Name: מבחני כדאיות לתאים בתרבית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-20T13:45:00.000+00:00
Duration: 12 min 3 s
Description: למדו לבצע מבחני כדאיות מרובים בתאים בתרבית באמצעות מדידת רמות ATP, צביעת חלבוני שלד תאי ודימות אינפרא-אדום. שיטה זו מספקת הערכה מקיפה של כושר תאי ופונקציה מטבולית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מכירים Juliann Jaumotte לרעיון של שמירה על הכרכים של חומרים כימיים בassay-ATP. אנחנו אסירי תודה לתמיכה ניהולית המעולה של מרי קארוזו, דב ווילסון וג&#39;קי Farrer ולבית הספר לרוקחות Mylan למתן תמיכה כספית למחקרים אלו. תודה גם למחלות Hunkele המפחיד הקרן ופרקינסון והפרעות תנועת קרן לתמיכה הכספית שלהם מהמחקרים עצביים העיקריים.

אף אחד מהמחברים יש התנגשויות לחשוף.

מצאנו כי עוצמת אות בכל שלושת מבחני הכדאיות היא ליניארי ומתואם עם צפיפות ציפוי. עם זאת, לא כל מבחני הם לא פחות רגישים לפי 2 או שינויים 1.5 פי בצפיפות ציפוי. לתאי N2a, מבחני אינפרא אדום רגישים פחות assay-ATP, במיוחד בצפיפויות ציפוי נמוכות יותר. למרות שמבחני אינפרא אדום רגישים פחות מאשר ה-ATP, מבחני DRAQ5 + ספיר ומבחני α-טובולין הם בהסכם טוב בכך שהם חושפים את ההשפעה המגנה ביותר של N-אצטיל ציסטאין. היה ירידה במינון תגובה של אות אינפרא אדום עם שני מבחני וכל שלוש עקומות הכדאיות הוזזו לי...

