Name: Transsynaptic איתור ממטרות היקפית עם וירוס Pseudorabies אחריו רעלן כולרה ותיוג Biotinylated Dextran אמינים זוגי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-14T17:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 12 s
Description: חקור מעגלים עצביים מרכזיים המווסתים מטרות היקפיות באמצעות וירוס Pseudorabies חוצה-סינפסות וטכניקות מעקב עצבי קלאסיות. שיטה זו מאפשרת זיהוי רשתות נוירונים מופצות ואימות חיבורים ספציפיים במוח.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לד&quot;ר הטושים Terashima של אוניברסיטת קובה, יפן, להוראת טכניקת הניתוח בגרון, וד&quot;ר לין אנקוויסט של אוניברסיטת פרינסטון לאספקת PRV-ברטה. מחקר נתמך על ידי הפרס חלוץ NIH DP1 OD000448 לאריך ד ג&#39;רוויס ופרס NSF בוגר מלגת המחקר לגוסטבו אריאגה. דמויות מהעבודה קודמת זוכה כראוי משמשות תחת רישיון PLoS ONE גישה פתוחה Creative Commons (CC-BY) בהתאם למדיניות העריכה של כתב העת.

הערה: כל נהלי בעלי החיים נבדקו ואושרו על ידי הוועדה מוסדית טיפול בבעלי חיים ושימוש באוניברסיטת דיוק. וירוס 1. אחסון Pseudorabies <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אנו משיגים נגיף חי (PRV152) מהמעבדה של ד&quot;ר לין אנקוויסט באוניברסיטת פרינסטון בכייל של 1 x 10 9 pfu / מ &#39;. הפרוטוקול כדי ליצור את הווירוס כבר פורסם 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquot הווירוס ב 20 μl לכל צינור בתוך ארון בטיחות ביולוגית BSL-2 ולאחסן ב -80 ° C בתנאי בטיחות ביולוגית מתאימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפשיר aliquot של PRV מייד לפני הזרקה. </li></ol> 2. הכנת כירורגי לזריקות לתוך שריר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגרום הרדמה כללית על ידי זריקה תוך שרירית של קטמין-xylazine (100 מ&quot;ג / קילוגרם קטמין, 10 מ&quot;ג / קילוגרם xylazine) ולשמור על מטוס הרדמה מתאים באמצעות isofluorane. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להגן על הקרניות עם משחת עיניים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן tהוא אתר כירורגית על פי טכניקת aseptic ידי זמירה שיער וחיטוי האתר כירורגית עם סקראבס לסירוגין של פולידין ואלכוהול 70% (מינימום של 3 מחזורים). הקפד להשתמש בסדינים מעוקרים כדי לכסות אזורים כירורגית. הקפד לדבוק טכניקות סטרילי לאורך כל ההליכים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעשות חתך בעור ולחשוף את השרירים של עניין. לדוגמא, כדי לגשת לשרירי גרון cricothyroid יש צורך להסיר את החלק ראשון שמעליה של שריר sternohyoid. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאטום כל שרירי transected עם דבק רקמות VetBond. </li></ol> 3. הזרקה של PRV לשריר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את מערכת microsyringe 10 μl NanoFil עם פתרון PRV מופשר טרי, לצרף מחט נירוסטה 34 G, ולעגן אותה בזהירות על מכשיר stereotaxic. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאט לנקות את השטח המת ולאמת פתרון שיוצא קצה microsyringe. בטל נוזל כפסולת bioharzard. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות microp stereotaxicמכשיר ositioning למקם בזהירות את קצה microsyringe לתוך השריר של עניין ולמלא לאט השריר עד נפיחות קלה גלויה. שיעור ההזרקה ישתנה בהתאם לגודל של השריר והנפח להיות מוזרק. לדוגמא, חמש זריקות של 200 NL (סה&quot;כ μl 1) בשיעור של 4 NL / sec צריכים להיעשות בנפרד 1 דקות באותו האתר כדי למלא את שריר cricothyroid. הזז את המזרק לשריר הבא של ריבית (cricoarytenoid הרוחב במקרה זה) ולחזור על תהליך ההזרקה. לנקב כל שריר פעם אחת בלבד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחזור microsyringe אחרי חמש דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותם את ההפסקה בfascia באמצעות דבק רקמות VetBond. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי הכל הזריקות הושלמו, לסגור את הפצע באמצעות דבק רקמות VetBond. בהתאם להנחיות שלך המקומיות institional שימוש בבעלי חיים, תפרים או קליפים פצע ניתן להשתמש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צג בעלי החיים עד שכיבה sternal ולספק שיכוך כאבים, מזון, מים, ואכפת לי כנדרש על ידי yההנחיות לשימוש בבעלי חיים המוסדיים שלנו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר זמן הישרדות בניסוי נקבע (במקרה זה, 90 שעות לתייג 2 nd להזמין נוירונים בקליפת המוח), להקריב את בעלי החיים על ידי ממנת יתר pentobarbital ותנקבנה transcardially עם מי מלח 0.9% ואחריו פורמלדהיד 4% ב 0.1 M PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר ופוסט-לתקן את המוח בפורמלין 4% למשך 24 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Cryoprotect המוח בחיץ פוספט המכיל סוכרוז 30% לפחות 48 שעות. </li></ol> 4. immunochemical איתור של eGFP <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך סעיפים 40 מיקרומטר על microtome הזזה ולשמור קטעים צף ל0.1M PBS. חלקים רזים יותר, למשל 30 מיקרומטר, ניתן להשתמש כאשר מכתימים סעיפים רכובים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרוות חלקים למשך 30 דקות בשיעור של 0.3% H 2 O 2 בPBS המוגן מפני אור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסום אנטיגנים שאינם ספציפיים בסעיפים למשך 30 דקות ב PBS המכיל 0.3% Tween 20 עם סרום עז נורמלי מקיט VECTASTAIN העלית (VE ערכה). </li><li&gt; דגירה חסומה סעיפים 3.5 שעות בארנב נגד eGFP (1: 1000) ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף חלקים שלוש פעמים PBS במשך 5 דקות, ואז דגירה אותם במשך שעה 1 בנוגדנים משני עז נגד ארנב מVE ערכה ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את פתרון ABC מVE ערכה על פי הוראות היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף חלקים שלוש פעמים PBS במשך 5 דקות, ולאחר מכן להגיב להם עבור שעה 1 בפתרון ABC מVE ערכה ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף חלקים שלוש פעמים בחיץ פוספט במשך 10 דקות, ולפתח עבור 8 דקות בחיץ פוספט, pH 7.4, המכיל 0.05% DAB (3, 3&#39;-diaminobenzidine) ו0.015% H 2 O 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלקי הר בשקופיות SuperFrost פלוס ולייבש אותם באמצעות סדרת אלכוהול מדורגת (70%, 95%, 100% ובמשך 5 דקות כל אחד 100%). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקה את החלקים באמצעות שתי שטיפות קסילן (5 דקות כל אחד) וcoverslip השקופיות עם הרכבה בינונית Permount. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמונת החלקים רכובים על מיקרוסקופ. מוצר תגובת DAB insidדואר התאים אמורים להופיע חום. תמונות דיגיטליות יכולות להיות צבע ההפוך כדי להדגיש תהליכים בסדר. </li></ol> 5. הכנת כירורגי להזרקה של קליעים נותבים לאזורים במוח שהתגלו על ידי PRV איתור <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגרום הרדמה כללית על ידי זריקה תוך שרירית של קטמין-xylazine (100 מ&quot;ג / קילוגרם קטמין, 10 מ&quot;ג / קילוגרם xylazine) ולשמור על מטוס הרדמה מתאים באמצעות isofluorane. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להגן על הקרניות עם משחת עיניים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את הראש במסגרת stereotaxic מתאימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את האתר כירורגית על פי טכניקת aseptic ידי זמירה שיער וחיטוי האתר עם סקראבס לסירוגין של פולידין ואלכוהול 70% (מינימום של 3 מחזורים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעשות חתך בקרקפת ולחזור העור מעל האזור במוח של עניין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע craniotomy קטן בקואורדינטות stereotaxic המתאימות. לדוגמא, את הקואורדינטות לקליפת המוח מוטורי המחובר laryngeally זוהה על ידי התחקות PRV בהעכבר בוגר n הם 1.2 מ&quot;מ לרוחב ו -0.2 מ&quot;מ מקורי לגבחת. </li></ol> 6. הזרקה של אמיני Dextran Biotinylated למוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן אמינים 7.5% biotinylated dextran (BDA) על ידי המסת 25 מ&quot;ג BDA (10,000 מגוואט) בשנת 333 μl של תמיסת מלח סטרילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את מערכת micropipette Nanoject השנייה עם פתרון BDA מספיק לזריקות המתוכננות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאט לנקות את השטח המת ולאמת פתרון שהוא יציאת קצה micropipette. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במכשיר micropositioning stereotaxic להוריד בזהירות את קצה micropipette לאזור במוח של עניין ולהזריק לאט BDA. התאם את קצב ההזרקה תלוי בגודל של האזור כדי להיות מתויג. לדוגמא, 12 זריקות של 4.6 NL צריכים להיות הסתפקו בארבעה מקומות שונים זה מזה 0.2 מ&quot;מ (כיוון rostro- הזנב) כדי לכסות את הקורטקס המוטורי המחובר laryngeally בעכברים בוגרים. סופי נפח ההזרקה צריך להיות מותאם לפי הגודל של האזור במוח של עניין, תוך התחשבות כי תווית עלולה להתפשט מליבת ההזרקה על ידי דיפוזיה דרך רקמת המוח ולאורך התהליכים של נוירונים שכותרתו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאטום craniotomy באמצעות מלט שיניים, ולסגור את הפצע בקרקפת באמצעות דבק רקמות VetBond. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צג בעלי החיים עד שכיבה sternal ולספק שיכוך כאבים, מזון, מים, ואכפת לי כנדרש בהנחיות לשימוש בבעלי חיים המוסדיים שלך. </li></ol> 7. הזרקה של רעלן למקטע B כולרה לשריר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 1% ב מקטע רעלן כולרה (CTB) על ידי המסת 1 מ&quot;ג של CTB בשל תמיסת מלח סטרילית 100 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שישה ימים לאחר הזרקת BDA לתוך המוח, לבצע הכנה כירורגית כפי שתואר לעיל לזריקות לתוך שריר PRV. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את מערכת microsyringe 10 μl NanoFil עם פתרון CTB, לצרף מחט נירוסטה 34 G, ובזהירות לעלות אותו על מכשיר stereotaxic. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע microinjections לתוך השריר (ים) של העניין כדה בעברscribed לPRV. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צג בעלי החיים עד שכיבה sternal ולספק שיכוך כאבים, מזון, מים, ואכפת לי כנדרש בהנחיות לשימוש בבעלי חיים המוסדיים שלך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלושה ימים לאחר הזרקת CTB, להקריב בעלי החיים על ידי ממנת יתר pentobarbital וינקב transcardially עם מי מלח 0.9% ואחריו פורמלדהיד 4% ב 0.1 M PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר ופוסט-לתקן את המוח בפורמלין 4% למשך 24 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Cryoprotect המוח בחיץ פוספט המכיל סוכרוז 30% לפחות 48 שעות. </li></ol> 8. איתור של BDA וCTB באותו הסעיפים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך סעיפים 40 מיקרומטר על microtome ולשמור קטעים צף ל0.1M PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרוות חלקים למשך 30 דקות בשיעור של 0.3% H 2 O 2 בPBS המוגן מפני אור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את פתרון ABC מVE ערכה על פי הוראות היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף חלקים שלוש פעמים PBS במשך 5 דקות, ולאחר מכן להגיב להם עבור שעה 1 בפתרון ABC ב RT. </li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף חלקים שלוש פעמים בחיץ פוספט במשך 10 דקות, ולפתח עבור 8 דקות בחיץ פוספט, pH 7.4, המכיל 0.05% DAB (3, 3&#39;-diaminobenzidine), 0.015% H 2 O 2, ושל 0.05% כלוריד ניקל. מוצר תגובת DAB בתוך התאים אמור להופיע שחור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלקי בלוק למשך 30 דקות ב PBS המכילות 0.3% Tween 20 עם סרום ארנבת רגיל מקיט VECTASTAIN העלית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה חסמה חלקים לשעה 2 בעז אנטי CTB (1: 10,000) ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף חלקים שלוש פעמים PBS במשך 5 דקות, ואז דגירה אותם במשך שעה 1 בנוגדנים משני ארנב נגד עז מVE ערכה ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את פתרון ABC מVE ערכה על פי הוראות היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף חלקים שלוש פעמים PBS במשך 5 דקות, ולאחר מכן להגיב להם למשך 30 דקות בתמיסת ABC ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף חלקים שלוש פעמים בחיץ פוספט במשך 10 דקות, ולפתח לעד 8 דקות בחיץ פוספט, pH 7.4, המכיל 0.05% DAB (3, 3&quot;-diaminobenzidine) ו0.015% H 2 O 2. מוצר תגובת DAB בתוך התאים אמור להופיע חום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלקי הר בשקופיות SuperFrost פלוס ולייבש אותם באמצעות סדרת אלכוהול מדורגת (70%, 95%, 100% ובמשך 5 דקות כל אחד 100%). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקה את החלקים באמצעות שתי שטיפות קסילן (5 דקות כל אחד) וcoverslip השקופיות עם הרכבה בינונית Permount. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמונת החלקים רכובים על מיקרוסקופ. </li></ol>

