Name: נוגדן מכתים ב ג Elegans שימוש Freeze-פיצוח (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-14T21:15:00.000+00:00
Duration: 13 min 10 s
Description: למדו שיטת "freeze-cracking" לצביעת נוגדנים ב-C. elegans ללוקליזציית חלבונים. הטכניקה ממזערת טיפול כימי ומאפשרת צביעה יעילה במיקרוסקופ פלואורסצנטי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מימון ניתן על ידי NSF CCLI # 0633618 ואוניברסיטת אוהיו. כמה זנים סופקו על ידי המרכז לגנטיקת Caenorhabditis. סטודנט לתואר שני Reetobrata Basu מופיע בסרטון.

<ol><li>Harlow, E., Lane, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHarlow%2C+E+%22Antibodies%3A+A+Laboratory+Manual%22">Antibodies: A Laboratory Manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York City, New York. (1988).</li>
<li>Mello, C., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+Transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">DNA Transformation.</a> Methods Cell Biol. 48, 451-482 (1995).</li>
<li>Boulin, T., Etchberger, J. F., Hobert, O. Reporter gene fusions. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBoulin%2C+T+%22WormBook%22">WormBook</a>. , WormBook. (2006).</li>
<li>Duerr, J. S. Immunohistochemistry. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDuerr%2C+JS+%22WormBook%22">WormBook</a>. , WormBook. (2006).</li>
<li>Finney, M., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+unc-86+gene+product+couples+cell+lineage+and+cell+identity+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The unc-86 gene product couples cell lineage and cell identity in C. elegans.</a> Cell. 63, 895-905 (1990).</li>
<li>Garriga, G., Desai, C., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+interactions+control+the+direction+of+outgrowth%2C+branching+and+fasciculation+of+the+HSN+axons+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cell interactions control the direction of outgrowth, branching and fasciculation of the HSN axons of Caenorhabditis elegans.</a> Development. 117, 1071-1087 (1993).</li>
<li>Miller, D. M., Shakes, D. C. Immunofluorescence microscopy. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMiller%2C+DM+%22Caenorhabditis+elegans%3A+Modern+Biological+Analysis+of+an+Organism%22">Caenorhabditis elegans: Modern Biological Analysis of an Organism</a>. Epstein, H. F., Shakes, D. C. , Academic Press. San Diego, California. 365-394 (1995).</li>
<li>Crittenden, S. L., Troemel, E. R., Evans, T. C., Kimble, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GLP-1+is+localized+to+the+mitotic+region+of+the+C.+elegans+germ+line%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">GLP-1 is localized to the mitotic region of the C. elegans germ line.</a> Development. 120, 2901-2911 (1994).</li>
<li>Strome, S., Wood, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunofluorescence+visualization+of+germ-line-specific+cytoplasmic+granules+in+embryos%2C+larvae%2C+and+adults+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Immunofluorescence visualization of germ-line-specific cytoplasmic granules in embryos, larvae, and adults of Caenorhabditis elegans.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 79, 1558-1562 (1982).</li>
<li>Albertson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+the+first+cleavage+spindle+in+nematode+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Formation of the first cleavage spindle in nematode embryos.</a> Dev. Biol. 101, 61-72 (1984).</li>
<li>Harlow, E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHarlow%2C+E+%22Using+Antibodies%3A+A+Laboratory+Manual%22">Using Antibodies: A Laboratory Manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York City, New York. (1999).</li>
<li>Ahringer, J. Reverse Genetics. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAhringer%2C+J+%22WormBook%22">WormBook</a>. , WormBook. (2006).</li>
</ol>

המחבר מצהיר שאין לה אינטרסים כלכליים מתחרים.

פרוטוקול פיצוח ההקפאה הוא אחת מכמה שיטות למכתים נוגדן בג elegans. הוא מספק דרך פשוטה יחסית להכתים תולעים, אבל דורש חומרים כימיים מסוימים ולתרגל לתוצאות מיטביות. שלבים קריטיים (שמתוארים באיור 1) כוללים: 1) הכנת שקופיות (ראה שלבים 1 ו 2) דחיסה ידנית של נמטודות (ראה שלבים 2 ו -3) קיבעון מהיר (ראה שלב 3). ראשית, על מנת למקסם את ההידבקות של נמטודות לשקופיות, עדיף להכין שקופיות עם משקל מולקולרי גבוה (פולימר ארוך) polylysine, במקום להסתמך על שקופיות מוכנות מסחרי...