Assay הכדאיות הנפוץ ביותר במדעים הביולוגיים כרוך בספירת תאים. עדות לכך הוא על ידי ניתוח של 200 הפרסומים (האחרונים) העליונים שהופיעו בPubMed עם אחת ממילות המפתח &quot;במבחנה&quot; או &quot;תרבות&quot; ב2013/04/29 ו2013/4/30. פרסומים אלה, מבחני 23.5% משמשים ספירת תאים, כוללים ספירת מספר תאים ידנית, מספר תאים אוטומטי סופרים עם תוכנת הדמיה, והדרה כחולה Trypan. Assay חי / המלח שימש ב1% מפרסומים אלה. מספר הפרסומים באמצעות MTT (3 - (4,5-dimethylthiazol-2-י.ל.) ברומיד -2,5-diphenyltetrazolium) assay לכדאיות טבולים היה 11%. סקר זה של הספרות גם מראה כי מספר הפרסומים באמצעות מבחני כגון MTT בשיתוף עם מבחני ספירת תאים היה רק ​​.3.5%. למרות המגמה להשתמש assay כדאיות אחד בפני עצמו, הערכת תפקוד תאי בשילוב עם מספר תא נראית הבחירה הטובה ביותר להערכתי סלולריתntegrity. ספירת תאים על ידי עצמם אינן מספיקות, כי התאים שנותרו לא יכולים להיות פונקציונליים או בריאים, למרות שהם נמצאים בבאר 1,2. לעומת זאת, אמצעי פונקציונלי, כגון ATP עשוי להגדיל או להקטין בהיעדר שינויים מקבילים במספר התאים. שחרר את הסוגר של צגי בקרת חילוף חומרים ממספר התא עולה כי אף פעם לא צריכים לשמש מבחני ה-ATP וMTT כassay הכדאיות הבלעדי. בדו&quot;ח הנוכחי, שלושה מבחני כדאיות שיסקרו שני מבנים תאיים ותפקוד מטבולים מתוארים, לתמונה מקיפה יותר של יושרה סלולרית מכל assay אחד בפני עצמו יכול להרשות לעצמו. שניים מהמבחנים שלנו דורשים תרמי אינפרא אדום שמודדת הקרינה ב700 ו800 ערוצי ננומטר. רעש הוא נמוך באורכי הגל אינפרא אדום, מה שמוביל ליחסי אות לרעש גבוהים יותר 3. תרמי אודיסיאה שאנחנו משתמשים יש טווח דינמי 4.5 יומן וקצת מעמיקה של 16, translatinגרם ל2 16 או 65,536 גוונים של אינפרא אדום. זה יכול להיות בניגוד להדמיה בצבע של 8 ביט, אשר רק מאפשרת 2 8 או 256 גוונים של צבע לכל אורך גל. לפיכך, יש הדמיה 16 סיביות רזולוציה עדינה. יש לציין שהתמונות אינפרא אדומות המקוריות לעתים קרובות pseudocolored ירוק (800 ננומטר) ואדום (700 ננומטר) בדוחות שפורסמו למצגת. הדמית אודיסיאה משמשות בדרך כלל גם למערבי סופג ובתוך תא המערבונים 4-7. ב- Cell מערבונים על תאים קבוע פורמלדהיד להשתמש נוגדנים ראשוניים כנגד כל חלבון של עניין ולתייג אותם בתורו עם נוגדנים משני ניאון אינפרא אדום. טכניקה זו ידועה להיות שימושי במיוחד עבור נקודות קצה זירחון 6. ב- Cell המערבונים שלנו, אנחנו להכתים תאים קבועים לחלבוני cytoskeletal α-טובולין או microtubule העצבי החלבון קשור 2 (MAP2) בערוץ 800 ננומטר. חלבונים אלה נמצאים בשפע מספיק כדי להניב יחס אות לרעש גבוה. אנחנו גם להכתים הצלחות שלנו ב700ערוץ ננומטר לגרעינים עם כתם DRAQ5 ולציטופלסמה עם כתם ספיר. שני חלבוני cytoskeletal וDRAQ5 + כתמי ספיר ובכך משקפים את המבנים הסלולר. Assay הכדאיות השלישי מודד תפקוד מטבולים והוא נקרא &quot;תא כייל Glo&quot;. ב assay מבוסס לוציפראז זה, ערכי הארה הם ביחס ישירים לרמות ה-ATP. מבחני ה-ATP משמשים בדרך כלל כדי לכמת תאי קיימא 8-12. עם זאת, כולל את המילה &quot;כייל&quot; בשמו של assay הוא קצת מטעה, כי פלט ה-ATP לכל תא יכול להשתנות כפונקציה של טיפולי רעל ולכן הוא לא תמיד באופן יחסי לתא מספר 8. יכולות גם להיות מושפעות רמות ה-ATP על ידי מקצבי היממה 13 ועל ידי חלוקת תא ותא 14 בידול 15. אף על פי כן, assay-ATP שמוצג כאן הוא פשוט לביצוע ושימושי כי ה-ATP הוא מדד חזק של חילוף חומריםכדאיות 16-21, אם לא מספר סלולרי כשלעצמה. שימוש assay זה כדי להשלים את האינפרא אדום ב- Cell מערבונים לכן מניב תמונה מקיפה יותר של יושרה סלולרית מכל assay אחד בלבד.