<ol><li>Card, J. P., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCard%2C+JP+%22Transneuronal+circuit+analysis+with+pseudorabies+viruses.Multiple+values+selected%22">Transneuronal circuit analysis with pseudorabies viruses.Multiple values selected</a>. Unit 1.5, John Wiley & Sons Inc. Hoboken, NJ, USA. Multiple values selected 1.51-1.5.28 (2001).</li>
<li>Smith, B. N., Banfield, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudorabies+virus+expressing+enhanced+green+fluorescent+protein%3A+a+tool+for+in+vitro+electrophysiological+analysis+of+transsynaptically+labeled+neurons+in+identified+central+nervous+system+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Pseudorabies virus expressing enhanced green fluorescent protein: a tool for in vitro electrophysiological analysis of transsynaptically labeled neurons in identified central nervous system circuits.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (16), 9264-9269 (2000).</li>
<li>Aston Jones, G., Card, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+pseudorabies+virus+to+delineate+multisynaptic+circuits+in+brain+opportunities+and+limitations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Use of pseudorabies virus to delineate multisynaptic circuits in brain opportunities and limitations.</a> Journal of Neuroscience Methods. 103 (1), 51-61 (2000).</li>
<li>Pomeranz, L. E., Reynolds, A. E., Hengartner, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+biology+of+pseudorabies+virus+impact+on+neurovirology+and+veterinary+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+and+Molecular+Biology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Molecular biology of pseudorabies virus impact on neurovirology and veterinary medicine.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 69 (3), 462-500 (2005).</li>
<li>Brittle, E. E., Reynolds, A. E., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+modes+of+pseudorabies+virus+neuroinvasion+and+lethality+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Two modes of pseudorabies virus neuroinvasion and lethality in mice.</a> Journal of Virology. 78 (23), 12951-12963 (2004).</li>
<li>Reiner, A., Veenman, C. L., Medina, L., Jiao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathway+tracing+using+biotinylated+dextran+amines%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Pathway tracing using biotinylated dextran amines.</a> Journal of neuroscience. 103, 23-37 (2000).</li>
<li>Reiner, A., Honig, M. G. Neuroanatomical tract-tracing 3 (Chapter 10). Dextran Amines Versatile Tools for Anterograde and Retrograde Studies of Nervous System Connectivity. 10, 304-335 (2006).</li>
<li>Veenman, C. L., Reiner, A., Honig, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biotinylated+dextran+amine+as+an+anterograde+tracer+for+single+and+double+labeling+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Biotinylated dextran amine as an anterograde tracer for single and double labeling studies.</a> Journal of Neuroscience Methods. 41 (3), 239-254 (1992).</li>
<li>Rajakumar, N., Elisevich, K., Flumerfelt, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biotinylated+dextran+a+versatile+anterograde+and+retrograde+neuronal+tracer%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Biotinylated dextran a versatile anterograde and retrograde neuronal tracer.</a> Brain Research. 607 (1-2), 47-53 (1993).</li>
<li>Dederen, P. J. W. C., Gribnau, A. A. M., Curfs, M. H. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrograde+neuronal+tracing+with+cholera+toxin+B+subunit%3A+comparison+of+three+different+visualization+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Retrograde neuronal tracing with cholera toxin B subunit: comparison of three different visualization methods.</a> Histochemical Journal. 26 (11), 856-862 (1994).</li>
<li>Hattox, A. M., Priest, C. A., Keller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+circuitry+involved+in+the+regulation+of+whisker+movements%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Functional circuitry involved in the regulation of whisker movements.</a> The Journal of Comparative Neurology. 442 (3), 266-276 (2002).</li>
<li>Bartha, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+reduction+of+virulence+of+Aujeszkys+disease+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Magy+Allatorv+Lapja%22%5BJournal%5D)">Experimental reduction of virulence of Aujeszkys disease virus.</a> Magy Allatorv Lapja. 16, 42-45 (1961).</li>
<li>Kuypers, H., Ugolini, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viruses+as+transneuronal+tracers%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Viruses as transneuronal tracers.</a> Trends in Neurosciences. 13 (2), 71-75 (1990).</li>
<li>Grinevich, V., Brecht, M., Osten, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monosynaptic+pathway+from+rat+vibrissa+motor+cortex+to+facial+motor+neurons+revealed+by+lentivirus-based+axonal+tracing%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Monosynaptic pathway from rat vibrissa motor cortex to facial motor neurons revealed by lentivirus-based axonal tracing.</a> The Journal of Neuroscience. 25 (36), 8250-8258 (2005).</li>
<li>Miyashita, E., Keller, A., Asanuma, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Input+output+organization+of+the+rat+vibrissal+motor+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Input output organization of the rat vibrissal motor cortex.</a> Experimental Brain Research. 99 (2), 223-232 (1994).</li>
<li>Hsu, S. M., Soban, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Color+modification+of+diaminobenzidine+%28DAB%29+precipitation+by+metallic+ions+and+its+application+for+double+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Color modification of diaminobenzidine (DAB) precipitation by metallic ions and its application for double immunohistochemistry.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 30 (10), 1079-1082 (1982).</li>
<li>Hsu, S. M., Raine, L., Fanger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+avidin+biotin-peroxidase+complex+%28ABC%29+in+immunoperoxidase+techniques+a+comparison+between+ABC+and+unlabeled+antibody+%28PAP%29+procedures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Use of avidin biotin-peroxidase complex (ABC) in immunoperoxidase techniques a comparison between ABC and unlabeled antibody (PAP) procedures.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 29 (4), 577-580 (1981).</li>
<li>Wouterlood, F. G., Jorritsma Byham, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+anterograde+neuroanatomical+tracer+biotinylated+dextran+amine+comparison+with+the+tracer+Phaseolus+vulgaris+leucoagglutinin+in+preparations+for+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">The anterograde neuroanatomical tracer biotinylated dextran amine comparison with the tracer Phaseolus vulgaris leucoagglutinin in preparations for electron microscopy.</a> Journal of Neuroscience Methods. 48 (1-2), 75-87 (1993).</li>
<li>Altschuler, S. M., Bao, X. M., Miselis, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+architecture+of+nucleus+ambiguus+motoneurons+projecting+to+the+upper+alimentary+tract+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Dendritic architecture of nucleus ambiguus motoneurons projecting to the upper alimentary tract in the rat.</a> The Journal of Comparative Neurology. 309 (3), 402-414 (1991).</li>
<li>Arriaga, G., Zhou, E. P., Jarvis, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Of+mice+birds+and+men+the+mouse+ultrasonic+song+system+has+some+features+similar+to+humans+and+songlearning+birds%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Of mice birds and men the mouse ultrasonic song system has some features similar to humans and songlearning birds.</a> PLoS ONE. 7 (10), e46610(2012).</li>
<li>Card, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Practical+considerations+for+the+use+of+pseudorabies+virus+in+transneuronal+studies+of+neural+circuitry%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+and+Biobehavioral+Reviews%22%5BJournal%5D)">Practical considerations for the use of pseudorabies virus in transneuronal studies of neural circuitry.</a> Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 22 (6), 685-694 (1998).</li>
<li>Zuckerman, F. A., Zsak, L., Mettenleiter, T. C., Ben Porat, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudorabies+virus+glycoprotein+gIII+is+a+major+target+antigen+for+murine+and+swine+virus-specific+cytotoxic+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Pseudorabies virus glycoprotein gIII is a major target antigen for murine and swine virus-specific cytotoxic T lymphocytes.</a> Journal of Virology. 64 (2), 802-812 (1990).</li>
<li>Card, J. P., Enquist, L. W., Moore, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroinvasiveness+of+pseudorabies+virus+injected+intracerebrally+is+dependent+on+viral+concentration+and+terminal+field+density%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Neuroinvasiveness of pseudorabies virus injected intracerebrally is dependent on viral concentration and terminal field density.</a> The Journal of Comparative Neurology. 407 (3), 438-452 (1999).</li>
<li>Pickard, G. E., Smeraski, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravitreal+injection+of+the+attenuated+pseudorabies+virus+PRV+Bartha+results+in+infection+of+the+hamster+suprachiasmatic+nucleus+only+by+retrograde+transsynaptic+transport+via+autonomic+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Intravitreal injection of the attenuated pseudorabies virus PRV Bartha results in infection of the hamster suprachiasmatic nucleus only by retrograde transsynaptic transport via autonomic circuits.</a> The Journal of Neuroscience. 22 (7), 2701-2710 (2002).</li>
<li>Smith, G. A., Gross, S. P., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herpesviruses+use+bidirectional+fast+axonal+transport+to+spread+in+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Herpesviruses use bidirectional fast axonal transport to spread in sensory neurons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (6), 3466-3470 (2001).</li>
</ol>