כדי לקבוע את הלוקליזציה הסלולר וsubcellular של חלבונים, מדענים שכותרתו מסורתי רקמות עם נוגדנים שנבחרו להכיר באופן ספציפי חלבונים מסוימים 1. בחלק מאורגניזמים מודל כגון ג elegans, מכתים נוגדן הוחלף לעתים קרובות על ידי טכניקות גנטיות מולקולריות, אשר יניבו תוצאות במהירות רבות יותר. אלה כוללים אורגניזמים הפיכה עם מבנים בהיקף של התכה גנים בין האמרגן ואזורי קידוד של הגן של עניין וחלבון פלואורסצנטי ירוק. עם זאת, טכניקות מולקולריות כפופות למספר החפצים, ובם בעיות עם ידיעת האמרגן ושינויים בביטוי של מבנים במספר גבוה עותק (טכניקות הרגילות ב C. elegans) 2,3 האמיתיים. לכן, צביעה עם נוגדנים נשארת מטרה של מדענים רבים בחקר תפקוד חלבון in vivo. מכתים את הרקמות עם נוגדנים יכולים להיות קשה, שכןtibodies רק יכול לזהות אנטיגן בקונפורמציה מסוימת 1. לדוגמא, נוגדנים יכולים לזהות רק אנטיגן מפוגל או בשלמותה הקבוע בדרך מסוימת ואולי לא מזהים את האנטיגן באתרם. הבעיה של מכתים נוגדן בנמטודות מחריפה בשל העובדה שהציפורן של נמטודות יוצרת מחסום בלתי חדיר יחסית, החוסם את הגישה של נוגדנים לרקמות. ישנן מספר שיטות שונות המשמשות למכתים נוגדן בג elegans (שנסקר בעבודה הקודמת שלנו 4). כדי להכתים שלמים &#39;תולעים&#39;, שיטות פותחו כדי להקפיא ולהפשיר במקבע קשה יחסית (פורמלדהיד או glutaraldehyde); להקפיא להפשיר מחזורים לעזור לפצח את הציפורן כדי לאפשר חדירה מהירה של המקבע 5. לאחר קיבוע, הציפורן הייתה permeabilized כדי לאפשר חדירה של הנוגדן; שיטות כללו טיפול עם צמצום סוכנים, collagenase, או שניהם 5-7. לא אלהreatments השתמר מורפולוגיה, אך לעתים קרובות מופחת או נהרס הכרת נוגדן. שיטות אלטרנטיביים כוללות לנתיחה 8 כדי לאפשר חדירת נוגדן. &quot;להקפיא-פיצוח&quot; הוא אחת דרכים כדי לקבל גישה לחלק הפנימי של התולעת חצי השלמה כדי לאפשר נוגדן מכתים 9-10. הקפאת פיצוח יכול להתבצע עם מגוון רחב של תנאי קיבעון תוך הימנעות טיפולי collagenase וצמצום. נמטודות ממוקמות בין שתי שקופיות דבקים, קפואות, ולאחר מכן השקופיות מופרדות, ומשאירות את רוב נמטודות בשקופית התחתונה וחלק גדול מציפורן בשקופית העליונה. השקופית התחתונה יכולה להיות ממוקמת במקבעת וכל השקופית עם נמטודות דבקה מועברת בהליך מכתים נוגדן. השיטה עושה שני קשיים עיקריים כיום. ראשית, קשה להחיל את הסכום הנכון של לחץ דרוש כדי לפצל את נמטודות בלי לעוות אותם ברצינות. שנית, רבים של התולעים לא יהיה שלסמן לאו שקופיות, ויאבד במקבע או שטיפות. עם זאת, עם השקופיות ותרגול הנכונים, השיטה תהיה במהירות להניב נמטודות עם מורפולוגיה סבירה שבו ניתן להשתמש במגוון רחב של fixatives ונוגדנים. השיטה עשויה להיות מגוונת במקצת, בהתאם למטרה של הנסיין. אם הכתמה של נמטודות אחת היא רצויה (למשל כדי לקבוע אם transformant אחת שינה מכתים נוגדן), ואז מחליק עם הידבקות מקסימלי (אבל מכתים רקע גבוה יותר) יכול לשמש, כמו שקופיות שהוכנה במעבדה עם polylysine נוסף (ראה בהמשך). לפורמלדהיד או קיבעון glutaraldehyde, יש להשתמש בשקופיות הידבקות גבוהות יותר (שקופיות polylysine הכנה מעבדה), שכן נמטודות לדבוק יותר גרועה לpolylysine לאחר הקיבעונות האלה. אם נמטודות פראית מהסוג שמתבצעת קבועה עם מתנול ו / או אצטון, ולאחר מכן שקופיות עם הידבקות נמוכה יותר ויש להשתמש בי מכתים רקע נמוך יותר (מסחרי או laboratory הכנה שקופיות). אם מגוון רחב של נוגדנים וfixatives נמצאים בשימוש במעבדה, מבחר השקופיות עשוי להיות מוכן מבעוד מועד ומאוחסן עד צורך. לאחר הגישה לרקמות נמטודות כבר צברה, נהלי מכתים הנוגדן פעלו בשיטות סטנדרטיות (עם incubations יותר אופייני לרקמות ולא תאים 1,11).

