ראפיד פרוטוקול להכנת Electrocompetent חיידקי Escherichia ו Vibrio cholerae

המטרה הכוללת של הליך זה היא לייצר חיידקים מוכשרים במהירות ובנוחות באותו יום. הם נחוצים לשינוי. זה מושג על ידי ציפוי החיידקים תחילה על אגר LB ודגירה שלהם במשך ארבע עד שש שעות.

לאחר מכן, הדשא החיידקי נקצר בזהירות מעל פני האגר, והגלולה מושעה מחדש במים קרים סטריליים או במאגר. לאחר מכן נשטף כדור החיידקים שלוש פעמים בארבע מעלות צלזיוס ומושעה מחדש ב -40 מיקרוליטר. לבסוף, התאים המוסמכים עוברים אלקטרופוטציה בנוכחות DNA.

בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות המראות רמות של טרנספורמציה חיידקית דומות לאלו המתקבלות בשיטה המסורתית הדורשת ציוד רב, כמויות גדולות של תרביות חיידקים ומאגרים סטריליים. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני השיטות הקיימות הוא שניתן להכין חיידקים טריים ומוכשרים כמעט מכל זן מעבדה באותו יום בו מתוכנן השינוי ללא צורך בצנטריפוגות גדולות, רוטורים או מובילים של חוצצים ותרביות סטריליות. לא ניתן לזהות את המקור של פרוטוקול זה מכיוון שהוא שימש ואופטימיזציה על ידי חוקרים רבים לאורך זמן.

השיטה המוצגת כאן נמצאת בשימוש במעבדות שלנו כבר כמעט שני עשורים, ומטרתנו היא לחלוק את הפרוטוקול השימושי הזה עם עמיתינו. הדגמה חזותית של שיטה זו חשובה לשלב אחד. בפרט, איסוף החיידקים מהדשא על המקדחה מכיוון שנדרשת עין ניסיון כדי להעריך את הצמיחה על הצלחת.

ואת זה הכי טוב להמחיש. מדגימה את ההליך גב' תרזה ברוקס, עוזרת מחקר מהמעבדה של ד"ר טה קוסקי באוניברסיטת אלברטה באדמונטון, קנדה. כדי להתחיל בהכנת תרבית חיידקים בשעות אחר הצהריים המאוחרות, השתמש בכמות קטנה של אי קולי או v coray כדי לחסן 1 עד 5 מיליליטר של מרק LB חיטוי במבחנות זכוכית סיליקט סטריליות.

הכניסו את המבחנות המחוסנות לתוף רולר ודגרו למשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ובמהירות גבוהה. הכן מפזר תאים בצורת מקל הוקי ממוט זכוכית על ידי חימום אמצע המוט בלהבה של מבער בונסן עד שהזכוכית מתרככת. לאחר מכן השתמש בפינצטה או בצבת כדי לכוון בעדינות את העיקול לזווית של 135 מעלות.

מחממים את המוט פעם נוספת בנקודת האמצע בין הקצה לעיקול הראשון וכופפים אותו בזווית של 45 מעלות פנימה. מכינים מאווררים lb עם ובלי אנטיביוטיקה ומאחסנים בארבע מעלות צלזיוס. למחרת בבוקר.

צלחת 100 מיקרוליטר של תרבית לילה על כל צלחת אגר LB. בעזרת מפזר התאים, דגרו את הצלחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך ארבע עד שש שעות או עד שנראה מדשאה דקה של גידול חיידקים. בעזרת לולאת חיסון קצרו מסת חיידקים בקוטר של כשני מילימטר מהצלחת והחזירו אותה למיליליטר אחד של קור קרח.

שני מילי-מולרי סידן כלורי. אם משתמשים ב-v coray או במים מזוקקים כפולים סטריליים לאי קולי באמצעות צנטריפוגה מקוררת המוגדרת בארבע מעלות צלזיוס, סובב את התרחיף למשך חמש דקות בחום של 5,000 גרם.השליכו את הסופרנטנט וחזרו על הכביסה פעמיים נוספות. לאחר הסרת ה-supernatant resus הסופי, השעו את הגלולה ב-40 מיקרוליטר סידן כלורי או מים מזוקקים כפולים והמשיכו על קרח.

כדי לבצע טרנספורמציה, הוסף עד מיקרוגרם אחד של DNA פלזמה לתרחיף החיידקים של 40 מיקרוליטר, והעביר את התערובת לפער סטרילי מקורר מראש של 0.2 סנטימטר. לכן, הכנס את הווט לתא האלקטרופורציה של מודול בקרת הדופק ואכל ב-1.8 קילו-וולט ו-25 מיקרו phs. קבוע הזמן צריך להיות כ-5.0 אלפיות השנייה ולא אמורה להתרחש קשתות.

השעו במהירות את התאים במיליליטר אחד של מרק LB והעבירו למבחנה מזכוכית צלייה בעבר. אפשר לתאים להתאושש על ידי דגירה בתנאי גידול מוגזים ב-37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות ללא בחירת אנטיביוטיקה. צלחת את החיידקים על צלחות LB ager עם אנטיביוטיקה ודגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.

כפי שמוצג כאן, ביצענו קבוצה של טרנספורמציות עם מערך e coli ו-V co כדי להשוות את יעילות הטרנספורמציה של המתודולוגיה המהירה שלנו עם התאמה של השיטה המסורתית שתוארה במקור על ידי Doer et al להכנת חיידקים בעלי יכולת אלקטרו. תפוקת הטרנספורמציה הייתה בטווח של 10 מתוך השישית עד 10 מתוך ה-CFUs השביעיים למיקרוגרם של טווח DNA בשלושה, ניסויי שכפול עבור e coli ו-v coray. שימוש בשיטה המסורתית למיומנות חשמלית.

הכנת התאים, תפוקת הטרנספורמציה נראתה ירדה פי עשרה ל-10, לחמישית, ל-10 ל-CFU השישי למיקרוגרם DNA בשלושה ניסויי שכפול עבור אי קולי ו-v coray בשיטה המהירה. מסיבה זו, קבענו את אחוז החיידקים שעברו טרנספורמציה על ידי חלוקת CFUs שעברו טרנספורמציה במספר CFUs ששוחזרו מהתמרות מדומה מקבוצות זהות של תאים מוכשרים. אחוז החיידקים שעברו טרנספורמציה היה בתוך בול עץ אחד.

ללא קשר לשיטת ההכנה והמינים שעברו טרנספורמציה. תוצאות אלה מצביעות על כך שהיעילות של השיטה המהירה דומה לזו של ההליך המסורתי הארוך יותר של הכנת תאים מוכשרים, וכי הזנים המייצגים של ieo, coray ו-esia coli מתאימים באותה מידה להליך המהיר. לאחר השליטה, טכניקה זו יכולה להיעשות תוך חמש עד שש שעות, ולבצע אותה כראוי.

בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לקצור את החיידקים בשלב הלוגריתמי של הצמיחה שלהם, לשטוף אותם בתמיסת מי חיץ סטרילית, טריים ומקוררים מראש ולשמור אותם קרים עד להשעיה מחדש ב-LB לאחר האלקטרופורציה. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לייצר במהירות תאים ספציפיים לזן חיידקים מוכשרים אלקטרו במעבדה שלך על ידי טיפוחם על מדשאת הפתיחה, איסוףם במהלך השלב הלוגריתמי של הצמיחה, ולאחר מכן שטיפתם במאגר קר כהכנה לאלקטרופורציה.