לא הוכרז על ניגוד עניינים.

יש מספר נושאים שיש לקחת בחשבון בעת תכנון ניסוי באמצעות PRV152 4,21. והכי חשוב, pseudorabies הווירוס קטלני. כפי שהוזכר קודם לכן, קופים גדולים, כולל בני אדם אינם רגישים לזיהום, אך הטיפול מתאים חייב להיות מופעל כדי להגן על בעלי חיים אחרים. עכברים בוגרים לשרוד בדרך כלל 5-7 ימים לאחר חיסון עם מתח PRV152 המוחלש. לכן, PRV152 אינו מתאים לניסויים הדורשים פעמים הישרדות ארוכות יותר משבוע אחד. יתר על כן, בעלי חיים נגועים בדרך כלל להציג סימנים של מחלה בתקופת ההישרדות, וכך להגביל את ...

מעקב Transsynaptic הפך לכלי רב עוצמה המשמש לניתוח efferents המרכזי המסדירות מטרות היקפיים באמצעות מעגלים רב-סינפטי. גישה זו הייתה בשימוש נרחב ביותר במוח המכרסמים על ידי ניצול וירוס pseudorabies הפתוגן החזירים (PRV), במיוחד הזן המוחלש PRV-ברטה שתוארה לראשונה בשנת 1961 12 כאן., אנו מציגים פרוטוקול לזיהוי הייצוג בקליפת המוח המוטורי של שרירים ספציפיים או קבוצות שרירים באמצעות מתח pseudorabies רקומביננטי וירוס (PRV152) המבטא את גן כתב חלבון פלואורסצנטי ירוק המשופר (eGFP) 2. השיטה המתוארת מנצלת את ההתנהגות של וירוסי neurotropic, אשר מייצרים צאצאים זיהומיות שסינפסות הצלב להדביק נוירונים אחרים בתוך מעגל פונקציונלי 3,4,13. PRV152, שהוא isogenic עם PRV-ברטה, רק חוצה סינפסות retrogradely דרך הרצף ההיררכי של קשרים סינפטיים מאתר הזיהום 3.5 &lt;/ Sup&gt;. על ידי שליטה מדויקת באתר ההיקפי של זיהום ניתן להגביל את הכניסה של הווירוס למוח דרך משנה ספציפי של הנוירונים מוטוריים. כרצף הווירוס מדביק רשתות של תאי עצב מחוברים, וכתוצאה מכך הדפוס של אות eGFP בכל רחבי המוח לאחר מכן לפתור את הרשת של נוירונים המחוברים לתאים הנגועים בתחילה. יתרון נוסף של שימוש בוירוס למעקב עצבי הוא ההגברה של חלבון הכתב (eGFP במקרה זה) בתאים נגועים. הגברה אות זו מספקת רמת הרגישות המאפשרת זיהוי של תחזיות אפילו דלילות. לדוגמא, הקרנה דלילה מהקורטקס מוטורי vibrissa לתאי העצב מוטורי פנים השליטה השפם נמצאה בחולדות באמצעות חלבון פלואורסצנטי ירוק הביע באופן ויראלי 14; מחקרים קודמים לא הצליחו למצוא הקרנה זה באמצעות קליעים נותבים קלאסיים בלי ההגברה גן כתב 11,15. לרוע המזל, רבים וקטורי מעקב נגיפיים, כמו זה המשמש במחקר המצוטט, לא לחצות סינפסות, וכך להגביל את השימוש בם לאיתור מעגלים רב-סינפטי. תוך הצגת יתרונות ברורים לזיהוי הרשת של תאים המשתתפים במעגל מנוע, הטבע ממוינות transsynaptic התחקות עם PRV-152 הופך את פרשנות חיבורים ספציפיים בתוך המעגל הקשה. לכן, אנו מציגים שיטה פשוטה לאימות חיבורים ספציפיים בתוך מעגלים זוהו באמצעות PRV-152 על ידי דו-תיוג באמצעות אמינים biotinylated dextran (BDA) ו- B למקטע רעלן הכולרה (CTB). השימוש בשילוב של BDA וCTB הוא גישה מבוססת היטב לאיתור קשרים בין קבוצות הספציפיות של נוירונים 6-8,11. כאשר נעשה שימוש יחד, ניתן דמיינו שני קליעים נותבים אלה באותו הסעיף באמצעות DAB שני צבעים (3, 3&#39;-diaminobenzidine) הליך 16. משקל מולקולרי גבוה BDA (BDA10kDa) נבחר לפרוטוקול זה כי זה yields תיוג מפורט של תהליכים עצביים 6,7,9. יתרונות נוספים של BDA10kDa כוללים את הבאים: זה מועבר באופן מועדף בכיוון אנטרוגרדית 6-8; זה יכול להיות מועבר על ידי iontophoretic או הזרקה בלחץ 6-8; ניתן דמיין ידי HRP-biotinylated avidin פשוט (ABC) הליך זה 17; וניתן הדמיתו על ידי אור או מיקרוסקופי אלקטרונים 6,7,18. זיהוי immunochemical של CTB עם peroxidase וDAB נבחר לתיוג מדרדר של motoneurons כי הוא יעיל לגילוי תהליכים תאיים כוללים דנדריטים דיסטלי 10,19. לאחרונה השתמשו בגישה זו כדי לזהות את המסלול המוטורי הקולי בעכברים ולחשוף חיבור דליל מקליפת המוח מוטורי ראשונית לתאי העצב המוטוריים בגרון, שהונח בעבר להיעדר 20.