<table><tbody><tr><td>שקופיות פולי-L-ליזין (מותג ESCO)</td> <td>פישר</td><td>12-545-78</td><td>שקופיות המותג סיגמא מתאימות גם</td></tr><tr><td>פולי-L-ליזין הידרוברומיד</td><td>סיגמא</td><td>P1524</td><td><חזק>חשוב:</חזק> מותג ומשקל מולקולרי גבוה של שקופיות קצה חלביות בודדות קריטיות פוליליזין</td></tr><tr><td></td><td>פישר</td><td>48312-002</td><td>מותגים אחרים מתאימים</td></tr><tr><td>נתרן אזיד</td><td>סיגמא</td><td>S2002-25G</td><td>TOXIC, ללבוש כפפות ומסכה תוך כדי שקילת אבקה כדי לייצר 10% מלאי. ללבוש כפפות בעת צנרת תמיסת מלאי</td></tr><tr><td>צנצנת מכתים קופלין</td><td>VWR</td><td>47751-792</td><td>מותגים אחרים מתאימים</td></tr><tr><td>דיוור 5 שקופיות</td><td>Electron Microscopy Science</td><td>71549-01</td><td>אחד ממותגים רבים ושונים של מחזיק שקופיות קטן, מתאים לצביעה</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>VWR</td><td>MK262159</td><td><חזק>חשוב:</חזק> תמיסות פורמלין רגילות (37% פורמלדהיד) אינן מתאימות. או 1) ממיסים קריסטלין פרפורמלדהיד במאגר פוספט ומאחסנים בכמויות קטנות קפואות. או 2) לקנות פרפורמלדהיד בדרגת מיקרוסקופ אלקטרונים במיניקוטים. רעיל - ללבוש כפפות; השלך עודפי כיור למטה עם מים.</td></tr><tr><td>תמיסת גלוטראלדהיד, 25% במים</td><td>סיגמא</td><td>G 5882</td><td><חזק>חשוב:</חזק> לרכוש גלוטראלדהיד בדרגת מיקרוסקופ אלקטרונים באמפולות; רעיל - ללבוש כפפות; השלך עודפי כיור למטה עם מים.</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>VWR</td><td>EM-9410</td><td>מותגים אחרים מתאימים</td></tr><tr><td>סרום בקר אלבומין</td><td>פישר</td><td>ICN820451</td><td>מותגים אחרים מתאימים</td></tr><tr><td>סרום חמורים, ליופיליזציה</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>017-000-121</td><td>מותגים אחרים מתאימים</td></tr><tr><td>Cy3 חמור נגד עכבר IgG רב תוויות</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>715-165-150</td><td>חברה זו מומלצת לנוגדנים מרובי תוויות באיכות גבוהה (מדוללי זיקה). בחר צבע ואנטיגן מתאימים (בעל חיים המשמש להעלאת נוגדנים ראשוניים). </td></tr><tr><td>n-פרופיל גלאט</td><td>פישר</td><td>ICN10274750</td><td>מותגים אחרים מתאימים</td></tr><tr><td>DAPI, 4',6'-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride</td><td>Sigma</td><td>D 9542</td><td>TOXIC. ללבוש כפפות ולהוציא לתוך חבילות קטנות ולפזר כדי למזער את החשיפה</td></tr><tr><td>Whatman #1 מסננים בקוטר 15 ס"מ</td><td>פישר</td><td>09805G</td><td></td></tr><tr><td>Coverslip #1 1/2 מלבן 24 x 60 מ"מ</td><td>VWR</td><td>48393-252</td><td>#1 1/2 עובי הוא הטוב ביותר אופטית</td></tr><tr><td>תיקיית שקופיות מיקרוסקופ</td><td>VWR</td><td>48429-092</td><td>מותגים אחרים מתאימים</td></tr></tbody></table>

נוגדן מכתים ב<em&gt; ג elegans</em&gt; שימוש &quot;freeze-פיצוח&quot;