<table><tbody><tr><td>טיטר תא Glo</td><td>Promega</td><td>G7572</td><td>קנה בכמויות של 100 מ"ל ומחיר, במקום לרכוש את הכמות היקרה יותר של 10 מ"ל. ניתן להקפיא מחדש ריאגנטים משוחזרים שאינם בשימוש ב-20 מעלות; C למשך 21 שבועות לפחות</td></tr><tr><td>18% פורמלין</td><td>תרמו-שנדון</td><td>9990244</td><td>קניית קיבוע זה מונעת שקילה של אבקות פורמלדהיד והרתחה של התמיסה; חשיפה לאדים ממוזערת בכך</td></tr><tr><td>סוכרוז</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>S0389</td><td>אין צורך להוסיף זאת לתמיסות פורמלדהיד אך זה משפר את מראה התאים הקבועים</td></tr><tr><td>Odyssey Block</td><td>LI-COR</td><td>927-40003</td><td>ניתן לקנות את סרום הדגים הזה בכמויות גדולות ולהקפיא בטמפרטורה של -20 מעלות; C לשימוש ארוך טווח</td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21568</td><td>אנו מאחסנים תמיסת מלאי של 10% Triton-X 100 במים סטריליים בטמפרטורה של 4 מעלות; C</td></tr><tr><td>נתרן פוספט מונוביסיק</td><td>פישר</td><td>S468</td><td>אפשר גם לקנות טבליות PBS או 10x פתרונות PBS, אבל הם יקרים יותר</td></tr><tr><td>נתרן פוספט דיבאסיק</td><td>פישר</td><td>S373</td><td>ראה לעיל</td></tr><tr><td>נתרן אזיד (250x)</td><td>Ricca Chemical Company</td><td>7144.8-16</td><td>אל תקנו את האבקה כי נתרן אזיד רעיל מאוד. אנו מאחסנים את כל הנוגדנים המשומשים שלנו ב-1x נתרן אזיד ב-4 מעלות; C עד שהם מזוהמים בפסולת</td></tr><tr><td>עכבר אנטי-אלפא;-טובולין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>T5168</td><td>נוגדן זה יקר אך ניתן לדלל אותו מאוד והוא ספציפי מאוד</td></tr> נוגדן <tr><td>עכבר אנטי-MAP2</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>M9942</td><td>נוגדן זה יקר אך הוא ספציפי ביותר (תנאי מוקדם למערבונים בתוך התא)</td></tr><tr><td>800 ננומטר עיזים נגד עכבר IgG</td><td>LI-COR</td><td>926-32210</td><td>חברות אחרות מוכרות גם נוגדנים משניים אינפרא אדום. הקפד לרכוש את הנוגדנים בעלי הספיגה הצולבת ושים לב שריכוזי ה-IgGs עשויים להשתנות בהתאם למקור</td></tr><tr><td>DRAQ5</td><td>Biostatus</td><td>DR50200</td><td>תרכובת זו נמכרה בעבר על ידי LI-COR ב-1 מ"מ</td></tr><tr><td>ספיר</td><td>LI-COR</td><td>928-40022</td><td></td></tr><tr><td>לומינומטר</td><td>PerkinElmer</td><td>VICTOR3 1420 multilabel counter</td><td></td></tr><tr><td>Odyssey Imager</td><td>LI-COR</td><td>9201-01</td><td></td></tr><tr><td>שייקר/מיקסר</td><td>מוצרי מחקר בינלאומיים</td><td>248555</td><td></td></tr></tbody></table>