<table><tbody><tr><td>שם המגיב / חומר</td><td>מספר</td><td>קטלוגי</td><td>הערות</td></tr><tr><td>NanoFil מיקרו הזרקה</td><td>מכשירים מדויקים בעולם</td><td>IO-Kit</td><td>34 G</td></tr><tr><td>אפשרות מסגרת סטריאוטקסית</td><td>David Kopf</td><td>Instruments דגם 900</td><td></td></tr><tr><td>Nanoject II מזרק אוטומטי ננו-ליטר</td><td>Drummond Scientific Company</td><td>3-000-204</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוטום הזזה</td><td>Leica</td><td>SM2010 R</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>VetBond</td><td>3M</td><td>1469SB</td><td></td></tr><tr><td>איזופלואורן (פוראן)</td><td>בקסטר&nbsp;</td><td></td><td></td>1001936060</tr><tr><td>בטדין ספוגית מקל</td><td>קרדינל בריאות</td><td>2130-01</td><td>200 ספירה</td></tr><tr><td>Permount הרכבה בינונית</td><td>פישר מדעי</td><td>SP15-500</td><td></td></tr><tr><td>SuperFrost Plus שקופיות</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>אמינים דקסטרן ביוטיניליים</td><td>Invitrogen</td><td>D-1956</td><td>10,000 מגה-וואט</td></tr><tr><td>מעבדת נגיף פסאודו-כלבת</td><td>של ד"ר. לין אנקוויסט (אוניברסיטת פרינסטון)</td><td>PRV152</td><td>טיטר >1 x 107</td></tr><tr><td>anti-cholera Toxin B תת-יחידה (עז)</td><td>רשימה מעבדות ביולוגיות</td><td>703</td><td></td></tr><tr><td>כולרה טוקסין B</td><td>תת-יחידה מעבדות ביולוגיות</td><td>103B</td><td></td></tr><tr><td>Anti-eGFP</td><td>Open Biosystems</td><td>ABS4528</td><td></td></tr><tr><td>3, 3'-diaminobenzidine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5905</td><td>10 מ"ג טבליות</td></tr><tr><td>אתנול</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>E7023</td><td>200 הוכחה</td></tr><tr><td>פורמלדהיד</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>F8775</td><td>מדולל ל-4%</td></tr> <tr><td>מי חמצן</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>H3410</td><td>30%</td></tr> <tr><td>קטמין הידרוכלוריד & קסילזין הידרוכלוריד</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>K4138</td><td>80 מ"ג/מ"ל ו-6 מ"ג/מ"ל</td></tr><tr><td>ניקל כלוריד</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>339350</td><td></td></tr><tr><td>מאגר פוספט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P3619</td><td>1.0 מ'; pH 7.4</td></tr><tr><td>פוספט חוצץ מלח</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P5493</td><td>10x; pH 7.4</td></tr><tr><td>נתרן פנטוברביטל</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P3761</td><td>מינון</td></tr> <tr><td>50 מ"ג/מ"לסוכרוז</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>S9378</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Xylenes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>534056</td><td>כיתה היסטולוגית</td></tr><tr><td>VECTASTAIN Elite ABC Kit</td><td>Vector Laboratories</td><td>PK-6101 (ארנב); PK-6105 (עז)</td><td></td></tr><tr><td>משחה אופטית Optixcare</td><td>וטרינר דיפו</td><td>1017992</td><td></td></tr></tbody></table>

transsynaptic איתור ממטרות היקפית עם וירוס pseudorabies אחריו רעלן כולרה ותיוג biotinylated dextran אמינים זוגי

Transsynaptic Tracing from Peripheral Targets with Pseudorabies Virus Followed by Cholera Toxin and Biotinylated Dextran Amines Double Labeling

מעקב Transsynaptic הפך לכלי רב עוצמה המשמש לניתוח efferents המרכזי המסדירות מטרות היקפיים באמצעות מעגלים רב-סינפטי. גישה זו הייתה בשימוש נרחב ביותר במוח על ידי ניצול וירוס pseudorabies הפתוגן החזירים (PRV) 1. PRV לא להדביק קופים גדולים, כולל בני אדם, כך שזה הוא נפוץ ביותר במחקרים על יונקים קטנים, בעיקר מכרסמים. PRV152 מתח pseudorabies מבטא את חלבון פלואורסצנטי הגן המשופר הירוק (eGFP) כתב ורק חוצה סינפסות הפונקציונלית retrogradely דרך הרצף ההיררכי של קשרים סינפטיים מאתר הזיהום 2,3. יש זני PRV אחרים מאפייני מיקרוביולוגים שונים ויכולים להיות מועברים בשני הכיוונים (PRV-בקר וPRV-קפלן) 4,5. פרוטוקול זה יעסוק באופן בלעדי עם PRV152. על ידי אספקת הווירוס באתר היקפי, כגון שרירים, ניתן להגביל את כניסתם של הווירוס לתוך tהוא המוח באמצעות סדרה ספציפית של נוירונים. הדפוס וכתוצאה מכך של אות eGFP בכל רחבי המוח אז פותר את הנוירונים הקשורים לתאים הנגועים בתחילה. כטבע חילק של מעקב transsynaptic עם pseudorabies וירוס גורם לפרש חיבורים ספציפיים בתוך רשת מזוהה קשה, אנו מציגים שיטה רגישה ואמינה המעסיקה אמינים biotinylated dextran (BDA) ו- B למקטע רעלן הכולרה (CTB) למאשרים את הקשרים בין התאים המזוהים באמצעות PRV152. זיהוי immunochemical של BDA וCTB עם peroxidase וDAB (3, 3&#39;-diaminobenzidine) נבחר בגלל שהם יעילים בחושפים תהליכים תאיים כוללים דנדריטים דיסטלי 6-11.

מכתים לeGFP צריך להתחיל להראות אות חלשה בנוירונים מוטוריים ראשוניים כ 72 שעות לאחר הזרקה לתוך שריר PRV152. השכפול והתחבורה transsynaptic של וירוס הם titer- ותלוי זמן 4. כ -90 שעות לאחר ההזרקה, צביעת eGFP תגלה אות חזקה בתאים נגועים כדי 2 nd. פעמים הישרדות ארוכות יותר יגלו -3 ותאים מסדר גבוהים יותר, אך פעמים הישרדות מוגבלות על ידי הקטלני של PRV בכ -5 ימים לאחר החיסון. איור 1...