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

כדי להכתים ג elegans עם נוגדנים, הציפורן יחסית בלתי חדירה חייבת לעקוף בשיטות כימיות או מכאניות. &quot;להקפיא-פיצוח&quot; הוא אחת שיטות המשמשות למשוך פיזי לציפורן מנמטודות ידי דחיסת נמטודות בין שתי שקופיות חסיד, להקפיא אותם, ומושך את השקופיות לגזרים. הקפאת פיצוח מספק דרך פשוטה ומהירה כדי לקבל גישה לרקמות ללא טיפול כימי והוא יכול לשמש במגוון רחב של fixatives. עם זאת, זה מוביל לאובדן רבים של הדגימות והדחיסה הנדרשות מכאנית מעוות את המדגם. בפועל נדרש על מנת למקסם את ההתאוששות של דגימות עם מורפולוגיה טובה. הקפאת פיצוח יכול להיות מותאם לתנאים ספציפיים קיבוע, התאוששות של דגימות, או כתמים שאינם ספציפיים נמוכים, אך לא לכל הפרמטרים ובעונה אחת. לנוגדנים שדורשים תנאי קיבעון קשים מאוד ולסבול את הטיפולים הכימיים הדרושים כדי permeabilize הציפורן כימי, treatment של נמטודות השלמה בפתרון עשוי להיות מועדף. אם הנוגדן דורש תיקון קל או אם תנאי הקיבעון האופטימליים אינם ידועים, בהקפאה פיצוח מספק דרך שימושית מאוד לassay במהירות נוגדנים ויכול להניב מידע לוקליזציה subcellular והסלולרי ספציפי לאנטיגן של עניין.

כאשר תולעים הם דחוסים כמו שצריך, סדוקים, וקלילות קבועה, כמעט את כל התולעת יכולה להיות נגישה למכתים נוגדן (ראה איור 2). המיקום של הגרעינים כפי שצוין על ידי מכתים DAPI מציין איזה חלקים של התולעת הם שלמים כאשר התולעים חשופים למקבעים קשה יותר, כגון פורמלדהיד, המורפולוגיה של התולעת עלולה להיות מעוותת (כפי שניתן לראות על ידי הופעתו בצורה לא טבעית הגלי של שרירים באיורים 3A-D). בעיה נוספת נפוצה היא קיבעון או חדירה של רקמות מסוימות לא אחידים. דוגמא לכך היא...

&quot;פיצוח להקפיא&quot;, שיטה לחשיפת הרקמות הפנימיות של ג נמטודות elegans לנוגדנים ללוקליזציה חלבון, בא לידי ביטוי.

נוגדן מכתים ב<em&gt; ג Elegans</em&gt; שימוש &quot;Freeze-פיצוח&quot;