מבחני כדאיות לתאים בתרבית

Viability Assays for Cells in Culture

ספירת תאים ידנית על מיקרוסקופ הם אמצעי רגיש להערכת כדאיות סלולרית אבל הם גוזלים זמן ולכן יקר. מבחני כדאיות ממוחשבים הם יקרים במונחים של ציוד, אבל יכולים להיות מהיר יותר ואובייקטיבי יותר מספירת תאים ידנית. הדו&quot;ח הנוכחי מתאר את השימוש בשלושה מבחני כדאיות כזה. שניים ממבחנים אלה הם אינפרא אדום ואחד הוא זורח. שני מבחני אינפרא אדום להסתמך על Imager אודיסיאה 16 קצת. assay אינפרא אדום אחת משתמש כתם DRAQ5 לגרעינים בשילוב עם כתם ספיר לcytosol והיא דמיינו בערוץ 700 ננומטר. Assay אינפרא אדום האחר, ב- Cell מערבי, משתמש בנוגדנים כנגד חלבוני cytoskeletal (החלבון קשור α-טובולין או microtubule 2) ומתייג אותם בערוץ 800 ננומטר. Assay הכדאיות השלישי הוא assay זורח נפוץ עבור ה-ATP, אבל אנחנו משתמשים ברבע מהנפח המומלץ לחסוך בעלויות. מדידות אלה הן כל ליניארי ולתאם עם מספר ceLLS מצופה, אבל להשתנות ברגישות. כל שלושה מבחני לעקוף מיקרוסקופיה זמן רב ולדגום את כולו היטב, ובכך להפחית טעות דגימה. לבסוף, כל מבחני יכולים בקלות להסתיים בתוך יום אחד של סוף הניסוי, המאפשר למספר גדול יותר של ניסויים להתבצע בתוך פרקים זמן קצרים. עם זאת, כולם מסתמכים על ההנחה שמספרי תאים להישאר בפרופורציה לעוצמת אות לאחר טיפולים, מתוך הנחה שהוא לפעמים לא פגש, במיוחד עבור ה-ATP הסלולרית. יתר על כן, אם תאי גידול או קיטון בגודל לאחר טיפול, זה עשוי להשפיע על עוצמת אות מבלי להשפיע על מספר תא. אנו מסיקים כי כל מבחני הכדאיות, כוללים ספירה ידנית, סובלים ממספר האזהרות, אבל שמבחני הכדאיות ממוחשבים הם שווים את ההשקעה הראשונית. שימוש בכל שלושת מבחני יחד מניב תצוגה מקיפה של מבנה ותפקוד תאיים.

הגורם המגביל בריבית בניסויים אלה הוא הכתמים אדום, כמו assay ATP הוא יחסית קצר משך. למבחני אינפרא אדום, אנו צופים כי יכולים להיות מוכתמים שמונה צלחות 96 היטב וסרקו בתוך יום אחד על ידי שתי קבוצות מדהימות של ארבע צלחות כל אחד (ראה איור 1). הערכה זו מבוססת על ההנחה 20 דקות של קיבעון, 30 דקות של כביסה, 30 דקות של חסימה, 2 דגירה נוגדן ראשוני שעה ואחריו 30 דקות של שוטף, דגירה נוגדנים משני שעה 1 ואחריו 30 דקות של שוטף, 30 DRAQ5 דקות + ספיר ואחריו 30 דקות של שוטף, ו34 דקות...

תרכובות טיפוליות לעתים קרובות נבחנות ראשון במבחנה עם מבחני כדאיות. ספירת תאים עיוורת על ידי צופה אנושי יכולה להיות רגישה מאוד לשינויים קטנים במספר תאים, אבל לא להעריך את התפקוד. מבחני כדאיות ממוחשבים, כפי שמתואר כאן, יכולים להעריך גם מבנה ותפקוד באופן אובייקטיבי.