מעקב טרנס-סינפטי הפך לכלי רב עוצמה לניתוח זרמים מרכזיים המווסתים מטרות היקפיות באמצעות מעגלים רב-סינפטיים. כאן אנו מציגים פרוטוקול המנצל את נגיף הפסאודו-כלבת הטרנס-סינפטי כדי לזהות ולמקם מעגל מוחי פונקציונלי, ואחריו טכניקות מעקב דרכי קלאסיות כדי לאמת קשרים ספציפיים במעגל בין קבוצות מזוהות של נוירונים.

Transsynaptic איתור ממטרות היקפית עם וירוס Pseudorabies אחריו רעלן כולרה ותיוג Biotinylated Dextran אמינים זוגי

Transsynaptic tracing has become a powerful tool used to analyze central efferents that regulate peripheral targets through multi-synaptic circuits. This ...

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא לגלות את הרשת הפרה-מוטורית המרכזית של תאים מפוזרים המשפיעים על מטרה פריפרית ספציפית, ולאחר מכן לאשר את הקשרים הספציפיים בין תאים אלו במוח. דבר זה מושג תחילה על ידי הדבקה רטרוגרדית של המעגלים הפרה-מוטוריים באמצעות וקטור נגיפי טרנס-סינפטי המוחדר פריפרית דרך השריר. השלב השני של הפרוצדורה הוא ויזואליזציה של התאים המודבקים באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית.השלב השלישי הוא אישור קשרים ספציפיים במוח על ידי הזרקת סמני מונו-סינפטיים המכוונים לצמתים שזוהו קודם לכן במעגל פרה-מוטורי. בסופו של דבר, התוצאות יכולות להראות כיצד תאים ברשת פרה-מוטורית מבוזרת מחוברים זה לזה באמצעות שילוב של סימון ויראלי טראנס-סינפטי וטכניקות נוירו-אנטומיות מונו-סינפטיות מסורתיות. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון סימון נוירוני מונו-סינפטי מסורתי, הוא שניתן לזהות את הצמתים של רשת נוירונית מבוזרת ולפענח את הקשרים הספציפיים בין תאים ברשת זו בעכבר תחת הרדמה.הכינו את אזור הניתוח על ידי גזירת הפרווה וחיטוי העור באמצעות לפחות שלושה סבבי קרצוף לסירוגין של Betadine ואלכוהול 70%alcohol. כעת בצעו חתך בעור באזור הגרון וחשפו את השריר הרלוונטי. לדוגמה, כדי לגשת לשריר ה-cricothyroid הלרינגיאלי, יש להסיר תחילה את החלק העליון של שריר ה-Sterno hyoid ולאטום כל שריר שנקטע באמצעות דבק רקמות מסוג vet bond.כעת טען את מערכת מיקרו-מזרק ה-nano fill בנפח 10 µL עם תמיסת PR RV שהופשרה acabado. רוקן לאט את החלל המת וודא שהתמיסה יוצאת מקצה המיקרו-מזרק. השלף את הנוזל כפסולת ביולוגית מסוכנת והרכב אותו בזהירות על המכשיר הסטריאוטקסי.באמצעות התקן המיקום המיקרוסקופי, הכניסו בזהירות את קצה המחט אל השריר הרלוונטי. לאחר מכן, מלאו את השריר לאט עד להופעת נפיחות קלה. כעת העבירו את המזרק לשריר הבא, במקרה זה ה-lateral cricoarytenoid, וחזרו על הפעולה.הליך ההזרקה כולל דקירה של כל שריר. קצב ההזרקה ישתנה בהתאם לגודל השריר ולנפח להזרקה. לדוגמה, כדי למלא את השריר הקריקו-תירואידי (cricothyroid muscle), יש לבצע חמש הזרקות של 200 nanoliters בקצב של ארבעה nanoliters לשנייה, במרווחים של דקה אחת בין הזרקה להזרקה באותו אתר.לאחר נסיגת המזרק המיקרוסקופי, אטמו את הפרצה בפסציה באמצעות דבק רקמות vet bond. עם סיום כל ההזרקות, סגרו את הפצע באמצעות דבק רקמות vet bond. עקבו אחר בעל החיים עד שייראה שכיבה על החזה (sternal recumbent).לאחר מכן ספקו אלגזיה, מזון, מים וטיפול בהתאם להנחיות הרווחה לבעלי חיים של המוסד שלכם. הפרוצדורה לניתוח ביטוי EGFP ונוירונים שנדבקו ב-PRV מפורטת בטקסט של הפרוטוקול.עיבוד הרקמה דומה מאוד לזה שיסוקר בהמשך סרטון זה. התחילו בהרדמה של עכבר בוגר, תוך הגנה על עיניו וקיבוע מיקום ראשו. לאחר מכן, הכינו את אזור הניתוח כפי שפורט קודם לכן, באמצעות קרצוף לסירוגין ב-Betadine וב-70% alcohol.כעת בצעו חתך בקרקפת והסיטו את עור הקרקפת מעל המוח. אזור העניין. בצעו קרניוטומיה קטנה באמצעות המקדח בקואורדינטות הסטריאוטקסיות המתאימות.לדוגמה, הקואורדינטות עבור קליפת המוח המוטורית המחוברת לגרון, שזוהו באמצעות סימון ב-PRV בעכבר בוגר, הן 1.2 millimeters לטרלי ו-0.2 millimeters רוסטרלי ביחס ל-bgma. לאחר מכן, הכין תמיסה של 7.5% של biotinylated dextran amines במים סטריליים. לאחר מכן, טען את מערכת המיקרו-פיפט nano jet two בכמות מספקת של תמיסת BDA עבור ההזרקות המתוכננות.רוקנו באיטיות את החלל המת ותוודאו שהתמיסה יוצאת מקצה המיקרו-פיפט. בעזרת מכשיר המיקרו-מיקום, הורידו בזהירות את קצה המיקרו-פיפט אל אזור המוח הרלוונטי והזריקו באיטיות את תמיסת ה-BDA. התאימו את קצב ההזרקה בהתאם לגודל האזור המיועד לסימון.לדוגמה, יש לבצע 12 הזרקות של 4.6 nanoliters בארבעה מיקומים שונים. במרחק של 0.2 millimeters זה מזה. כדי לכסות את קליפת המוח המוטורית המחוברת לגרון (laryngeal connected motor cortex) בעכבר בוגר.יש להתאים את נפח ההזרקה הסופי לגודלו של אזור העניין. יש לקחת בחשבון שהסמן עלול להתפשט ממרכז ההזרקה דרך רקמת המוח ולאורך שלוחותיהם של נוירונים מסומנים. יש לנקות ולהרטיב את פתח הקרניוטומיה בתמיסת סליין סטרילית ולסגור את פצע הקרקפת באמצעות דבק רקמות וטרינרי (Vetbond).עקוב אחר בעל החיים עד להופעת שכיבה סטרנלית (sternal recumbent). לאחר מכן, ספק אלגזיה, מזון, מים וטיפול בהתאם להנחיות ועדת אתיקה בניסויים בבעלי חיים של המוסד שלך.