To stain C.  elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be  bypassed by chemical or mechanical methods.  "Freeze-cracking" is one ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבצע צביעה בנוגדנים ב-C. elegans. לשם כך, שוטפים את הנמטודות, פורסים אותן על למסות ודוחסים אותן בזהירות בין שתי למסות דביקות, אשר מוקפאות לאחר מכן על קרח יבש. לאחר מכן, מפרידים את הלמסות כדי לפצח את הנמטודות ומניחים אותן מיד במקבע.לאחר מכן צובעים את הנמטודות באמצעות טכניקות סטנדרטיות של צביעה בנוגדנים; ניתוח באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית חושף צביעה מוצלחת של נוגדנים בנמטודות שמירובן שלמות. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון קיבוע של נמטודות שלמות, הוא שהיא ממזערת את הטיפול הכימי בדגימה. בדרך כלל, אנשים שאינם מכירים את השיטה יתקשו בביצועה, מכיוון שהכנת השקופיות והנמטודות היא מורכבת להדגמה.בפרוצדורה ישתתפו אני ו-RTO Basu, סטודנט לתואר מתקדם מהמעבדה שלי. כדי להכין פלטות של נמטודות לצביעה, התחילו בהנחת פיסת מתכת שטוחה על קרח יבש כדי לצננה. בעזרת מים מזוקקים ופיפטת זכוכית, שטפו תולעים שגדלו על פלטת NGM אחת בקוטר 60 מילימטר עם בקטריות אל תוך מבחנת מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר. התולעים יכולים להיות מסונכרנים או בגילאים מעורבים, אך הימנעו משימוש בפלטות עם תולעים בוגרים רבים, שקשה לסדוק, או תולעים מורעבות, שירביו את האוטופלורסנציה, תוך שימוש באותה פיפטת זכוכית.שטפו את התולעים שלוש עד ארבע פעמים במים מזוקקים כדי להסיר מהן חיידקים. לאחר מכן, כדי לאסוף בעיקר תולעים בוגרות, הניחו להן להישאר על השולחן למשך שלוש עד חמש דקות. לאחר שהתולעים שקעו לתחתית המבחנה, הסירו את רוב המים מהמבחנה, כך שיישאר כמות של מים הגדולה פי שניים מנפח התולעים, אך לא פחות מ-25 µL נפח כולל.סמנו את הצד המט של שקופיות polylysine בעזרת טוש עמיד במחיקה והניחו את השקופיות על משטח העבודה לצד מיכל עם קרח יבש, כאשר הצד המסומן פונה כלפי מעלה. שקופית זו תשמש כשקופית התחתית. הכינו מספר שווה של שקופיות נקיות שאינן מטופלות ב-polylysine.השקופיות העליונות זמינות. כעת, טפטפו באמצעות פיפט כ-25 µL של תולעים במים על השקופית התחתונה להצמדה, ובעזרת צד קצה הפיפט, פזרו את התולעים על מרכז השקופית. המתינו 30 שניות עד שתי דקות עד שהן ישקעו.קצות התולעים יידבקו עם מגען בתזריר. ההיבט המאתגר ביותר בפרוצדורה זו הוא מניעת עיוות יתר של התולעים במהלך השלבים הבאים. הדרך הטובה ביותר להשיג זאת היא באמצעות סבלנות, הכנת כל הציוד מראש, והימנעות מצריכת קפאין מרובה כדי להבטיח ידיים יציבות.החזיקו את השקופית התחתונה ביד אחת, והניחו את השקופית העליונה מעליה כך שכל החלקים, למעט החלקים המטוששים, יחפפו. הנוזל אמור להפריד מעט בין השקופיות כדי שהתולעים עדיין יוכלו לנוע. אל תתנו לשקופיות להחליק זו על זו, דבר שעלול לסובב את התולעים.בשלב הבא, בעזרת האגודלים והאצבעות המורות של כל יד, לחצו בזהירות ובאופן ישר כלפי מטה על הזריקה העליונה. במידה ויופעל לחץ נכון, חלק מההרמאפרודיטים הגדולים ביותר יקרעו בקצה הזריקה. בעוד שרוב הבוגרים והזחלים יבואו במגע עם כל זריקה אך יישארו שלמים, הניחו אותן מיד ובזהירות, מבלי לאפשר לזריקות להחליק, על פיסת המתכת שעל קרח יבש. בתוך דקה אחת, הזריקות ייראו קפואות, אך השאירו אותן שם למשך חמש דקות כדי להבטיח שהן קפואות לחלוטין.השקופיות מוכנות כעת לקיבוע. אם אינכם ממשיכים בתהליך באופן מיידי, אחסנו את השקופיות בקופסה מסומנת בטמפרטורה של minus 80 degrees Celsius למשך מספר ימים. יש להשתמש בהן תוך שבוע בערך מרגע הכנתן.