Transsynaptic איתור ממטרות היקפית עם וירוס Pseudorabies אחריו רעלן כולרה ותיוג Biotinylated Dextran אמינים זוגי

המטרה הכוללת של הליך זה היא לגלות את הרשת הקדם-מוטורית המרכזית של תאים מבוזרים הפוגעים במטרה היקפית ספציפית ולאחר מכן לאשר את הקשרים הספציפיים בין תאים אלה במוח. זה מושג על ידי הדבקה ראשונה בנסיגה של המעגלים הקדם-מוטוריים בווקטור ויראלי טרנס-סינפטי המועבר באופן היקפי דרך השריר. השלב השני של ההליך הוא הדמיית התאים הנגועים במיקרוסקופ פלואורסצנטי אור.

השלב השלישי הוא לאשר קשרים ספציפיים במוח על ידי הזרקת עוקבים סינפטיים מונוסים המכוונים לצמתים שזוהו בעבר במעגל קדם-מוטורי. בסופו של דבר, התוצאות יכולות להראות כיצד תאים ברשת קדם-מוטורית מבוזרת מחוברים זה לזה באמצעות שילוב של מעקב ויראלי טרנס-סינפטי, וטכניקות נוירו-אנטומיות מסורתיות מונוס-סינפטיות. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו מעקב נוירולוגי סינפטי מסורתי, הוא שניתן לזהות את הצמתים של רשת עצבית מבוזרת ולפתור את הקשרים הספציפיים בין תאים ברשת זו על עכבר מורדם.

הכן את מקום הניתוח על ידי גזירת השיער וחיטוי העור עם לפחות שלושה קרצוף לסירוגין של בטדין ו-70% אלכוהול. כעת בצע חתך בעור באזור הגרון וחשוף את שריר העניין. לדוגמה, כדי לגשת לשריר הגרון של בלוטת התריס, יש צורך להסיר תחילה את החלק המכסה של שריר ההיואיד של סטרנו לאטום את כל השרירים המועברים עם דבק רקמת קשר וטרינרי.

לאחר מכן טען את מערכת המיקרו מזרקים של 10 מיקרוליטר מילוי ננו עם פתרון PR RV שזה עתה הופשר. נקה לאט את השטח המת וודא שהתמיסה יוצאת מקצה מזרק המיקרו. השליכו את הנוזל כפסולת ביולוגית מסוכנת והרכיבו אותו בזהירות על המכשיר הסטריאוטקסי.

בעזרת מכשיר המיקום המיקרו, הנח בזהירות את קצה המחט לתוך שריר העניין. לאחר מכן מלאו לאט את השריר עד שנראית נפיחות קלה. כעת העבירו את המזרק לשריר העניין הבא, הקריקואריטנואיד הרוחבי במקרה זה וחזרו על הפעולה.

הליך ההזרקה רק מנקב כל שריר. פעם אחת קצב ההזרקה ישתנה בהתאם לגודל השריר ולנפח שיש להזריק. לדוגמה, חמש זריקות של 200 ננוליטר בקצב של ארבעה ננוליטר לשנייה צריכות להתבצע בהפרש של דקה אחת באותו אתר כדי למלא את שריר הקריקותירואיד.

לאחר החזרת מזרק המיקרו, אטמו את השבר בפאשיה באמצעות דבק רקמות וטרינר. לאחר סיום כל הזריקות יש לסגור את הפצע באמצעות דבק רקמות וטרינר. עקוב אחר החיה עד שהיא מראה שכיבה של עצם החזה.

לאחר מכן ספק משככי כאבים, מזון, מים וטיפול כנדרש על ידי בעל החיים המוסדי שלך. השתמש בהנחיות שימוש. ההליך לניתוח ביטוי EGFP ונוירונים נגועים ב-PRV מכוסה בפירוט בפרוטוקול הטקסט.

עיבוד הרקמות דומה מאוד לזה שסוקר בהמשך הסרטון הזה. התחל בהרדמת עכבר בוגר המגן על עיניו וקבע את מיקום ראשו. לאחר מכן הכינו את אתר הניתוח כפי שתואר קודם לכן עם קרצוף לסירוגין של בטדין ו-70% אלכוהול.