Manual cell counts on a microscope are a sensitive means of assessing cellular viability but are time-consuming and therefore expensive. Computerized ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לבצע מספר בדיקות חיוניות (viability assays) המספקות מבט מקיף יותר על הכושר התאי (cellular fitness) מאשר כל בדיקה בודדת יכולה לספק. זאת מושג תחילה על ידי מדידת רמות ה-ATP של תאים שהוצמדו למצע, כדי להעריך את התפקוד המטבולי. השלב השני הוא צביעה אימונוהיסטוכימית של חלבוני השלד התאי, כגון alpha tubulin או microtubule associated protein two, באמצעות נוגדנים באינפרה-אדום באורכי גל של 800 ננומטר.בשלב הבא מסמנים את התאים באמצעות Drac 5 ו-Sapphire באינפרא-אדום כדי לצבוע את הגרעין והציטופלזמה ב-700 nanometers. השלב הסופי הוא הדמיה של alpha tubulin או MAP2, יחד עם Drac 5 ו-Sapphire, הן באורך גל של 700 nanometers והן ב-800 nanometers באמצעות מדמיית אינפרא-אדום. בסופו של דבר, בדיקות לומנסנטיות ואלו של אינפרא-אדום מספקות מידע הן על מבנים אנטומיים והן על תפקוד פיזיולוגי.היתרון העיקרי של טכניקות אלו על פני שיטות קיימות, כגון בדיקת חיוניות MTT, הוא המדידה המהירה והרגישה של היבטים מרובים של שלמות תאית. שיטות אלו יכולות לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחומי מדעי העצבים והפרמקולוגיה, כגון השאלה האם תרכובות טיפוליות יכולות להגן על מבנים אנטומיים ועל תפקוד מטבולי. כדי להתחיל, קצרו והחזירו את התאים ב-100 או 200 µL של מצע במצפי תאים שונים בלוחית של 96 בארות כפי שמתואר בפרוטוקול המצורף; מלאו את הבארות ההיקפיות ב-200 µL של מים סטריליים כדי להפחית את השפעות האידוי בשולי הלוחית.השאירו את התאים להיצמד למשך לילה בטמפרטורה של 37 °C באינקובטור עם CO2. למחרת, הסירו 50 מתוך 100 µL של מצע גידול, או 150 מתוך 200 µL של מצע גידול, כך שיישארו 50 µL של מצע גידול בכל באר. לאחר מכן, הוסיפו 25 µL של ריאגנט cell titer glow לכל אחת מהבארים הפנימיות בעמודות שתיים עד שש.כדי לקבל דילול של 1:2 בעמודות 7 עד 11, שורות B עד D, יש להוסיף 50 µL של ריאגנט Cell Titer Glow כדי להשיג דילול של 1:1 בשאר הבארות בעמודות 7 עד 11, שורות E עד G. אין להסיר מדיום, אלא להוסיף 100 µL של ריאגנט Cell Titer Glow כדי להשיג דילול של 1:1 בנפח כולל של 200 µL. יש להניח מיד את הפלטה על שייקר סיבובי או תנודתי למשך 10 דקות כדי לערבב את הדגימות בזמן הדגירה.לאחר מכן, העבירו 60 µl מכל באר לפלטה של 96 באערים בעלת דפנות לבנות. ערכי לומנצנציה הם גבוהים יותר בפלטות לבנות מאשר בפלטות שקופות או שחורות מכיוון שהן מחזירות את האור כלפי מעלה לעבר הגלאי. אם נוצרו בועות במהלך ההעברה, פוצצו אותן באמצעות אוויר נדחף מנבוב של פיפטת העברה מפלסטיק.