שימוש במערכת מעקב תלת מימד אוטומטית לתיעוד פרטים ושל דגי זברה בוגרים

המטרה הכללית של הליך זה היא לחקור את דפוסי התנועה התלת-ממדיים של דגי זברה או בעלי חיים מימיים אחרים, ולנתח את המאפיינים הקינמטיים, המרחביים והחברתיים שלהם. דבר זה מאפשר זיהוי של התנהגויות משתנות עקב מוטציות גנטיות או גורמים כימיים וסביבתיים. זאת מבצעים תחילה על ידי כיול המערכת, אשר מתקן גם את עיוות התמונה המשמעותי הנוצר כתוצאה משבירה.

השלב השני הוא הקלטת פריימים של וידאו ברזולוציה זמנית גבוהה יחסית משתי זוויות שונות לפחות בו-זמנית. לאחר מכן, התוכנה משחזרת את מסלולי התנועה של הדגים. אלגוריתמים מתקדמים מיושמים כדי להפחית את השפעת הרעש ולהסיק את מיקומו של דג כאשר מתרחשת הסתרה או התקבצות.

השלב הסופי הוא לנתח את הנתונים ולבצע ניתוח סטטיסטי עבור תאוצת המהירות, זווית הפנייה, התפלגות אופקית ואנכית בתוך מיכל התצפית, מרחקים בין פרטים ופרמטרים אחרים בעלי עניין. בסופו של דבר, מעקב תלת-ממדי מכויל במהירות גבוהה הוא שימושי לחקר גירעונות התנהגותיים בדגי זברה מוטסים ולהשפעות של תרופות על מערכות התנהגותיות מגוונות. לצורך גילוי תרופות, יתרון אחד של המערכת הוא שהיא מאפשרת לחקור את התנהגות הדגים בתלת-ממד.

דבר זה חשוב מכיוון שדגים נעים באופן טבעי בשלושה ממדים, וכאשר מקליטים מספר דגים בו-זמנית, הקלטה בדו-ממד עלולה להטעות מאוד בבדיקת התצורות המרחביות של הקבוצה. יתרון נוסף של המערכת הוא שהיא מתקנת שבירה של אור, אשר אם לא תתוקן, עלולה להוביל לשגיאות מדידה משמעותיות בתצורתה הנוכחית. מיכל התצפית המכיל את דגי הזברה ממוקם בתא התצפית.

התא כולל גם מצלמה, מראה, התלויה בזווית של כ-45 מעלות מעל המכל, וסרגלי תאורת LED. לפני ההקלטה, יש לכייל את המערכת כדי לקבוע את מיקומי דפנות המכל ופני המים ואת מקדם קנה המידה של הפריימים המוקלטים, וכן לתקן את השגיאה הנובעת משבירה של האור בעבורו מהמים לאוויר. לאחר השלמת הכיול, יש לבצע הרצה ניסיונית עם דג דמי.

יש לבצע כיול מחדש אם מיקומי המראה או המצלמה אינם מדויקים או אם קיימות בעיות במעקב. כדי להתחיל סשן הקלטה, הניחו את כלי התצפית הממולא במים עד לסימונים בתוך תא התצפית. יש להכניס את רגלי הכלי לחורי היישור.

כוון את המכלים כך שהדפנות החצי-שקופות או האטומות יפנו לצד הרחוק ולימין, כפי שנראה מהמצלמה. לאחר מכן, הדלק את התאורה בתא, הכנס את הדגים למכל וסגור את הווילונות. פתח את מודול ההקלטה, ותמונות של המבט הקדמי והעליון של המכל יופיעו על המסך.

בתחילה, ייתכן שהתמונה שהתקבלה לא תהיה אידיאלית, ולכן היא עשויה לדרוש התאמה מסוימת כדי להשיג ניגודיות מספקת בין הדג לרקע. כדי להתאים את התמונה, בחרו בבקרת המצלמה (camera control), ולאחר מכן בחלון ההגדרות הכלליות שייפתח, בטלו את סימוני תיבות הבחירה המוצגות כאן, ואז כווננו את המהירות של התריס (shutter) ואת ההגבר (gain) כך שהתמונה לא תהיה חשופה מדי. לאחר מכן, בצד שמאל של חלון בקרת המצלמה, בחרו באיזון לבן (white balance color), ובחלון החדש בטלו את סימון תיבת ה-auto וכוונו את ערכי האדום והכחול כדי להשיג את ניגודיות הצבעים הטובה ביותר הן במבט מהחזית והן במבט מלמעלה.