כעת בצע חתך בקרקפת והחזר את הקרקפת מעל המוח. אזור עניין. בצע כריתת גולגולת קטנה עם המקדחה בקואורדינטות הסטריאוטקסיות המתאימות.

לדוגמה, הקואורדינטות לקליפת המוח המוטורית המחוברת לגרון שזוהו על ידי מעקב PRV בעכבר בוגר הן 1.2 מילימטרים לרוחב ו-0.2 מילימטר רוסטרלי ל-bgma. לאחר מכן, הכינו תמיסה של 7.5% של אמיני דקסטרן ביוטיניליים במים סטריליים. לאחר מכן טען את מערכת הננו סילון שני מיקרו פיפטה עם מספיק תמיסת BDA להזרקות המתוכננות.

נקה לאט את השטח המת וודא שהתמיסה יוצאת מקצה המיקרו פיפטה. בעזרת מכשיר המיקום המיקרו, הורד בזהירות את קצה המיקרו פיפטה לאזור המוח המעניין והזריק לאט את תמיסת ה-BDA. התאם את הקצב בהתאם לגודל האזור שיש לסמן.

לדוגמה, יש לבצע 12 הזרקות של 4.6 ננוליטר בארבעה מקומות שונים. 0.2 מילימטרים זה מזה. Stro coddle כדי לכסות את קליפת המוח המוטורית המחוברת לגרון בעכבר בוגר.

יש להתאים את נפח ההזרקה הסופי בהתאם לגודל אזור העניין. יש לזכור שהתווית עשויה להתפזר מליבת ההזרקה דרך רקמת המוח ולאורך התהליכים של נוירונים מסומנים. יש לנקות ולהרטיב את הגולגולת עם מי מלח סטריליים ולסגור את פצע הקרקפת באמצעות דבק רקמות וטרינר.

עקוב אחר החיה עד שהיא מראה שכיבה של עצם החזה. לאחר מכן ספק משככי כאבים, מזון, מים וטיפול כנדרש על ידי בעל החיים המוסדי שלך. השתמש בהנחיות שימוש.

שישה ימים לאחר מכן, ניתן להזריק תת-יחידה B של רעלן כולרה לשריר החיה. לאחר מכן, בעוד שלושה ימים, יש להקריב את החיה לניתוח. חותכים קטעים ב-40 מיקרון על קריוסטט ושומרים קטעים צפים ב-0.1 מולארי PBS מרווים את החלקים עם 0.3% מי חמצן ב-PBS למשך 30 דקות עם טלטול ומוגן מפני אור.

שטפו את החלקים שלוש פעמים ב-PBS למשך חמש דקות בכל כביסה. לאחר מכן הגיבו אותם במשך שעה בתמיסה טרייה שהוכנה A b, C בטמפרטורת החדר. כעת יש לשטוף את החלקים שלוש פעמים במאגר פוספט למשך 10 דקות לכל כביסה.

לאחר מכן פתח את החלקים במשך שמונה דקות עם תסיסה במאגר פוספט. pH 7.4 המכיל מי חמצן DAB וניקל כלוריד. תוצר תגובת ה-DAB בתוך התאים אמור להיראות שחור.

לאחר מכן חסום את החלקים תוך כדי ניעור במשך 30 דקות ב-PBS המכיל 0.3% טווין 20 עם סרום ארנב רגיל מערכת העילית של כתמי וקטור. לאחר מכן, דגרו את החלקים החסומים בעז אנטי CTB עם ניעור במשך שעתיים בטמפרטורת החדר. לאחר מכן שטפו את החלקים שלוש פעמים נוספות ב-PBS למשך חמש דקות לכל כביסה.

מרחו את הנוגדן המשני של אנטיגו הארנב מערכת ה-VE ודגרו על החלקים תוך כדי ניעור במשך שעה בטמפרטורת החדר. שטפו חלקים שלוש פעמים ב-PBS למשך חמש דקות לכל שטיפה ולאחר מכן הגיבו אותם במשך 30 דקות בתמיסת A, b, C שהוכנה טרייה בטמפרטורת החדר. שוטפים חלקים שלוש פעמים במאגר פוספט למשך 10 דקות ומדגרים את החלקים למשך שמונה דקות.