לאחר מכן, בתוך 12 דקות מהוספת הרכיבים, הניחו את הפלטה בלומינומטר ומדדו את ערכי הלומינסנציה. חשבו את ממוצע ערכי הלומינסנציה משלושה או שישה בארות בכל קבוצה ושרטטו אותם כפונקציה של מספר התאים; המשיכו עם הדילול הגבוה ביותר של הרכיבים שעדיין נותן תוצאות לינאריות ופרופורציונליות כפי שמוגדר בטקסט הנלווה. פעולה זו תחסוך בעלויות עבור בדיקות האינפרא-אדום, אספו את התאים והחזירו אותם למצב של התפשטות בצפיפויות שונות כפי שמתואר בפרוטוקול בטקסט הנלווה.מלאו את הבארות הסמוכות ב-200 microliters של מים סטריליים כדי להפחית את השפעת מ gradient של הטמפרטורה ואידוי לאורך הקצוות. הניחו לתאים להיצמד למשך לילה ב-37 degrees Celsius בתוך אינקובטור עם CO2, ולאחר מכן קבעו את התאים על ידי הוספת 100 microliters של חומר קיבוע, כגון 4%formaldehyde ו-4%sucrose ב-0.1 molar phosphate buffer. הדגרירו את הפלטה בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות, לאחר מכן הסירו את חומר הקיבוע ושטפו את התאים שלוש פעמים עם 200 microliters של PBS.בשלב הבא, דללו את תמיסת החסימה ביחס של אחד לאחד ב-PBS והוסיפו 0.3% Triton X 100 כחומר חודר תאים. לאחר מכן, הוסיפו 35 microliters של תמיסת החסימה לכל באער, תוך הקפדה על מניעת היווצרות בועות בבארים. הדגירו את הפלטה עם תמיסת החסימה למשך 30 עד 60 דקות בטמפרטורת החדר.במהלך דגירה זו, דללו את הנוגדנים הראשוניים עבור החלבונים הנבדקים. לדוגמה, דללו את הנוגדן הראשוני Antifa tubulin ביחס של 1:10,000 בתערובת של יחס אחד לאחד של תמיסת חסימה (blocking buffer) ו-PBS עם 0.3%TRITTON X 100, תוך אופטימיזציה של בדיקת הפרוטוקול. דילול נוסף של נוגדנים מופיע כאן: הנוגדן הראשוני Antifa tubulin מדולל גם ביחס של 1:5,000 בתערובת של יחס אחד לאחד של תמיסת חסימה ו-PBS עם 0.3%Triton X 100.בשלב הבא, הוסיפו את הנוגדנים בריכוזים המוצגים כאן לתאים שקובעו על הפלטה. הקפידו להשאיר את בארי הביקורת השלילית בעמודה השנייה בתמיסת החסימה, שכן הם ייחשפו לנוגדנים משניים בלבד. דגרו את התאים בנוגדנים ראשוניים למשך שעה עד שעתיים בטמפרטורת החדר או למשך הלילה ב-4 °C.בשלב הבא, הכין את הנוגדנים המשניים anti mouse IgG בגודל 800 ננומטר על ידי דילולם ביחס של 1:1000 או 1:2000 בתערובת של יחס 1:1 של באפר חסימה (blocking buffer) ו-PBS עם 0.3% Triton X 100, לאחר הדגירה עם הנוגדן הראשוני. שטוף את הבארות שלוש פעמים למשך 10 דקות כל אחת עם 200 µL של PBS לבאר. לאחר מכן, הוסף 35 µL של נוגדנים משניים לבארות.הוסיפו את הדילול של 1:1000 לחצי העליון של הפלטה ואת הדילול של 1:2000 לחצי התחתון. דגרו את התאים עם הנוגדנים המשניים למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר, תוך הגנה מאור. לאחר מכן, שטפו את הנוגדנים המשניים שאינם קשורים באמצעות שלושה שלבי שטיפה של 10 דקות ב-PBS, תוך שימוש ב-200 µL לכל באער בכל פעם.בשלב הבא, דללו את מלאי ה-DRAC five ביחס של 1:10,000 לריכוז סופי של 0.5 micromolar, ואת מלאי ה-sapphire ביחס של 1:1000 ב-PBS עם 0.3% Triton X 100. הוסיפו 35 microliters מתערובת זו לחצי השמאלי של הפלטה, אך אל תוסיפו דבר לבארות של הביקורת השלילית בעמודה השנייה. עבור החצי הימני של הפלטה, הוסיפו 35 microliters של drac five מדולל ביחס של 1:20,000 ו-sapphire מדולל ביחס של 1:2000.