אין להשתמש בשקופיות לאחר אחסון לטווח ארוך. ניתן להכין נמטודות בודדות על שקופיות בשיטה דומה לזו שהודגמה קודם לכן. הניחו פיסת מתכת שטוחה על קרח יבש כדי לצנן אותה.בשלב הבא, השתמשו בפיקית תולעים כדי להעביר נמטודות בודדות לטיפת מים על מצע NGM כדי לשחרר אותן מהחיידקים. הנמטודות צריכות להיות מוזנות היטב כדי להפחית אוטופלורסנציה. במידת האפשר, חזרו על ההעברה לנקודות מים חדשות לפי הצורך, עד שהתולעת תהיה נקייה מחיידקים.בשלב הבא, הכינו את הזכוכיות העליונות והתחתונות כפי שנעשה קודם לכן. לאחר מכן, הניחו טיפה של 5 עד 10 µL מים על האזור שעובד ב-polylysine בזכוכית התחתונה, תוך כדי תצפית במיקרוסקופ. השתמשו במוט העברה לתולעים כדי להעביר עד 20 תולעים אל טיפת המים.התולעים צריכות לשקוע עד שייגעו במשטח הזכוכית הדביק. לאחר מכן, הניחו את השקופית העליונה כפי שנעשה קודם לכן, אך אל תדחסו, תוך הבטחה שהשקופיות לא יחליקו באופן מיידי. הניחו את השקופיות על המתכת שעל קרח יבש.שמרו על קרח יבש למשך 5 עד 30 דקות ועברו מיד לקיבוע. לא ניתן לאחסן את השקופיות הללו לשימוש מאוחר יותר. כדי לבצע קיבוע קל של התולעים, התחילו בהנחת צנצנות צביעה המכילות תמיסות קיבוע על קרח לקירורן למשך 10 דקות.התמיסות הדרושות הן 100% methanol, 100% acetone ו-phosphate buffered saline. קחו זוג של זכוכית כיסוי תחתית ועליונה מהקרח היבש, הפרידו ביניהן בתנועה סיבובית מהירה וטבלו מיד את הזכוכית התחתית ב-methanol קר מאוד למשך שתי דקות; השליכו את הזכוכית העליונה. לאחר מכן, העבירו את הזכוכית מה-methanol ל-acetone קר מאוד למשך ארבע דקות.אם השקופיות הכילו תולעים רבות, רובן ינשרו לתוך חומר הקיבוע גם בשקופיות שהוכנו היטב. אם שקופיות של תולע בודדת הוכנו כראוי, התולעים אמורות להישאר דבוקות. לבסוף, כדי לשטוף את חומר הקיבוע, טבלו את השקופיות בצנצנת עם PBS.השקופיות מוכנות כעת לצביעה לצורך קיבוע קשיח באמצעות פורמלדהיד או גלוטרלדהיד. התחילו בדילול תמיסת פורמלדהיד או גלוטרלדהיד בדרגת ריאגנט ב-PBS לריכוז סופי של 0.5 עד 4%. ניתן לאחסן מנות (Aliquots) בטמפרטורה של 20- עד 30- מעלות ולהפשיר לפי הצורך. זכרו, פורמלדהיד וגלוטרלדהיד הם רעילים מאוד, לכן עליכם להשתמש בכפפות ולעבוד בתוך מנדף כימי.קחו זוג זכוכיות כיסוי תחתונות ועליונות מהקרח היבש וסובבו אותן במהירות כדי להפריד ביניהן באופן מיידי. הניחו את הזכוכית התחתונה המכילה את התולעים בתוך צלחת שטוחה עם מכסה, השליכו את הזכוכית העליונה מיד והעבירו באמצעות פיפט 200 µL של חומר המקבע למרכז האזור שבזכוכית עם התולעים. חומר המקבע יקפא חלקית במקומו, ואז יימס כדי לכסות אזור רחב יותר של הזכוכית.אם התולעים אינן מכוסיות לחלוטין בחומר מקבע באופן מיידי וזהיר, הוסיפו חומר מקבע נוסף באמצעות מיקרו-פיפטה. אין לאפשר לחומר המקבע לגלוש מעבר לקצה הזריקה. הוסיפו למנה מקשרים רטובים ומקופלים ללא סיבים כדי לשמור על לחות.אין לאפשר למגבונים לגעת בلامשות. לאחר מכן, כסו את הצלחת במכסה והשאירו אותה למשך 10 דקות ועד ללילה בטמפרטורת החדר. לאחר השלמת הקיבוע, השתמשו בפיפטה כדי להעביר בזהירות את מקבע הקיבוע עם התולעים החופשיות למבחנה של 1.5 milliliter. לאחר מכן, טבלו את הלשונית בצנצנת צביעה המכילה PBS.סבב את המבחנה המכילה את התולעים במהירות גבוהה למשך 30 שניות כדי להשקיע אותן למשקע. שטוף את התולעים פעמיים ב-PBS. לאחר מכן, המשך לצביעתן במקביל לתולעים שנמצאות על הפסחית.