ששה ימים לאחר מכן, ניתן להזריק את תת-היחידה B של רעל החולרה לשריר של בעל החיים. לאחר מכן, בתוך שלושה ימים, יש להקריב את בעל החיים לצורך אנליזה. יש לחתוך חתכים בעובי 40 microns באמצעות קריוסטט ולשמור את החתכים הצפים ב-0.1 molar PBS; יש לבצע כיבוי (quench) של החתכים באמצעות 0.3% hydrogen peroxide ב-PBS למשך 30 דקות, תוך כדי ניעור והגנה מאור.שטפו את הסגמנטים שלוש פעמים ב-PBS למשך חמש דקות לכל שטיפה. לאחר מכן, הדגישו אותם לתגובה למשך שעה בתמיסת A b, C שהוכנה טרי, בטמפרטורת החדר. כעת שטפו את הסגמנטים שלוש פעמים בבופר פוספט למשך 10 דקות לכל שטיפה.לאחר מכן, בצעו פיתוח של החתכים במשך שמונה דקות תחת ערבוב בבופר פוספט pH 7.4 המכיל DAB, מימן פחמני (hydrogen peroxide) וניקל כלוריד. תוצר תגובת ה-DAB בתוך התאים אמור להופיע בצבע שחור.בשלב הבא, חסמו את החתכים תוך כדי ניעור למשך 30 דקות ב-PBS המכיל 0.3% tween 20 עם סרום של ארנב רגיל מתוך ערכת ה-vector stain elite. לאחר מכן, דגרו את החתכים החסומים ב-goat anti CTB תוך כדי ניעור למשך שעתיים בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, שטפו את החתכים שלוש פעמים נוספות ב-PBS למשך חמש דקות לכל שטיפה.יש להחיל את הנוגדן השני אנטי-ארנב מהערכה והדגירה של החתכים תתבצע תוך כדי ניעור למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. יש לשטוף את החתכים שלוש פעמים ב-PBS למשך חמש דקות לכל שטיפה, ולאחר מכן להגיב אותם למשך 30 דקות בתמיסת A, b, C שהוכנה טרייה בטמפרטורת החדר. יש לשטוף את החתכים שלוש פעמים בבופר פוספט למשך 10 דקות ולהדגיר את החתכים למשך שמונה דקות.בתמיסת הפיתוח, תוצר תגובת ה-DAB בתוך התאים אמור להופיע בצבע חום. כעת העבירו את הנתחים למשקופיות SuperFrost Plus, בצעו דהידרטציה לרקמה באמצעות סדרת אלכוהול בריכוזים מדורגים, ולאחר מכן שתי שטיפות להבהרה ב-xylene. לאחר מכן, כסו את המשקופיות באמצעות Paramount והמשיכו לדימוג.צביעה ל-EGFP אמורה להתחיל להראות אות חלש בנוירונים מוטוריים ראשוניים 72 שעות לאחר הזרקת P RV 1 52, כאשר הצביעה תהפוך לעוצמתית לאחר 90 שעות. nucleus ambiguous זה, המכיל את הנוירונים המוטוריים הלרינגיאליים, נראה 94 שעות לאחר הזרקת P RV 1 52 לשניים משבעת השרירים הלרינגיאליים. זאת מכיוון שהנגיף חדר למוח דרך נוירונים המעצבים את השרירים המודבקים.מאגרי נוירונים מוטוריים אחרים, כגון הגרעין ההיפוגלוסלי, אינם מבטאים EGFP לאחר 90 שעות. ניתן להבחין ב-EGFP בתאים מסדר שני. נוירונים אלו של גזע המוח נצבעו בעקבות הזיהום הראשוני בגרעין העמום (nucleus ambiguous).ההזרקה הייתה חד-צדדית, ותבנית הסימון שהתקבלה בגזע המוח מראה זיהום של הגרעין האיפסילטרלי. נוירונים ביניים רטיקולריים של הגרעין הגמיה (nucleus ambiguus) והגרעין הבודד (solitary nucleus) נדבקו אף הם ונצבעו בעוצמה עבור EGFP. נוירוני ביניים אלה מחברים מבנים שונים, כולל מאגרי נוירונים מוטוריים של השרירים הלשוניים-בבוליים והגרעין הגמיה בקביעות קונטרלטרלית.עם זאת, יעדיהם האפרנטיים נותרים ללא סימון כיוון שהנגיף מתפשט רק בכיוון רטרוגרדי. זמן ההישרדות עם PRV הוא מוגבל, אך ניתן להבחין בצביעת EGFP בתאים מסדר שלישי ומעלה; נוירונים פרה-מוטוריים בקליפת המוח המוטורית הביעו EGFP בצד הנגדי לאתר ההזרקה ההיקפית. ככל הנראה, רק אוכלוסיית התאים שהרכיבה את הייצוג בקליפת המוח המוטורית של שרירי הלרינקס נדבקה.אקסונים המסומנים ב-BDA בגובה nucleus ambiguous, המסומנים בחצי חצים, יוצרים מגע עם נוירונים מוטוריים חיוביים ל-CTB שסומנו רטרוגרדית באמצעות הזרקות לשרירי הגרון (נראים בחום); האקסונים יוצרים וריקוסיטיז (varicosities) ובטונים טרמינליים משוערים בקרבת הדנדריטים של נוירונים מוטוריים של הגרון ובקרבת הסומה של נוירונים מוטוריים של הגרון. נדרשים ניסויים נוספים באמצעות מיקרוסקופיה אלקטרונית או אלקטרופיזיולוגיה כדי לקבוע אם וריקוסיטיז אלו מייצגים סינפסות. הזרקה בילטרלית של BDA שהוחדרה לקליפת המוח המוטורית המקושרת לגרון נראית בשחור; כיוון ש-BDA אינו ספציפי לכיוון, ייתכן שסימונים יופיעו הן בחיבורים אפרנטיים והן בחיבורים אפרנטיים.לדוגמה, בתלמוס ניתן לראות הן שדה היטלה של סימון אנטרוגרדי והן גופי תא שסומנו רטרוגרדית. תאי התלמוס מזוהים באמצעות ראש החץ, והקפסולה הפנימית (internal capsule) מסומנת לצורך אוריינטציה. זכרו כי עבודה עם נגיף פסאודו-חֳבֶרֶת (pseudo rabies virus) ו-DAB עלולה להיות מסוכנת ביותר, ויש לנקוט באמצעי זהירות כגון סטריליזציה.יש לחטא את כל החומרים שהיו במגע עם PRV או DAB באמצעות תמיסת אקונומיקה 10%. בעת ביצוע פרוצדורה זו, יש להקפיד תמיד על פינוי נאות של פסולת ביולוגית מסוכנת מוצקה ונוזלית בהתאם לתקנות המוסד שבו אתם פועלים.

transsynaptic-tracing-from-peripheral-targets-with-pseudorabies-virus

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

שיטה של ​​התחקות נוירונים הקשורים synaptically מתוארת. אנו משתמשים סגוליים TVA של תא במעלה זרם כדי לבחון אם אוכלוסיית תא של עניין מקבלת קלט סינפטי מסוגי תאים מוגדרים מבחינה גנטית.