ייתכן שיהיה צורך בביצוע מספר התאמות נוספות לאחר השלמת ההתאמות הראשוניות. מהתפריט הראשי של מודול ההקלטה, בחרו במיקום הנתונים (data location) כדי ליצור או לבחור תיקייה. לכל הקלטה צריכה להיות תיקייה משלה, אשר תהיה תיקיית משנה של תיקיית הניסוי.

כעת לחצו על "start recording" והזינו מספר שלם עבור משך ההקלטה בדקות, לאחר מכן לחצו על "okay" ומפגן ההקלטה הניסויי יתחיל. לאחר סיום ההקלטות, העתיקו והדביקו את נתוני מיכלי בעלי החיים ואת תיקיות המשנה של נתוני ההתאמה מתיקיית הכיול לתיקיות שנוצרו קודם לכן במהלך ההקלטה. כדי להתחיל בשחזור המסלול, פתחו את מודול המסלול (trajectory module) בתוכנה. לאחר מכן לחצו על "data location" כדי לבחור את התיקייה שנוצרה באמצעות מודול ההקלטה.

בשלב הבא, לחצו על כפתור הגדרות המערכת (system setup) כדי לפתוח תחילה את חלון הפרמטרים, והתאימו את ספי thresholds לצבע במבט מלמעלה ומלמטה. ערך התחלה מומלץ הוא 1000. לאחר מכן, בחרו את ספי thresholds לגודל במבט מלמעלה ומלמטה.

גודל התחלתי מומלץ עבור דג זברה בגודל בינוני הוא 10, או השתמשו ב-20 עבור דג גדול וב-5 עבור דג קטן. ככל שספי השמיעה אלו יהיו גבוהים יותר, כך תפחת הסבירות שהתוכנה תזהה רעש. עם זאת, בערך גבוה מדי, ייתכן שהיא לא תצליח לזהות את הדג.

ייתכן שיהיה צורך להתאים מחדש את הספים הללו בהמשך הניסוי. עבור סף הגודל העליון, ערך של 3000 הוא בדרך כלל מספיק. ועבור אורך ספציפי, השאירו את ערך ברירת המחדל 220.

מספר הדגים מתייחס למספר הדגים במיכל התצפית. מספר הנקודות המקסימלי (Max numb of points) מתייחס למספר הפריימים הכולל; רשמו או זכרו מספר זה ולחצו על Okay. לאחר מכן, בחרו ב-acquire background.

בחלון הבא תתבקש למלא שני שדות. לאחר טעינת הרקע, כוון את שלושת התיבות האדומות באמצעות העכבר; התיבות מסמנות את האזורים שבהם התוכנה מחפשת את הדגים. קטן את התיבה השמאלית.

מאחר שמבט הצד משמש רק לכיול, לחצו כעת על כפתור תחילת יצירת המסלולים ותהליך שחזור הנתיב יתחיל. באופן אידיאלי, יש להניח את התג על תמונת הדג; אם התג מונח לעיתים קרובות באופן שגוי, פתחו את חלון המידע. כאן אנו רואים מקרה אידיאלי שבו נראים רק קווי המתאר של הדג.

במקרה של רעש מוגבר, לחצו על stop בתפריט הראשי ובחרו ספי thresholds של צבע וגודל חדשים. כמו כן, בדקו אם ניתן לצמצם מעט את התיבות האדומות. לדוגמה, בחלק העליון, כדי להוציא רעש הנובע מתנועות מים, עקבו אחר המסלול במסך ה-3D.

באמצעות לחיצה ימנית בעזרת העכבר, החוקר יכול לבחור בין סיבוב לבין העתקה של התצורה התלת-ממדית. כדי להתחיל בעיבוד נתונים, פתח את מודול עיבוד הנתונים, בחר ב-project בסרגל הכלים, ולאחר מכן מתוך התפריט הגליל, בחר ב-new והזן שם לניסוי. לאחר מכן, בחר ב-edit project.

לאחר מכן, הוסיפו לפרויקט, ולאחר מכן קבוצה חדשה, ומלאו שם עבור הקבוצה הניסויית. כעת בחרו את הקבוצה הניסויית בחלון הימני. שימו לב שסרגל הכלים ישתנה.

