נוגדן מכתים ב ג Elegans שימוש "Freeze-פיצוח"

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבצע צביעת נוגדנים על אלגנטיות C. לשם כך שוטפים נמטודות, מורחים על שקופיות ונדחסים בזהירות בין שתי שקופיות דבק, אשר לאחר מכן מוקפאות על קרח יבש. לאחר מכן, השקופיות מופרדות כדי לפצח את הנמטודות ומונחות מיד בקיבוע.

לאחר מכן הנמטודות מוכתמות באמצעות ניתוח טכניקות צביעה סטנדרטיות של נוגדנים על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית מגלה צביעת נוגדנים מוצלחת של נמטודות שלמות למחצה. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו קיבוע נמטודות שלמות הוא שהיא ממזערת את הטיפול הכימי בדגימה. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו מכיוון שהכנת השקופיות והנמטודות היא מעט מסובכת להדגמה.

הנוהל יהיה אני ו-RTO Basu, סטודנט לתואר שני מהמעבדה שלי כדי להכין צלחות של נמטודות לצביעה התחל בהנחת פיסת מתכת שטוחה על קרח יבש כדי לצנן אותה באמצעות מים מזוקקים ושטיפת פיפטה מזכוכית. תולעים גדלו על צלחת NGM אחת של 60 מילימטר עם חיידקים לתוך צינור מיקרו פוגה של 1.5 מיליליטר. ניתן לסנכרן את התולעים או לערבב את הגילאים, אך הימנעו משימוש בצלחות עם נדוורים רבים שקשה לפצח או תולעים מורעבות, מה שיגביר את האוטופלואורסצנטיות באמצעות אותה פיפטת זכוכית.

שטפו את התולעים שלוש עד ארבע פעמים במים מזוקקים כדי לשחרר אותן מחיידקים. לאחר מכן, כדי לאסוף בעיקר מבוגרים, תנו להם לשבת על הספסל במשך שלוש עד חמש דקות. לאחר שהתולעים התיישבו בתחתית הצינור, הוציאו את רוב המים מהצינור, והשאירו בערך פי שניים מנפח המים כתולעים, אך לפחות 25 מיקרוליטר נפח כולל.

סמן את הצד החלבי של שקופיות פוליליזין בדיו בלתי ניתן למחיקה והנח את השקופיות על הספסל ליד המיכל עם תווית קרח יבש כלפי מעלה. זה ישמש כשקופית התחתונה. יש מספר שווה של מטופלים נקיים שאינם פוליליזין.

שקופיות מובילות זמינות. לאחר מכן פיפטה כ-25 מיקרוליטר תולעים במים על מגלשת ההדבקה התחתונה, ובעזרת הצד של קצה הפיפטה, פיזרו את התולעים על מרכז המגלשה. תנו להם להתיישב במשך 30 שניות עד שתי דקות.

קצות התולעים יידבקו כשהם באים במגע. ההיבט הקשה ביותר בהליך זה הוא למנוע מהתולעים להתעוות מדי כאשר אתה מבצע את הצעדים הבאים. הדרך הטובה ביותר לעשות זאת היא להיות סבלניים, להכין הכל ולא לשתות יותר מדי קפאין כדי שהידיים שלך יהיו נחמדות ויציבות.

החזק את המגלשה התחתונה ביד אחת, הנח את המגלשה העליונה מעליו כך שכל החלקים מלבד החלקים החלביים חופפים. הנוזל צריך להחזיק את המגלשות מעט זו מזו כך שלתולעים עדיין תהיה ניידות מסוימת. אל תתנו למגלשה להחליק זו על זו, מה שיסובב את התולעים.

לאחר מכן, בעזרת האגודלים והאצבעות של כל יד לחץ בזהירות ישר כלפי מטה על המגלשה העליונה עם כמות הלחץ הנכונה, כמה מההרמפרודיטים הגדולים ביותר ייקרעו בקצה המגלשה. בעוד שרוב הבוגרים והזחלים ייגעו בכל מגלשה אך יישארו שלמים באופן מיידי ובזהירות מבלי לאפשר למגלשות להחליק, הניחו אותם על פיסת המתכת על קרח יבש. תוך דקה אחת, השקופיות ייראו קפואות, אך שמור אותן שם למשך חמש דקות כדי להבטיח שהן קפואות היטב.

השקופיות מוכנות כעת לקיבוע. אם לא ממשיכים, אחסן מיד את השקופיות בקופסה מסומנת במינוס 80 מעלות צלזיוס למשך מספר ימים. יש להשתמש בהם תוך שבוע בערך לאחר הכנתם.

אל תשתמש בשקופיות לאחר אחסון לטווח הארוך. ניתן להכין נמטודות בודדות גם על שקופיות בשיטה דומה לזו שהוצגה זה עתה כמו קודם. הניחו פיסת מתכת שטוחה על קרח יבש כדי לצנן אותה.