פרוטוקול צביעת הנוגדנים דומה לפרוטוקולים סטנדרטיים עבור כל רקמה על סליידים, והוא מתואר בפירוט במסמך המצורף. לאחר הצביעה, העבירו את הסליידים ל-PBS והשאירו אותם שם עד 12 שעות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס עד למועד הסגירה. כדי לסגור את הסליידים, הוציאו סלייד מה-PBS.השתמשו בנייר ניגוב ללא סיבים כדי לייבש את הצד האחורי, ולאחר מכן הניחו אותו לזמן קצר ובמהירות על נייר סופג. טפטפו כ-20 µL של מדיום קיבוע מעל התולעים, כך שיהיו חלקים שווים בקירוב של מדיום ו-PBS על העשייה.הט את הזריקה בעדינות כדי לערבב את שני התמיסות. זהירות, חומר הקיבוע רעיל. החזק את השוליים המטושטים.הטה את העגלה כך שהתמיסה תצטבר ליד השטח המט. לאחר מכן, הנח קצה אחד של זכוכית כיסוי בגודל 24 על 60 מילימטר על התמיסה כדי למזער בועות אוויר, הגורמות להגברה של הבהרה (bleaching) ומפריעות לצפייה. הורד את זכוכית הכיסוי בעדינות.אם נוצרו בועות, הרם באיטיות את קצה זכוכית הכיסוי. לאחר מכן, ללא החלקה מעל התולעים, הנח אותה חזרה. הוסף PBS נוסף במידת הצורך כדי להעלים בועות אוויר.באמצעות מטלית נטולת סיבים, לחצו על קצוות זכוכית הכיסוי והסלייד בזהירות כדי לייבש את הדפנות. שולי הסלייד חייבים להיות גלויים מסביב לזכוכית הכיסוי ואסור שיהיו רטובים מדי. אטמו את זכוכית הכיסוי על ידי מריחת שתי עד שלוש שכבות של לק ציפורניים על הדפנות.לאחר שהזריקה אטومه היטב ויבשה, נקה את לוחית הכיסוי ואת גב הזריקה והנח אותה בתוך בארי של מחזיק זריקות. ניתן לשמור זריקות אטומות במשך מספר ימים בטמפרטורה של 4 °C או במשך מספר שבועות בטמפרטורה של 20- °C לתקופות ארוכות יותר. צביעות DAPI של DNA ורוב הצבעים הירוקים דוהים; אטום מחדש את לוחית הכיסוי בעזרת לק ציפורניים נוסף במידת הצורך, במיוחד לאחר שימוש בעדשת שקיעה בשמן.התמונות המייצגות הבאות נאספו באמצעות שקופיות שהוכנו במהלך ניסיונות הצביעה הראשונים של סטודנטים לתואר ראשון בקורס מעבדה בביולוגיה של התא. תמונה זו מציגה דוגמה לראשים של שני הרמפרודיטים בוגרים שנדחסו כראוי, נסדקו וקובעו קלות באמצעות methanol acetone. הם סומנו עם מספר נוגדנים וצבעים.במקרה זה, כמעט כל התולעת נגישה לנוגדנים. בצביעה זו, מיקום הגרעינים כפי שמוצג על ידי צביעת DPI מעיד אילו חלקים של התולעת נשמרו שלמים. כאשר התולעת נחשפת למקבע חזק יותר, כגון formaldehyde, מורפולוגיית התולעת עלולה להיהפך למעוותת.ניתן לראות זאת בתמונות אלו כמראה גלי של השרירים המוצגים באדום. בעיה נפוצה נוספת הקשורה לשימוש במקבעים קשיחים יותר היא קיבוע או חדירה לא אחידה לרקמות מסוימות. ניתן לראות זאת כאן, כאשר השריר המוצג באדום נצבע רק בחלק מהתולעת.כאן, נוכחות של צביעות אחרות, כולל DNA, המוצגת בכחול, מעידה על כך שלפחות חלק מהגוף היה נוכח. ניתן לזהות בקלות את דפוס הצביעה החלקית שנוצר עם הניסיון, כך שניתן לקבוע את כל התפלגות הצביעה גם אם תולעת בודדת מראה צביעה לא אחידה. בעיות נפוצות שנתקלנו בהן בשימוש בשיטת סדקי הקפאה (freeze cracking) תחת כל תנאי קיבוע מוצגות כאן.הבעיה הנפוצה ביותר היא פיתול של הדגימה עקב תנועה יחסית בין שתי הזכוכיות. במהלך הדחיסה, המורפולוגיה של הרקמות הצבועות מעידה על כך שגופו של התולעת פיתול ממש מאחור הבלעומית (pharynx). תמונה זו מראה גם את הבעיה של צביעת רקע הנובעת מהיצמדות של נוגדנים לציפוי הפוליליזין שעל הזכוכית.ניתן להימנע מכך באמצעות שימוש במיקרוסקופ קונפוקאלי. שימו לב שגם עם ניסיון, תולעים בודדות רבות יאבדו או יציגו חלק מהבעיות המוצגות כאן. לאחר השליטה בטכניקה, ניתן לבצע את ההכנה והקיבוע בתוך שעה ואת הצביעה בתוך יום.בעקבות הליך זה, ניתן לבצע מגוון שיטות קיבוע על מנת למטב את הצביעה עבור נוגדן ורקמה נתונים.