בחרו ב-edit group, לאחר מכן ב-add to group, ואז ב-new measurements. פעולה זו תפתח חלון דפדפן. בשלב הבא, פתחו את התיקייה שנוצרה במהלך ההקלטה, בחרו את תיקיית המשנה trajectories ולאחר מכן את קובץ ה-point smoothened.

בדוגמה המוצגת כאן עבור קבוצה A, נטענו שישה קבצים ועבור קבוצה B ארבעה קבצים. כדי להתחיל בניתוח, בחרו את הקובץ שהוחלק (smoothened) בחלון הימני. לאחר מכן, בחרו בתפריט הנפתח ב-data processing וב-single value endpoints.

כדוגמה, בחרו בקיפאוּת למשך זמן מסוים (duration freezing). ייפתח חלון שבו ניתן להגדיר את הקיפוא במונחים של סף מהירות וסף משך זמן, כדי להכיר את התוכנית. נסו דוגמאות אחרות, כגון התפלגות עומק מרחק הנסיעה (travel distance depth distribution), המאפשרת לקבוע את מספר רמות העומק ואת תדירות הפריצה (burst frequency).

בעת בחירה באפשרות זו, עיבוד באצווה באמצעות סף ברירת מחדג של כ-200 נקודות קצה יחושב בהקשר זה. ברירת מחדג פירושה שהמפרידים הוגדרו. לדוגמה, כעת התפלגות העומק מחושבת עבור שלושה מפלסי עומק וההתפלגות הזוויתית מחושבת עבור ארבעה חלקים.

לאחר יצירת הפרמטרים, ייפתח חלון חדש המבקש את המיקום ואת שם הקובץ שייווצר. אלו יישמרו בפורמט CSV וניתן לייבא אותם לתוכנות אחרות. כאן, איור A מראה פריים לדוגמה טיפוסי עבור ביקורת.

דגי זברה, בעוד שתמונה B מראה מסגרת דוגמה טיפית עבור דגי זברה שטופלו ב-MK 801, שניהם הוקלטו במהלך סשן בוקר. שימו לב שדגי הזברה שבקבוצת הביקורת היו קרובים לתחתית וצמודים זה לזה. לעומת זאת, דגי הזברה שקיבלו MK 801 היו קרובים לחלק העליון ושחו במרחק ניכר זה מזה.

כאן מוצגים שני מסלולים מייצגים עבור דגי זברה בביקורת ודגי זברה שטופלו ב-10 µM MK 801, עבור מפגש בוקר ומפגש אחר הצהריים. באיור זה מוצגים מרחקים חברתיים ממוצעים עבור קבוצת הביקורת ודגים שטופלו ב-10 µM MK 801 עבור שני המפגשים, וכאן מוצגים צמרי הזמנים של המרחקים הממוצעים בין הפרטים עבור שתי הקבוצות.

כאן באיור A, אנו רואים את התהלוּת של דגי הזברה לאורך 10 רמות עומק שוות עבור סשן הבוקר, וב-B, את התהלוּת עבור סשן אחר הצהריים. כאן נראית התהלוּת הזמנית על פני ארבעת האזורים הרדיאליים של הקבוצות הניסיוניות. התמונה המוכנסת מראה את מיקומי האזורים הללו מהמרכז אל הפריפריה, וכאן אנו רואים את התהלוּת הזמנית על פני ארבעת הרביעים של הקבוצות הניסיוניות.

התמונה המוכנסת מראה את מיקום הרביעים. קווים כפולים מייצגים קירות לבנים, וקווים בודדים מייצגים קירות שקופים. המצלמה ממוקמת משמאל לתמונה המוכנסת, כלומר קרובה יותר לרביעים אחד וארבעה.

כוכביות שחורות מסמנות השוואות בין הקבוצות מהסשן של הבוקר, וכוכביות אפורות מסמנות השוואות בין הקבוצות מהסשנים של אחר הצהריים. לבסוף, רכיבי X, Y, Z של מרחק הנסיעה עבור דג הזברה במהלך סשנים של הבוקר ואחר הצהריים מוצגים כאן. מוצגים ממוצע וטעות תקן של הממוצע.

בעת עבודה עם המערכת, זכרו כי איכות הנתונים תלויה אך ורק באיכות ההקלטה, לכן ודאו שהמערכת מכוילת היטב ושהגדרות המצלמה אופטימליות. שאר התהליך הוא פשוט, וזהו רק עניין של הכרות עם השלבים השונים.