לאחר מכן, השתמשו במכוש תולעים כדי להעביר נמטודות בודדות לטיפת מים על צלחת NGM כדי לשחרר אותן מחיידקים. יש להאכיל היטב את הנמטודות כדי להפחית את האוטו-פלואורסצנטיות. במידת האפשר, חזור על ההעברה לנקודות מים חדשות לפי הצורך עד שהתולעת נקייה מחיידקים.

לאחר מכן, הכינו את השקופיות העליונות והתחתונות כמו קודם. לאחר מכן הניחו טיפת מים של 5 עד 10 מיקרוליטר על האזור המטופל בפוליליזין של השקופית התחתונה תוך התבוננות במיקרוסקופ. השתמש בפיק תולעים כדי להעביר עד 20 תולעים לטיפת המים.

התולעים צריכות לשקוע למטה כדי לגעת במשטח ההחלקה הדביק. לאחר מכן הנח את השקופית העליונה כמו קודם, אך אל תדחוס תוך הקפדה על כך שהמגלשות לא יחליקו מיד. הניחו את השקופיות על המתכת על קרח יבש.

המשיכו על קרח יבש במשך חמש עד 30 דקות והמשיכו מיד לקיבוע. לא ניתן לאחסן שקופיות אלה לשימוש מאוחר יותר. כדי לתקן קלות את התולעים, התחל בהנחת צנצנות מכתים המכילות תמיסות קיבוע על קרח כדי לצנן אותן למשך 10 דקות.

הפתרונות הדרושים הם 100% מתנול, 100% אצטון ותמיסת מלח עם פוספט. קח זוג מגלשות תחתונות ועליונות מהקרח היבש, סובב אותן במהירות וטבל מיד את השקופית התחתונה במתנול קר כקרח למשך שתי דקות, השליך את השקופית העליונה. לאחר מכן, העבירו את השקופיות ממתנול לאצטון קר כקרח למשך ארבע דקות.

אם בשקופיות היו הרבה תולעים, רובן ייפלו בקיבוע גם עם שקופיות מוכנות היטב. אם שקופיות תולעת בודדות הוכנו כראוי, התולעים צריכות להישאר דביקות. לבסוף, כדי לשטוף את הקיבוע, טובלים את השקופיות בצנצנת עם PBS.

השקופיות מוכנות כעת לצביעה כדי לבצע תיקון קשיח באמצעות פורמלדהיד או גלוטרלדהיד. התחל בדילול פורמלדהיד בדרגת ריאגנט או תמיסת גלוטרלדהיד ב-PBS לריכוז סופי של 0.5 עד 4% ניתן לאחסן Aliquots במינוס 20 עד מינוס 30 מעלות ולהפשיר לפי הצורך. זכרו, תמיד הפורמלדהיד והגלוטראלדהיד רעילים מאוד, אז אתם צריכים ללבוש כפפות ולעבוד במכסה אדים.

קח זוג מגלשות תחתונות ועליונות מהקרח היבש וסובב אותן במהירות מיד. הנח את השקופית התחתונה שיש בה את התולעים בכלי שטוח עם מכסה, השליך את השקופית העליונה מיד פיפטה 200 מיקרוליטר של הקיבוע מעל מרכז אזור השקופית. עם תולעים, הקיבוע יקפא חלקית במקומו, ואז יימס כדי לכסות אזור גדול יותר של המגלשה.

אם התולעים אינן מכוסות לחלוטין בקיבוע באופן מיידי ובזהירות, הוסף עוד קיבוע באמצעות מיקרו פיפטה. אל תאפשר לקיבוע לזרום מעבר לקצה השקופית. הוסף לתבשיל מגבונים רטובים מקופלים ללא מוך כדי לשמור על לחות.

אל תאפשר למגבונים לגעת בשקופיות. לאחר מכן מכסים את המנה במכסה ומשאירים אותה למשך 10 דקות למשך הלילה בטמפרטורת החדר לאחר השלמת הקיבוע, השתמשו בפיפטה כדי להעביר בזהירות את הקיבוע עם תולעים רופפות לצינור של 1.5 מיליליטר. לאחר מכן טובלים את השקופית בצנצנת מכתים המכילה PBS.

סובב את הצינור המכיל את התולעים במהירות גבוהה למשך 30 שניות כדי לגלול אותן. שוטפים את התולעים פעמיים עם PBS. לאחר מכן המשך להכתים אותם במקביל לתולעים בשקופית.

פרוטוקול צביעת הנוגדנים דומה לפרוטוקולים סטנדרטיים עבור כל רקמה בשקופיות ומתואר בפירוט במסמך הנלווה. לאחר הצביעה, העבירו את השקופיות ל-PBS ואפשרו להן להישאר שם עד 12 שעות בארבע מעלות צלזיוס עד שהן מוכנות להרכבה. כדי להרכיב את השקופיות, הסר שקופית מה-PBS.