איתור נגיפי של מעגלים עצביים מוגדרים גנטי

תוך ניצול אסטרטגיה גנטית בינארית אנו מספקים פרוטוקול מפורט למעקב אחר מעגלים עצביים בעכברים המבטאים עוקבים טרנס-סינפטיים משלימים לאחר רקומבינציה בתיווך Cre. מכיוון שייצור עוקבים ספציפיים לתא מקודד גנטית, הגישה הניסיונית שלנו מתאימה לחקור את היווצרותם והתבגרותם של מעגלים עצביים במהלך התפתחות המוח העוברי של עכברים ברזולוציית תא בודד.

מותנה הגנטי Transsynaptic איתור במוח העכבר עוברי

אנו מתארים טכניקה לתייג נוירונים והתהליכים שלהם באמצעות זריקות אנטרוגרדית או נותב מדרדר לגרעיני מוח באמצעות הכנה במבחנה. אנחנו שונה בשיטה הקיימת שלי n המבחנה electroporation נותב על ידי ניצול של שכותרתו fluorescently מוטציות עכבר וציוד אופטי בסיסי כדי להגדיל את דיוק תיוג.

Explants מוח מונחי לייזר עצבי איתור ב

סרטון זה מציג את הליך הגולגולת המאפשר הדמיה כרונית של נוירונים בקליפת המוח הרטרו-טחולית של העכבר באמצעות מיקרוסקופ פוטונים שני פוטונים in vivo בקו טרנסגני Thy1-GFP. גישה זו משולבת עם הזרקת נגיף הקשור לאדנו המבטא mCherry לתוך ההיפוקמפוס הגבי. טכניקות אלו מאפשרות ניטור ארוך טווח של פלסטיות מבנית תלוית ניסיון ב-RSC.

שני פוטונים סימולטני<em&gt; In vivo</em&gt; הדמיה של תשומות Synaptic ויעדי Postsynaptic בקליפת עכבר Retrosplenial

פרוטוקול זה מתאר שחזורים בקנה מידה גדולה של אוכלוסיות נוירונים סלקטיבית, שכותרתו בעקבות זיהום מדרדר עם וירוס כלבת מהונדס להביע סמני ניאון, ואשכול עצמאי, ללא דעות מוקדמות מנתח המאפשר אפיון מקיף של מדדים מורפולוגיים בין subclasses העצבית ברורה.

שחזור בקנה מידה גדול ועצמאי, Clustering משוחדת בהתבסס על מדדי מורפולוגי לסווג נוירונים באוכלוסיות סלקטיבי

כאן, אנו מציגים פרוטוקול מעודן לחשוף ביעילות biotinylated לתוספי אמין (BDA) תיוג עם פלורסנט צביעת שיטת דרך מסלול עצבי הדדיים. היא מתאימה לניתוח המבנה קנס של BDA תיוג, המבדיל אותו רכיבים עצביים אחרים תחת מיקרוסקופ סורק לייזר קונפוקלי.

שיפור היישום של משקל מולקולרי גבוה Biotinylated לתוספי אמין עבור היטל Thalamocortical עקיבה בחולדה

אנו מתארים של assay אופטי עבור שלפוחית סינפטית (SV) מיחזור בנוירונים בתרבית. שילוב פרוטוקול זה עם תרביות תאים כפול לבטא סמן presynaptic וחלבון עניין מאפשר לנו לאתר אתרי presynaptic, שלהם שלפוחית סינפטית מיחזור קיבולת, ולקבוע את תפקידו של החלבון עניין.

וזמינותו אופטי למיחזור שלפוחית סינפטית בנוירונים בתרבית Overexpressing חלבונים Presynaptic

הפרוטוקול הנוכחי מדגים שיטה פשוטה להתחקות אחר תחזיות גלוטמט אזור טגמנטלי גחוני (VTA) להיפוקמפוס. פוטוטימולציה של נוירונים גלוטמט VTA שולב עם הקלטת CA1 כדי להדגים כיצד מסופי גלוטמט VTA לווסת CA1 קצב ירי פירמידלי putative ב vivo.

מעקב אנטומי ותפקודי משולב של מסופי גלוטמט באזור הגונטם הגחמני בהיפוקמפוס

כאן אנו מציגים פרוטוקול המתאר התמרה ויראלית של אזורי מוח בדידים עם מבנים אופטוגנטיים כדי לאפשר אפיון אלקטרופיזיולוגי ספציפי לסינפסה בפרוסות מוח של מכרסמים חריפים.

אקס ויוו חקירה אופטוגנטית של העברה סינפטית ארוכת טווח ופלסטיות מקליפת המוח הקדם-מצחית האמצעית ועד קליפת המוח האנטורינלית הלטרלית

באמצעות עכברים פלואורסצנטיים מהונדסים, מתוארים פרוטוקולים מפורטים להערכת הובלה אקסונאלית in vivo של אנדוזומים איתות ומיטוכונדריה בתוך אקסונים מוטוריים וחושיים של העצב הסיאטי השלם בחיות חיות.

הרחבת ערכת הכלים להדמיית In Vivo של תחבורה אקסונלית

דימות טומוגרפיה טורית של שני פוטונים (STPT) היא טכניקה לדימוי מסה של רקמה בצורתה התלת-ממדית על ידי שילוב של דימות דו-פוטוני עם בקרת במה אוטומטית וחיתוך מיקרוטום. כאן אנו מתארים פרוטוקול ליישומו עבור מוחות מרמוסטים כדי להבין טוב יותר את התכונות המבניות שלהם.

טומוגרפיה טורית של שני פוטונים של כל המוח המרמוסטי לניתוחים נוירואנטומיים

חקור מעגלים עצביים מרכזיים המווסתים מטרות היקפיות באמצעות וירוס Pseudorabies חוצה-סינפסות וטכניקות מעקב עצבי קלאסיות. שיטה זו מאפשרת זיהוי רשתות נוירונים מופצות ואימות חיבורים ספציפיים במוח.

Transsynaptic איתור ממטרות היקפית עם וירוס Pseudorabies אחריו רעלן כולרה ותיוג Biotinylated Dextran אמינים זוגי

גלה סרטונים נוספים