antibody-staining-in-c-elegans-using-freeze-cracking

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

אנו מתארים שיטה לאיתור חלבונים מתויגים fluorescently בmicrographs אלקטרונים. פלואורסצנטי הוא מקומי הראשון באמצעות מיקרוסקופ לוקליזציה תמונה המופעל על חלקי Ultrathin. תמונות אלה אז מיושר לmicrographs אלקטרונים של אותו הסעיף.

ננו פאם: לוקליזציה חלבון באמצעות מיקרוסקופ לוקליזציה תמונה מופעלת ומיקרוסקופי אלקטרונים

שפע של קולטני הנוירוטרנסמיטר אשכולות על סינפסות מאוד משפיע כוח סינפטי. שיטה זו מכמת קולטני הנוירוטרנסמיטר fluorescently שכותרתו בשלושה ממדים עם רזולוציה אחת סינפסה...

כימות אוטומטי של הקרינה סינפטית<em&gt; ג elegans</em

סרטון זה מתאר פיצוח הקפאה, שיטה להנגשת רקמות C. elegans להכתמת נוגדנים על ידי שיבוש הקוטיקולה.

פיצוח הקפאה של נמטודות: שיטה לחשיפת רקמות תולעים פנימיות להכתמה

אנו מדווחים על הליך תמציתי של הכלאה פלואורסצנטית באתרה (FISH) בבלוטת המין ובעוברים של Caenorhabditis elegans לצורך התבוננות וכימות רצפים חוזרים. צפינו וכימתנו בהצלחה שני רצפים חוזרים שונים, חזרות טלומרים ותבנית של התארכות חלופית של טלומרים (TALT).

תצפית כימות הטלומרים ו רצפים חוזרים קרינה באמצעות<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה (דגים) עם PNA בדיקות ב<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em

אנו מציגים שיטת immunofluorescence מבוסס הדמיה ללוקליזציה במרחב ובזמן של ERK הפעיל הגזור ג בלוטת מין elegans. הפרוטוקול המתואר כאן ניתן להתאים להדמיה של כל איתות או חלבון מבני ג elegans בלוטת המין, סיפק מגיב נוגדן מתאים זמין.

ניתוח במרחב ובזמן של ERK פעיל<em&gt; C. elegans</em&gt; germline

שקופים C. elegans המעי יכול לשמש"ויוו הרקמה תא" ללמוד apicobasal להן קרום ו לומן ברמה תא בודד, subcellular במהלך multicellular tubulogenesis. פרוטוקול זה מתאר כיצד לשלב תיוג סטנדרטי, אובדן-של-פונקציה גנטית/RNAi וגישות מיקרוסקופיים לנתח תהליכים אלה ברמה המולקולרית.

C. elegans המעי כמו המודל עבור המערכת לומן מורפוגנזה ו Vivo ב מקוטב ממברנה להן ברמה תא בודד: תיוג על ידי נוגדנים מכתים, ניתוח אובדן RNAi-של-פונקציה והדמיה

פרוטוקול זה מדגים כיצד לעקוב אחר חלבונים גרעיניים התקה תחת עומס חום באמצעות של זריחה ירוק (GFP) פיוז'ן חלבון כסמן ו 4', 6-diamidino-2-phenylindole (דאפי) מכתים. דאפי מכתים פרוטוקול מהיר ושומר את האותות לוקליזציה subcellular GFP וחלבון.

גילוי חלבונים לוקליזציה Subcellular על ידי ירוק פלורסצנטיות חלבון Tagging ו 4', 6-Diamidino-2-phenylindole מכתים ב Caenorhabditis elegans

פרוטוקול זה מדגים את השימוש בסדר הקירבה הצמוד כדי לבדוק את האינטראקציות של חלבון חלבון באתרו בתוך C. אלגיה germline.

באיתור באתרו של האסיפה המורכבת של ריבונאופאנפרוטאין ב -C. אלגיה germline באמצעות שיטת הסמיכות

הפרוטוקול הבא מתאר את הפיתוח והאופטימיזציה של זרימת עבודה בתפוקה גבוהה עבור גידול תולעים, הדמיה פלואורסצנטית ועיבוד תמונה אוטומטי כדי לכמת אגרגטים של פוליגלוטמין כהערכה של שינויים בפרוטאוסטזיס.

אוטומציה של כימות מצטבר ב - Caenorhabditis elegans

זוהי שיטה נפוצה עבור דיסקציה של גונאד C. elegans ואחריה סדק הקפאה, אשר מייצרת דגימות germline עבור immunofluorescence באמצעות צביעת נוגדנים, או עבור צביעת DAPI פשוטה כדי לדמיין DNA. פרוטוקול זה זכה להצלחה עבור סטודנטים לתואר ראשון במעבדת מחקר ובהתנסות מחקרית לתואר ראשון מבוססת קורסים.

ג. אלגנס גונד דיסקציה והקפאת סדק לאימונופלואורסצנציה וצביעת DAPI

מיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה יכולה לספק תובנה מפורטת על ארגון הרכיבים בתוך קומפלקס סינפטונמלי במיוזיס. כאן אנו מדגימים פרוטוקול לפתרון חלבונים בודדים של קומפלקס סינפטונמלי Caenorhabditis elegans .

מיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה במיוחד של קומפלקס סינפטונמלי בתוך נבט Caenorhabditis elegans

למדו שיטת "freeze-cracking" לצביעת נוגדנים ב-C. elegans ללוקליזציית חלבונים. הטכניקה ממזערת טיפול כימי ומאפשרת צביעה יעילה במיקרוסקופ פלואורסצנטי.

נוגדן מכתים ב

גלה סרטונים נוספים