דגרו בתמיסות אלו למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר הרחק מאור. לאחר מכן, שטפו את הפלטה שלוש פעמים עם 200 microliters של PBS לכל באר למשך 10 דקות בכל פעם. התחילו בסריקת הפלטות במדמייר אינפרא-אדום בעוצמה 5 וברזולוציה של 169 microns.הגדרות איכות בינונית או איכות נמוכה מספיקות. לאחר מכן, בצעו סריקה בהיסטים שונים של המיקוד (focus offsets) של 2.5 millimeters, 3.0 millimeters, 3.5 millimeters ו-4.0 millimeters כדי לבחון היכן מושג יחס האות לרעש הגבוה ביותר ואות חד. לאחר אופטימיזציה של היסט המיקוד, השתמשו בפונקציית ה-incel western בתוכנה כדי להניח רשת בגודל המתאים על תמונת הפלטה וייצאו את הנתונים ל-Microsoft Excel.חסרו את הממוצע של העוצמות המשולבות בבארות של הביקורת השלילית מכל נקודת נתון תואמת בערוצי ה-700 וה-800 ננומטר. לאחר מכן, חשבו את הממוצע של עוצמות האות המשולבות עבור כל קבוצת בארות והציגו את הנתונים כתרשים פיזור אל מול צפיפות התאים לאחר האופטימיזציה. עוצמת האות בשלושת הבדיקות הייתה במתאם משמעותי עם מספר התאים לבער, ואף על כך ששלוש הבדיקות היו ליניאריות מאוד, הן לא היו שוות ברגישותן.בדיקת ה-A TP הראתה את הרגישות הגבוהה ביותר מבין השלוש, שהוגדרה כשינוי הפרופורציונלי ביותר של הפלט הלומניסצנטי ביחס להפחתות במספר התאים בתאי עצב ראשוניים של חולדה. ריכוזי הרכיבים האופטימליים היו שונים, והבדיקות הפגינו ליניאריות נמוכה יותר לאורך כל טווח הבדיקה. עם זאת, שתי הבדיקות היו ליניאריות ורגישות בצפיפויות זריעה נמוכות מ-100,000 תאים, כפי שמוצג כאן.עקומות התגובה למינון שלנו עבור תאי נוירובלסטומה שטופלו ב-MG 1 32, מעכב פרוטאוזום; MG 1 32 הוחל בנוכחות או בהיעדר קדם-החומר של גלוטתיון, N-acetyl cysteine, כאשר N-acetyl cysteine מסיט את כל שלוש העקומות ימינה. לדוגמה, ה-IC 50 כפי שנמדד על ידי DRAC five plus sapphire היה 1.64 micromolar של MG 1 32 ללא n-acetylcysteine ו-4.64 micromolar של mg 1 32 בנוכחות N-acetylcysteine. ערכים אלו היו דומים לערכים שנמצאו במבחן ה-alpha tubulin, שהיו 1.96 micromolar ו-6.35 micromolar של MG 1 32 בהתאמה.עם זאת, רמות ה-ATP עלו בריכוזים נמוכים של MG 1 32, תופעה הנקראת הורמזיס (hormesis). נתונים אלה חושפים כי רמות ה-ATP אינן בהכרח פרופורציונליות לכמות התאים בעקבות הטיפול, וכי N-Acetyl cysteine יכול גם הוא להגן על התפקוד המטבולי. לאחר השליטה בבדיקת ה-ATP הלומנסיאנטית, ניתן להשלימה תוך 30 דקות, ואת הצביעה באינפרא-אדום ניתן להשלים בקלות תוך שמונה שעות.בעת ביצוע פרוצדורות אלו, חשוב לזכור שהן אינן מודדות את מספר התאים באותה דרך שבה עושה זאת מיקרוסקופ ברזולוציה גבוהה. לדוגמה, סייג אחד הוא שרמות חלבון alpha tubulin או רמות TP עשויות להשתנות כתוצאה מהטיפולים ללא שינויים מקבילים במספר התאים.