השתמש במגבון נטול מוך כדי לייבש את החלק האחורי ולאחר מכן הנח אותו לזמן קצר על מגבת נייר במהירות. הניחו כ -20 מיקרוליטר של מדיום הרכבה מעל התולעים כך שיהיו חלקים שווים בערך של מדיום ו- PBS. בשקופית.

הטה בעדינות את השקופית כדי לערבב את שני הפתרונות. זהירות אמצעי הרכבה רעיל. מחזיק את הקצה החלבי.

הטה את השקופית כך שהתמיסה תתאסף ליד הציפוי. לאחר מכן הנח קצה אחד של החלקת כיסוי בגודל 24 על 60 מילימטר על התמיסה כדי למזער בועות אוויר המגבירות את ההלבנה ומשבשות את הצפייה. הורד את החלקת הכיסוי בעדינות.

אם אכן נוצרות בועות, הרם לאט את קצה החלקת הכיסוי. ואז מבלי להחליק על פני התולעים, הורד אותו מחדש. הוסף עוד PBS במידת הצורך כדי לחסל בועות אוויר.

בעזרת מגבון נטול מוך, דחסו את שולי החלקת הכיסוי והחליקו בזהירות לייבוש מהקצה. קצה המגלשה חייב להיות גלוי מסביב לקצה החלקת הכיסוי ולא צריך להיות רטוב מדי. אטמו את החלקת הכיסוי ומרחו שתיים עד שלוש שכבות של לק על הקצה.

לאחר שהמגלשה אטומה ויבשה היטב, נקה את החלקת הכיסוי ואת החלק האחורי של המגלשה והנח אותה בבארות מחזיק שקופיות. ניתן לשמור מגלשות אטומות ימים בארבע מעלות צלזיוס או שבועות במינוס 20 מעלות צלזיוס לתקופות ארוכות יותר. כתמים עדינים של DNA ורוב הצבעים הירוקים דוהים אוטמים מחדש את החלקת הכיסוי עם יותר לק לפי הצורך, במיוחד לאחר שימוש בעדשת טבילה בשמן.

התמונות המייצגות הבאות נאספו באמצעות שקופיות שנעשו במהלך ניסיונות צביעת הנוגדנים הראשונים של סטודנטים לתואר ראשון בקורס מעבדה לביולוגיה של התא. תמונה זו מציגה דוגמה לראשיהם של שני הרמפרודיטים בוגרים שדחוסים כהלכה, סדוקים ומקובעים קלות עם מתנול אצטון. הם סומנו במספר נוגדנים וצבעים.

במקרה זה, כמעט כל התולעת נגישה לנוגדנים. מכתים כאן, מיקום הגרעינים כפי שמצוין על ידי צביעת DPI מציין אילו חלקים של התולעת שלמים. כאשר התולעים נתונות לקיבוע קשה יותר כמו פורמלדהיד, המורפולוגיה של התולעת עלולה להתעוות.

ניתן לראות זאת בתמונות אלה כמראה גלי של השרירים המוצגים באדום. בעיה נפוצה נוספת הקשורה לשימוש בקיבוע קשיח יותר היא קיבוע או חדירה לא אחידים של רקמות מסוימות. ניתן לראות זאת כאן כאשר השריר המוצג באדום מוכתם רק בחלק של התולעת.

כאן, נוכחות של כתמים אחרים, כולל DNA, המוצגים בכחול מצביעה על כך שלפחות חלק מהגוף היה נוכח. ניתן לזהות בקלות את הדפוס המתקבל של צביעה חלקית בתרגול כך שניתן לקבוע את כל התפלגות הצביעה גם אם תולעת בודדת מראה צביעה לא אחידה. בעיות נפוצות בהן נתקלים בפיצוח הקפאה באמצעות כל תנאי קיבוע מומחשות כאן.

הבעיה הנפוצה ביותר היא פיתול הדגימה עקב תנועה יחסית של שתי השקופיות. במהלך הדחיסה כאן, המורפולוגיה של הרקמות המוכתמות מצביעה על כך שגוף התולעת מעוות רק מאחורי הלוע. תמונה זו מציגה גם את הבעיה עם צביעת רקע עקב נוגדן שנדבק לפוליליזין המצפה את השקופית.

ניתן להימנע מכך באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי. שימו לב שאפילו עם תרגול, תולעים בודדות רבות יאבדו או יראו חלק מהבעיות המוצגות כאן. לאחר השליטה, ניתן לבצע את ההכנה והקיבוע תוך שעה ולבצע את הצביעה ביום.

לאחר הליך זה, ניתן לבצע מגוון שיטות קיבוע על מנת לייעל את הצביעה עבור כל נוגדן ורקמה נתונה.