Culturing של אדם תאי אפיתל באף בממשק האוויר הנוזלי

המטרה הכוללת של הליך זה היא לתרבית תאי אפיתל אף לא ממוינים בממשק נוזל האוויר. זה מושג על ידי השגת תאי אפיתל אף שטחיים ממתנדב אנושי. השלב השני הוא לזרוע את התאים על צלחות תרבית רקמה ואז להרחיב את התאים בצלוחיות.

לאחר מכן, התאים המורחבים נזרעים לתוך בארות וגדלים לשטף משותף. השלב האחרון הוא הסרת מדיום תרבית הרקמה האפיקלי של תרביות התאים המשולבות על הטרנסוולס כדי ליצור תנאי תרבית ממשק נוזלי אוויר. בסופו של דבר, תאים הגדלים בממשק נוזל האוויר במשך שלושה עד ארבעה שבועות יתמיינו מחדש לתרבית תאי אפיתל אף רירית, המחקה את הפנוטיפ של אפיתל האף in vivo.

היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו תרבית, תאי אפיתל סימפונות או השגת תאי אפיתל נשימתיים זמינים מסחרית הוא היכולת של החוקר להגדיר מראש את האוכלוסייה שממנה ניתן לדגום את תאי האפיתל באף. ביופסיות אף הן הרבה פחות פולשניות מביופסיות מברשת הסימפונות במהלך ברונכוסקופיה ולכן ניתן לדגום אוכלוסיות מחלה עם מחלה בינונית עד קשה ללא תופעות לוואי משמעותיות. אמנם חשוב לזכור שטכניקה זו שימושית מאוד לחקר ההשפעות של חומרים בשאיפה על אפיתל נשימתי תקין, אך חשוב גם לזכור שהדגימות הללו מגיעות כל אחת מהשלמה גנטית ייחודית, וזה הופך אותן למשאבים חשובים לחקר מחלות גנטיות כמו סיסטיק פיברוזיס ודיסקינזיה ריסנית ראשונית.

מי שתדגים את ההליך תהיה מיסי ברייטון, טכנאית מהמעבדה שלי. כהכנה למושב הביופסיה של גירוד האף, הנבדק זקוף בכיסא עם גב ישר עם ראש מוטה לאחור מעט שטחי תאי אפיתל המצפים את מסתיים האף יתקבלו בראייה ישירה באמצעות ספקולום אף פוליפרופילן לשימוש חוזר של תשעה מילימטר על סקופ אוטומטי הפעלה עם ספקולום. מכשיר זה מספק הדמיה אופטימלית של קצות האף וגמישות התנועה.

הכנס את ספקולום ההיקף האוטומטי לנחיר והקצה התחתון נראה עם תאורה. הכנס קורט תרמופלסטי סטרילי דרך הספקולום כשהקצה מורחב דיסטלי לחלק האחורי של הקצה באמצעות לחץ עדין על המשטח התחתון של הסיום. צייר את הקורט על פני הרירית חמש פעמים ולאחר מכן משוך את הקורט.

שליפה מוצלחת של תאים ריריים המוחזקים על ידי פעולה נימית תהיה ניכרת בכוס הקורט. הניחו את הקורט עם התאים בצינור חרוטי של 15 מיליליטר המכיל שמונה מיליליטר RPMI 1 6 4 0, והניחו על קרח להובלה למעבדה. השתמש במלקחיים כדי להחזיר את הקורט עם התאים ולאחר מכן השתמש בפיפטה P 1000 כדי לעקור את התאים מהקורט.

השליכו את הקורטה. תאי האפיתל של האף המתקבלים על ידי ביופסיית גירוד באף יושבים לאחר מכן בצלחת 12 בארות מקודדת קרה. להתחיל הליך זה בנפח מינימלי של מדיום גידול תאי אפיתל הסימפונות או BEGM פלוס בתוספת כ-80 עד 100 מיקרוליטר לבאר לבאר אחת עד ארבע בארות של הצלחת המצופה, תלוי בגודל הביופסיה.

לאחר מכן, השתמש בפיפטה P 1000 כדי להסיר בזהירות את הגלולה של רקמת הביופסיה מהצינור מבלי לשאוב יותר מדי מדיה. העבירו את הגלולה לאמצע הבארות המכילות מדיה. שמור את הביופסיה יחד כמקבץ של תאים.

אל תפרקו אותו. כדי ליצור השעיה של תא בודד. ביופסיה טובה אמורה להניב עד ארבע בארות שניתן לזרוע.

הכניסו את הצלחת לתרבית אינקובטור לתרבית רקמות. התאים העוקבים אחר הפרוטוקול וכתב היד הנלווה, התאים היושבים בצלחת 12 הבארות מנוטרים מדי יום עד שהם מגיעים לשטף של 80 עד 90%, ואז הם מועברים לצלוחיות להרחבה. שאפו בזהירות מדיה מכל באר ולאחר מכן הוסיפו 500 מיקרוליטר של נקודה 25% טריפסין לכל באר. ובכן.