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

קביעת מספר התאים בתרבית חשוב סטנדרטיזציה של תנאים התרבות בביצוע ניסויים quantitation מדויק. בסרטון זה אנו מדגימים כיצד תאים נספרים באמצעות hemacytometer.

ספירת ועל קביעת הכדאיות של תאים בתרבית

תחולתה של assay clonogenic להערכת הכדאיות הרבייה הוקם עבור יותר מ -50 שנה. כאן אנו מדגימים את הנוהל הכללי לביצוע assay clonogenic עם תאים חסיד.

Assay Clonogenic: תאים חסיד

שונה 3-D במבחנה מערכת מוצג אשר מאפיינים הצמיחה של מספר שורות תאים סרטניים קרום במרתף מחדש לתאם עם התנהגות רדום או שגשוג של תאים סרטניים באתר משנית...

במבחנה מערכת לחקר תרדמת גידול ואת החלף ל גידול גרורתי

סרטון זה מתאר טכניקה מבוססת עכבה תאית לחקר קינטיקה הישרדותית של וירוסים הגורמים להשפעות ציטופתיות. השיטה מודדת את העכבה החשמלית של תאים דבקים נגועים בנגיף שטופלו מראש במי מלח.

בדיקת קינטיקה הישרדותית מבוססת עכבה תאית להערכת הישרדות הנגיף

אנו מתארים המבדק פשוט מבוססי תאים לזיהוי, כימות לפקח על פעילות בני משפחת פקטור הגדילה של אנדותל כלי הדם של הליגנדים. את assay משתמש קולטנים chimeric לידי ביטוי קו תא גורם תלוי לתת הערכה וכמותיות או הכמות של קולטן מחייב cross-linking ידי ליגנד.

מבדק פשוט עבור הערכת גורמי הגדילה של אנדותל כלי דם

לעתים קרובות יש צורך להעריך את הרעילות הפוטנציאלית של מערכת תרכובות על תאים מתורבתים. כאן, אנו מתארים אסטרטגיה למסך מהימן עבור תרכובות רעילות בפורמט 96-היטב.

אסטרטגיה לזיהוי תרכובות המשפיעות על צמיחת תאים והישרדות בתאי מיונקים מתורבתים בתפוקה נמוכה לבינונית

כאן, אנו מציגים מספר שיטות פשוטות להערכת הכדאיות והמוות ב-3D הסרטן תאים spheroids, אשר לחקות את פיזיקאלית-כימיים מעברי הצבע של גידולים vivo הרבה יותר טוב מאשר תרבות דו-ממדית. מודל ספרואיד, לכן, מאפשר הערכה של יעילות התרופה לסרטן עם תרגום משופר בתנאים vivo.

הערכת הכדאיות תא ומוות ב 3D בתרבויות ספרואיד של תאים סרטניים

פרוטוקול זה מדגים שיטות המאפשרות הרחבה בתרבות המבחנה של xenografts נגזר המטופל (PDX). צעד אחד משפר את הכדאיות הכוללת של תרבויות אשכול רב-תאי בהידרוג'לים תלת-מימדיים, באמצעות הסרה פשוטה של תאים בודדים שאינם ברי קיימא. שלב משני מדגים שיטות עבודה מומלצות לתרבות PDX בפלטפורמה מיקרו-נוזלית מנווטה.

קיימות משופרת עבור תרבויות הידרוג'ל 3D Ex vivo של Xenografts נגזר המטופל בפלטפורמה מיקרופלויד perfused

פרוטוקול זה מציג מבחני ציטוטוקסיות נפוצים (Alamar Blue [AB], CFDA-AM, Neutral Red ו-MTT assays) המותאמים להערכת ציטוטוקסיות בעוברים של דגי זברה (ZEM2S) ובקווי תאי כבד (ZFL) בלוחות של 96 בארות.

בדיקות ציטוטוקסיות עם קווי תאים של דגי זברה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לכימות הישרדות לאחר לחץ בדגימות שמרים. הבדיקה משתמשת בשני צבעים פלואורסצנטיים, SYTO 9 ופרופידיום יודיד (PI), כדי לכמת את שלמות קרום הפלזמה. הוא משתמש בזרימה ציטומטרית כדי לספק הערכות כמותיות וניתנות לשחזור של חלקי התאים החיים, המתים והפגומים עבור דגימות פוסט-מתח חמצוני.

בדיקת LIVE/DEAD אופטימלית בשילוב עם ציטומטריית זרימה לכימות הישרדות לאחר מתח בתאי שמרים

למדו לבצע מבחני כדאיות מרובים בתאים בתרבית באמצעות מדידת רמות ATP, צביעת חלבוני שלד תאי ודימות אינפרא-אדום. שיטה זו מספקת הערכה מקיפה של כושר תאי ופונקציה מטבולית.

מבחני כדאיות לתאים בתרבית

גלה סרטונים נוספים