ברזולוציה גבוהה פלורסנט כפול פרוטוקול הכלאה באתרו לניתוח דפוס הביטוי המדויק של גן יחיד לקביעת חפיפה של תחומים הביטוי של שני גנים. אנו כוללים propidium גרעיני יודיד נגד כתם להדגיש ארגון רקמות.

דג הזברה שלמים הר ברזולוציה גבוהה פעמיים פלורסנט באתרו הכלאה

שימוש הר שלם באתרו הכלאה קישור לביולוגיה מולקולרית האורגניזם

דרך מהירה לבצע immunostaining לב עוברי דג הזברה הוא תיאר. לעומת הגישה הר שלם immunostaining, שיטה זו מגדילה באופן דרמטי את החדירה של נוגדנים, אשר מאפשר קבלת תמונות ברזולוציה גבוהה החושפים מבנים הסלולר / subcellular בלב תוך זמן עיבוד מופחת בהרבה.

Immunostaining הלב גזור עוברי דג הזברה

עובר דג הזברה הוא מודל מצוין למחקר בביולוגיה התפתחותית. במהלך עובר, דג הזברה מתפתחת עם מסת חלמון, אשר מציבה אתגרים תלת ממדים לתצפית מדגם וניתוח. פרוטוקול זה מתאר כיצד ליצור הכנות הר שטוחות דו ממדים של הר שלם באתרם דגימות (לוואי) מוכתמות דג הזברה עובר.

הר הכנה שטוחה לתצפית וניתוח של עובר דג הזברה דוגמאות ויטראז בהר שלם<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה

טכניקות מתוארים כדי immunostain-אפיטופים phospho כולן עוברי דג הזברה ולאחר מכן לנהל לוקליזציה confocal ניאון בשני צבעים במבנים הסלולר קטן כמו cilia העיקרי. טכניקות לתיקון והדמיה יכול להגדיר את המיקום ואת קינטיקה של המראה או הפעלה של חלבונים ספציפיים.

Phospho-אפיטופים Immunostaining באיברים ריסי של עוברי דג הזברה שלמים הר

פיתוח cilia חיוני organogenesis נכונה. פרוטוקול זה מתאר שיטת אופטימיזציה תווית, דמיינו תאים ciliated של דג זברה.

להמחיש Multiciliated בתאים דג זברה באמצעות פרוטוקול משולב של פלורסנט הר שלמה בחיי עיר הכלאה, Immunofluorescence

טכנולוגיות לעריכת גנים אפשרו לחוקרים ליצור מוטציות דג זברה לחקור פונקציה גנטית בקלות יחסית. כאן, אנו מספקים מדריך לבצע היפוך העובר מקבילי וכימות של אותות היברידיזציה באתרו ב zebrafish. גישה זו לא משוחדת מספק דיוק גדול יותר בניתוחים פנוטיניים המבוססים על היברידיזציה באתרו.

כתמים וכימות של היברידיזציה באתרו בתוך דג זברה

מאמר זה מתאר שיטה לטעינת עוברי שברירי הדגים עבור מיקרוסקופ הזמן המורחבת הקפיצה הדקה. שיטה בעלות נמוכה זו קלה לביצוע באמצעות מנות מיקרוסקופית תחתית רגילות של זכוכית להדמיה בכל מיקרוסקופ הפוך. ההרכבה מבוצעת בשכבות של הצמח בריכוזים שונים.

שיטת הרכבה שכבתית עבור מיקרוסקופ זמן מורחב מיקרוסקופיה של כל העוברים דגים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור נוגדן הפלורסנט בתיווך זיהוי של חלבונים בהכנות שלמות של עוברי הדגים והזחלים.

כל הר אימונוהיסטוכימיה בזיבפיש עוברים וזחלים

דג הזברה הוא מודל חשוב להבנת התפתחות הכליות. כאן, פרוטוקול הכלאה במקום מותאם כדי לזהות ביטוי גנים בזחלי דגי זברה וצעירים במהלך פיתוח mesonephros.

בסיטו הכלאה בזחלי זברה וצעירים במהלך פיתוח מסונפרוס

פרוטוקול זה מתאר כיצד להשיג תמונות על ידי שילוב הכלאה באתרו ואימונוהיסטוכימיה של חלקים עובריים של דגי זברה. הכלאה באתרו בוצעה לפני הקפאה, ואחריה הכתמת נוגדנים. כדאי לזהות את דפוסי הביטוי של שני גנים בדגי זברה אם יש מיעוט נוגדנים.

ב Situ הכלאה בשילוב עם אימונוהיסטוכימיה בעוברי דגי זברה Cryosectioned

חקור ביטוי גנים מרחבי וזמני בעוברי דג זברה באמצעות הכלאה בתוך הר שלם ברזולוציה גבוהה. הפרוטוקול משפר את זיהוי תעתיקים נדירים ומפחית רעשי רקע לניתוח מדויק של תפקוד גנים בהתפתחות חולייתנים.

הר שלם ברזולוציה גבוהה

גלה סרטונים נוספים