שמור את הצלחת על 37 מעלות צלזיוס עד לניתוק התאים. זה בדרך כלל לוקח שתיים עד שלוש דקות לעקור תאים על ידי פיפטינג למעלה ולמטה, ואז להעביר תאים מנותקים לצינור חרוטי של 15 מיליליטר המכיל מעכב טריפסין סויה או צנטריפוגה SBTI לגלולה לאחר השאיבה. ה-S natin Resus תלוי במיליליטר אחד, BEGM בתוספת מדיה ומערבולת הצינור מרחיבים את התאים בבקבוק T 25 או T 75, תלוי בגודל הגלולה.

בקבוק T 75 משמש בהדגמה זו. הוסף חמישה מיליליטר, BEGM בתוספת מדיה לבקבוק, ולאחר מכן הוסף את מתלה התא לבקבוק. העבירו את הבקבוק לחממת תרבית הרקמות.

לאחר הרחבת NECs בצלוחיות, השלב הבא הוא לזרוע תאים על תוספות תרבית רקמה. הסר את המדיה מבקבוק T 75 והוסף ארבעה מיליליטר. טריפסין דוגר על תאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שתיים-שלוש דקות עד לניתוק התאים.

עקור תאים על ידי הקשה על הבקבוק ופיפטינג למעלה ולמטה. מעבירים לשפופרת של 15 מיליליטר המכילה SBTI. שוטפים את הבקבוק בשני מיליליטר.

של האנק, איזון תמיסת מלח והוסף את הצינור של 15 מיליליטר, צנטריפוגה את הגלולה, ואז הסר את הסופרה נטין. מכינים בזהירות את 12 צלחות הבאר. לאחר שהחלטתם כמה צלחות הולכות להיזרע, סמנו את הלוחות באותו קוד ומספר, מספר מעבר ותאריך.

הוסף 700 מיקרוליטר, BEGM בתוספת מדיה לתא הבסיס של כל אחד מהם. ובכן השעו את כדור התא במיליליטר אחד, B-E-G-M-A-L-I. מדיה על ידי מערבולת הצינור.

ספרו את התאים עם ציטומטר ההמו, ואני מעביר את תרחיף התאים עם מדיה B-E-G-M-A-L-I לנפח הכולל הדרוש לכמות הצלחות שיש לזרוע. הוסף 200 מיקרוליטר של תרחיף תאים לצד האפיקלי של כל לא מצופה. 12 באר הכנס תאים.

העבירו את הצלחות לחממת תרביות הרקמה כדי לשמור על תרביות התאים. החלף את המדיה כל יומיים. השתמש במדיה B-E-G-M-A-L-I, 700 מיקרוליטר לתא הבסיסי ו-200 מיקרוליטר לתא האפיקלי.

יש לשמור על התוספות שקועות עד שהתאים מתכנסים לחלוטין. יומיים עד שישה ימים לאחר הזריעה על תוספות תרבית רקמות, התאים צריכים להיות מתכנסים לחלוטין ללא חורים גלויים בשכבה החד-שכבתית כדי ליצור ממשק נוזל אוויר או LI 48 שעות לאחר האינדוקציה עם חומצה רטינואית. הסר את כל המדיה והוסף 700 מיקרוליטר פנאומוקלית, LI, אמצעי תחזוקה לצד הבסיסי בלבד.

אין מדיום בצד האפיקלי. שמור על תרביות התאים במשך ארבעה שבועות. ב-A LI.אנא עיין בטקסט הפרוטוקול הנלווה לפרטים נוספים על ההליך להקמה ותחזוקה של LI, NECs אנושיים מתורבתים בהתאם לפרוטוקול המודגם בסרטון זה מתמיין מחדש לשכבה הטרוגנית של ECS המורכבת מתאים ריסניים ולא מדורגים המייצגים את המצב in vivo.

ה-NECs נקבעו ב-4% FA והוטמעו ב-NECs פרפין. תרביות מוכתמות בהמטין ואאוזין מוצגות בפאנל A.חלק מה-NECs המובחנים הם תאי גביע המייצרים ריר שזוהו בכחול בפאנל B על ידי איאן בלו. צביעת משמרת חומצה תקופתית תמונה זו של קטע מוטבע של פרפין בצבע המטין ואאוזין של תרבית NEC מציגה דוגמאות של NECs לא מובחנים לא אופטימליים באמצעות פרוטוקול שונה וניסוחי מדיה.

בניגוד למה שנצפה באיור הקודם, התאים כאן הם קשקשיים ואינם קובואידים או מסונפים, ואינם מחקים אפיתל נשימתי מרובד פסאודוס. נקודת מפתח בכל ההליכים הללו היא הראשונה, והיא רכישת דגימה ממש טובה של אפיתל האף. זה מוביל להתפתחות מערכת התרבות כולה ולפיתוח אפיתל מובחן טוב במבחנה בעקבות הליך זה.

ניתן להשתמש בשיטות כמו R-T-P-C-R, Western Blotting, EIA, כמו גם טכניקות תאיות וביוכימיות רבות אחרות כדי לענות על שאלות הקשורות לתגובות הנגרמות על ידי חומרים בשאיפה או פתוגנים. לא כל ביופסיה של גירוד האף תניב תרביות מוצלחות. זה יהיה תלוי במצב הנבדק כמו גם במצב הרקמה שנאספה.