בתמיסת הפיתוח, תוצר תגובת ה-DAB בתוך התאים אמור להיראות חום. כעת הרכיבו את החלקים על סופר כפור בתוספת מגלשות על המגלשות, ייבשו את הרקמה באמצעות סדרת אלכוהול מדורגת, ולאחר מכן שתי שטיפות ניקוי בקסילן. לאחר מכן כסו את השקופיות עם פרמאונט והמשיכו בהדמיה.

צביעה עבור EGFP אמורה להתחיל להראות אות חלש בתאי עצב מוטוריים ראשוניים 72 שעות לאחר הזרקת P RV 1 52 כאשר הצביעה הופכת חזקה לאחר 90 שעות. גרעין מעורפל זה, המאכלס את הנוירונים המוטוריים של הגרון, נראה 94 שעות לאחר הזרקת P RV 1 52 לשניים מתוך שבעת שרירי הגרון. מכיוון שהנגיף נכנס למוח דרך נוירונים המעצבבים את השרירים הנגועים.

מאגרי נוירונים מוטוריים אחרים כגון הגרעין ההיפוגלוסלי אינם מבטאים EGFP לאחר 90 שעות. ניתן לראות EGFP בתאים מסדר שני. נוירונים אלה בגזע המוח הוכתמו לאחר ההדבקה הראשונית בגרעין מעורפל.

ההזרקה הייתה חד צדדית ודפוס התווית שהתקבל בגזע המוח מראה זיהום של הגרעין המקביל. גרעין מעורפל ובודד בין נוירונים רשתיים נדבקו גם הם והכתים חזק עבור EGFP. נוירונים בין-עצביים אלה מחברים מבנים שונים כולל מאגרי הנוירונים המוטוריים והגרעין הנגדי. רב-משמעי.

עם זאת, המטרות הבולטות שלהם נשארות ללא תווית מכיוון שהנגיף מתפשט רק בכיוון הנסיגה. זמן ההישרדות עם PRV מוגבל, אך יכול להראות צביעת EGFP בתאים מסדר שלישי ומעלה שנדבקו בנוירונים קדם-מוטוריים בקליפת המוח המוטורית המבטאים EGFP נגדי לאתר ההזרקה ההיקפי. יש להניח שרק אוכלוסיית התאים שהרכיבה את הייצוג המוטורי של שרירי הגרון נדבקה.

אקסונים מסומנים BDA ברמת הגרעין מעורפל המסומן בראשי חץ, יוצרים קשר עם הנוירונים המוטוריים החיוביים של CTB המסומנים על ידי זריקות לשרירי הגרון הנראים בחום האקסונים יוצרים דליות ואלות טרמינליות משוערות ליד הדנדריטים של נוירונים מוטוריים גרוניים וליד הסומה של נוירונים מוטוריים גרוניים. נדרשים ניסויים נוספים באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים או אלקטרופיזיולוגיה כדי לקבוע אם דליות אלה מייצגות סינפטיות. הזרקה דו-צדדית של BDA המונחת לקליפת המוח המוטורית המחוברת לגרון נראית בשחור מכיוון ש-BDA אינו ספציפי לכיוון, ניתן לסמן גם חיבורים אפרנטיים וגם חיבורים משפיעים.

לדוגמה, גם שדה הקרנה של תווית אנטרוגרדית וגם גופי תאים המסומנים על ידי נסיגה נראים בתלמוס. תאים תלמיים מזוהים על ידי ראש החץ והקפסולה הפנימית מסומנת להתמצאות. אל תשכח שעבודה עם נגיף כלבת פסאודו ו-DAB יכולה להיות מסוכנת ביותר ואמצעי זהירות כמו עיקור.

כל החומרים שהיו במגע עם PRV או DAB באמצעות תמיסת אקונומיקה של 10%. תמיד יש לנקוט בסילוק הולם של פסולת מוצקה ונוזלית מסוכנת ביולוגית על פי תקנות המוסד שלך בעת ביצוע הליך זה.