Name: חוץ גופייה הכנה של נוירונים enteric המבודדים וגליה ממקלעת Myenteric של העכבר הבוגר (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-07T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 34 s
Description: למדו הכנה של תרבית תאים מעורבת של נוירונים וגליה מהמקלעת Myenteric בעכבר בוגר. שיטה זו מאפשרת חקר תפקודי תאים בודדים במערכת העצבים המעיים באמצעות אלקטרופיזיולוגיה ואימונוהיסטוכימיה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המכון הלאומי לבריאות גרנט DA024009, DK046367 &amp; T32DA007027.

כל הטיפול בבעלי החיים ופרוצדורות היו בהתאם ובאושר על ידי הטיפול בבעלי החיים המוסדיים ועדת שימוש באוניברסיטת וירג&#39;יניה. 1. הכנת coverslips הזכוכית פולי-D-ליזין וLaminin מצופה סטריליים ב24 גם צלחות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כל הנהלים לשלב 1 מבוצעים בתנאים סטריליים; מתחת למכסת מנוע, ועם חומרים כימיים סטריליים. coverslips זכוכית והמים deionized כפולים (DDH 2 O) צריכים להיות מעוקרים מראש. הכנת צלחות ניתן לעשות עד שבועיים לפני בידוד תא עצב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מתחת למכסה המנוע, להשתמש במלקחיים סטריליים למקום coverslips זכוכית autoclaved ב12 בארות של צלחת 24 באר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את מניית פולי-D-ליזין מבעוד מועד. הוסף 50 מ&quot;ל של ddH2O סטרילי עד 5 פולי-D-ליזין מ&quot;ג. וורטקס וחנות ב3 aliquots מ&quot;ל ב -20 ° C. הפשירי aliquots לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לריכוז סופי של מניית פולי-D-ליזין 1 מ&quot;ל לכל 25 ס&quot;מ 2: 80 פיפטה μlמניית של פולי-D-ליזין על גבי כל כוס coverslip (2 2 ס&quot;מ). תנו פתרון להתפשר על 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר ואקום באמצעות פולי-D-ליזין ולשטוף coverslips 3x עם סטרילי DDH 2 O. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר צלחות להתייבש במשך לפחות שעה 2 מתחת למכסת המנוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחות עשויות להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס או - 20 מעלות צלזיוס לפני שתמשיך לציפוי laminin. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את מניית laminin מבעוד מועד. הפשירי laminin על קרח ולשמור על קרח בעת השימוש. לדלל את ריכוז של 50 מיקרוגרם / מ&quot;ל; לשים לב לריכוז הרבה, כל מגרש יהיה שונה. בהתאם לריכוז רב, כ 20 מיליליטר DDH 2 O יתווסף לכל בקבוקון של laminin. Aliquot (5 מ&quot;ל) ולאחסן ב -80 ° C. הפשירי aliquots על קרח לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> coverslips מעיל עם 5 מיקרוגרם / 2 ס&quot;מ; laminin μl פיפטה 200 מניות laminin על כל coverslip. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה פתרון laminin על coverslips במשך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב פתרון laminin שנותר ולשטוף coverslips פעם אחת עםDDH 2 O. הימנע מגירוד פני השטח של coverslips. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחות לאחסן ב 4 מעלות צלזיוס למשך עד שבועיים. </li></ol> 2. הכנה מראש של Neuron פתרונות בידוד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את פתרון קרבס (מ&quot;מ: 118 NaCl, KCl 4.6, 1.3 אא 2 PO 4, 1.2 MgSO 4, 25 NaHCO 3, 11 גלוקוז, ו2.5 CaCl 2). מקום 13.79 גרם NaCl (FW 58.44), 0.686 גרם KCl (FW 74.55), 0.312 גרם לאא 2 PO 4 (FW 120), .289 גרם MgSO 4 (FW 120.4), 4.20 גר &#39;NaHCO 3 (FW 84.01), גרם גלוקוז 3.96 (FW 180.2), ו0.555 גרם CaCl 2 (FW 111) ב2 ליטר DDH 2 0. לצנן עד 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן לשטוף תקשורת (F12 תקשורת עם 10% עוברי שור בסרום (FBS) ואנטיביוטיקה / antimycotic): לבקבוק 500 מ&quot;ל של F12 תקשורת, להוסיף 50 מ&quot;ל FBS ו5 מ&quot;ל של נוזל אנטיביוטי 100x / antimycotic (Gibco). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תקשורת נוירון enteric (Neurobasal מדיה עם B-27, L-גלוטמין,, Neurotr 2 מ&quot;מ 1% FBS 10 ng / ml, גליה נגזרפקטור ophic (GDNF), ונוזלי 100x אנטיביוטיקה / antimycotic). כדי להפוך את מניית GDNF, להוסיף 1 מיליליטר ddH2O לGDNF מיקרוגרם 10 ולהקפיא בחזרה ב50 aliquots μl, חנות ב -80 ° C. לבקבוקון 50 מ&quot;ל של תקשורת נוירון השלם, לשלב 47.5 מ&quot;ל Neurobasal מדיה, 50 מניות 1 מיליליטר B-27 (50x), 500 FBS μl, 500 μl 200 מ&quot;מ L-גלוטמין (Gibco) μl GDNF ו500 אנטיביוטי / μl נוזלי 100x antimycotic. תקשורת נעשית בקבוצות קטנות 50 מ&quot;ל על מנת להבטיח טריות GDNF וכדי למנוע זיהום של כמויות גדולות של תערובת תקשורת סלולארי יקרה זה. </li></ol> 3. קציר הכנת מקלעת שריר / Myenteric אורכית (LMMP) מעכברים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אתיקה לאומית ומוסדית מתאימה צריכה להיות במקום לפני ביצוע ניסויים בבעלי חיים. עכברים וובסטר שוויצרי למבוגרים במשקל מעל 25 גרם (בדרך כלל מעל 8 שבועות של גיל) הם שוכנו בקבוצות של 6 לפני ניסויים. רקמות משני עכברים המשמשות לבידוד של נוירונים enteric ileal וגליה ושלושה עכברים משמשיםבידוד של תאי מעי הגס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את אזור ניתוח. אסוף את המספריים קטנים כירורגיות, מלקחיים זווית, צמר גפן, שלוש כוסות זכוכית 200 מ&quot;ל, ומוט זכוכית / פלסטיק (מכחול). ודא כי כל הציוד נשטפים ביסודיות ושטף לפני השימוש כדי למזער את הזיהום. צעד זה יכול להתבצע ביום שלפני הניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח פתרון קרבס על קרח ואת הבועה עם carbogen (חמצן 95%, 5% CO 2) במשך לפחות 30 דקות כדי לייצב את רמת החומציות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל ציוד שונים וכימיקלים חמים לייצב בטמפרטורות רצויות; אמבט מים חום (ים) עד 37 מעלות צלזיוס צנטריפוגות מגניבה, עד 4 מעלות צלזיוס, מקום הפתרון של האנק מאוזן מלח (HBSS) וטריפסין 0.5% באמבט מים (37 מעלות צלזיוס ). תקשורת נוירון השלמה ומדיה לשטוף צריכה להישאר בקירור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קרח קר מקום 150 מ&quot;ל בעבע קרבס בשלוש כוסות זכוכית 200 מ&quot;ל שכותרתו &#39;מלוכלכת&#39;, &#39;נקי&#39;, ו &#39;LMMP&#39;. כוס בועה שכותרתו &#39;LMMP&#39; עם carbogen. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות אישור מועדת אתיקה, להרדים מ &#39;ouse על ידי נקע בצוואר רחם או במשותף מחנק 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם את העכבר בrecumbence הגבי על פני השטח, עור נקי כירורגית עם EtOH 70%, ולהרים את עור בטן באמצעות מלקחיים. בעזרת מספריים, חלל בטן פתוח ולחשוף את איברי עיכול פנימיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את האורך של מערכת העיכול על ידי הרמת חלק של מעי ומגלה לפדרו. חיתוך באמצעות לפדר עם מספריים כדי להסיר בעדינות ולפענח מעי ומעי גס, נזהר שלא למשוך לפדר מהמעי / המעי הגס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר באורך המלא של מעי נפרם, הסר את המעי על ידי חיתוך דרך המעי הדיסטלי ולקיבת פרוקסימלי לcecum. הערה: הליך זה יכול גם להתבצע עם רקמת המעי הגס על ידי הסרת המעי הגס דיסטלי לcecum להפרוקסימלי ל פי הטבעת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רקמות ניתן לחלוקה נוספת בין מעי גס הפרוקסימלי ודיסטלי, וjejenum, ומעי. שאר הליך זה יתייחס לבידוד של המעי; לאהוא התהליך זהה לבידודה של LMMP מעי גס. הנח את כל המעי במכל זכוכית עם הקרח הקר קרבס מסומן &#39;מלוכלך&#39;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ליצור כלי לניקוי המעי; בוטה מחט גדולה 20 G באמצעות אבן הגשה ולצרף אותו למזרק גדול (10 מ&quot;ל) המכיל קרח קר קרבס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לנקות את צואה מהמעי על ידי חתך המעי לשלוש או יותר חתיכות גדולות. הסר סעיף ileal מהכוס ומניח את המחט הקהה לסוף פיסת ileal. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות תריץ את קרבס דרך סעיף הבטן עד שכל החומר צואתי יוסר לתוך מיכל פסולת נפרד. הנח את הסעיף ניקה לתוך המכל של קרבס המסומן &quot;נקי&quot;. חזור על פעולה עד כל המעי הוא ניקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להסיר LMMP, לחתוך את המעי למקטעים קטנים, כ 4 - 2 ס&quot;מ. הנח קטע של מעי בפלסטיק או מוט זכוכית; מעי צריך להתאים מלבב, אבל לא יהיה רופף או מתוח (~ 2 מ&quot;מ). בגין הסרת LMMP בעדינות על ידי הסרת פיסות לפדר עדיין לצרףאד לדרכים (GI) במערכת העיכול באמצעות מלקחיים. למנוע את מערכת העיכול ממסתובב סביב מוט בעדינות על ידי הצמיד לצינור המוט באמצעות האגודל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפרד LMMP מהשריר מעגלי הבסיס; ראשון לשפשף בעדינות את הקצה של המלקחיים לאורך כל הקו שבו לפדר צורף, מלמעלה עד למטה של ​​המגזר, בעדינות יוצר פער בשריר האורכי. ואז בעדינות להקניט אחד את השריר האורכי באמצעות מקלון צמר גפן רטוב עם קרבס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מתחיל בחלק העליון של הפער בשריר האורכי ולהקניט מרחק באמצעות שבץ האופקי הקל תוך הפעלת לחץ קל מאוד עד שהשריר האורכי רק מתחיל להיפרד מהשריר המעגלי; לעשות את זה לאורך כל הרצועה לאורך נקודת החיבור לפדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ואז בעדינות מתחיל לעקוף את צינור העיכול; נע מלמעלה למטה ובחזרה כמו השריר האורכי מופרד לאט מהשריר המעגלי כל הדרך סביב הצינור. כאשר שלם,LMMP יבוא ממני באופן טבעי את השארית של צינור העיכול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים הרצועה דקה כתוצאה של שריר האורכי בכוס המסומנת &quot;LMMP &#39;. חזור על פעולה עבור כל המגזרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שכל הרצועות של LMMP כבר נאספו מעכבר אחד, חזור על תהליך עבור כל עכברים אחרים בשימוש. יש לשטוף היטב את הכוסות &#39;מלוכלכות&#39; ו &#39;נקיות&#39; לפני השימוש חוזר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את LMMP 3x להסיר זיהום ביולוגי. מלא שלושה 2 מ&quot;ל אפנדורף צינורות עם הקרח הקר קרבס. מניחים את רצועות LMMP בצינור הספין הראשון במשך 30 שניות ב356 XG בצנטריפוגה מקורר 4 ° C. מוציא בזהירות את supernatant עם טפטפת ולהעביר את רצועות LMMP לצינור מלא נקי קרבס הבא. חזור על תהליך זה עבור כל צינור הנותר. </li></ol> 4. תקציר LMMP <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את פתרון עיכול על ידי הצבת 13 מ&quot;ג collagenase סוג 2 ו 3 מ&quot;ג BSA בcarbogen-בעבע פתרון 10 מ&quot;ל קרבס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מגזרי מקום LMMP השטוף לפתרון עיכול וscis שימושsors כדי לגזור LMMP לחתיכות קטנות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקציר LMMP למשך 60 דקות ב 37 מעלות צלזיוס באמבט מים עם שייקר בזמן שמבעבע בעדינות עם carbogen. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר העיכול יושלם, לאסוף תאים על ידי צנטריפוגה ל8 דקות ב 356 XG בצנטריפוגה מקורר 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכאן ולהבא צריכים לעשות את כל ההליכים בתנאים סטריליים במכסת מנוע תרבית תאים! כל חומרים כימיים ומכלי צריכים להיות מעוקרים לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך צנטריפוגה, להכין פתרון טריפסין 0.05% על ידי הצבת 1 מ&quot;ל חימם טריפסין 0.25% ו 4 מ&quot;ל חימם HBSS לתוך צינור תא 50 מיליליטר סטרילי תרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר צנטריפוגה, להסיר ולהשליך supernatant. לא להשתמש בשואב אבק, זה כנראה יהיה למצוץ את התא גלולה עקב מהירויות נמוכות צנטריפוגה. מוציא בזהירות את התא גלולה והמקום לתוך צינור נקי עם 5 מ&quot;ל של תמיסת טריפסין 0.05%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעכל את התאים בתמיסת טריפסין 0.05% באמבט מים 37 מעלות צלזיוס עם הרעד במשך 7 דקות. לא תעלה על 7 ק&quot;מn טיפול טריפסין מוחלט או נוירונים יאבדו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנטרל טריפסין עם 10 מ&quot;ל של תקשורת לשטוף קרה אחרי 7 דקות של הטיפול בטריפסין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה תאים ל8 דקות ב 356 x גרם. להסיר ולסלק תקשורת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך צנטריפוגה, לאזן את קטע של רשת Nitex עיקור על גבי תא צינור 15 מ&quot;ל סטרילי תרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר צנטריפוגה, להסיר ולהשליך supernatant. בעדינות תערובת תאי resuspend ידי triturating ב3 תקשורת נוירון שלמה מ&quot;ל. הימנע מיצירת בועות אוויר בשלב זה וכל הצעדים העתידיים שבו תערובת תא triturated. צריך לעשות את כל triturations בעדינות רבה. פתרון תא סינון דרך Nitex הרשת לתוך צינור 15 מיליליטר תרבית תאים הנקי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אופציונלי: צינור תרבית תאים שווי ומניח במיקסר חולה בקירור (או כל מיקסר המספק סיבוב) עם גלגול והטיה עדינים למשך 30 דקות. שלב זה הוא אופציונלי, אך מומלץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אופציונלי: לאחר מיקסר חולה, להוסיף 2 תקשורת לשטוף קרה מ&quot;ל לשטוף את התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף תאים על ידי צנטריפוגה (8 דקות, 356 XG). להסיר ולהשליך supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend תאים ב-1,200 תקשורת נוירון המלאה μl. Triturate תאים בעדינות באמצעות קצה פיפטה פלסטיק 1 מ&quot;ל. לא ליצור בועות אוויר. פיפטה לאט ובעדינות עד שרוב הגושים שבורים ותאים מושעים לנוזל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 750 μl של מדיה מלאה לכל אחת מהבארות המכילות 12 coverslip זכוכית מצופה מראש ולהוסיף 100 μl של פתרון תא triturated. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה נוירונים בתרבית תאי חממה ב 37 ° C עם 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שינוי מחצית התקשורת הסלולרי כל 2 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנוירונים הם מוכנים להקלטות אלקטרו לאחר 1 - 2 ימים בתרבות. </li></ol>

<ol><li>Furness, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+enteric+nervous+system+and+neurogastroenterology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Gastroenterol.+Hepatol%22%5BJournal%5D)">The enteric nervous system and neurogastroenterology.</a> Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol. 9 (5), 286-294 (2012).</li>
<li>Gershon, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+enteric+nervous+system%3A+A+second+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Hosp.+Pract.+%28Minneap%29%22%5BJournal%5D)">The enteric nervous system: A second brain.</a> Hosp. Pract. (Minneap). 34 (7), 31-32 (1999).</li>
<li>Gershon, A. A., Chen, J., Gershon, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+of+lytic%2C+latent%2C+and+reactivating+varicella-zoster+virus+infections+in+isolated+enteric+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">A model of lytic, latent, and reactivating varicella-zoster virus infections in isolated enteric neurons.</a> J. Infect. Dis. 197, 61-65 (2008).</li>
<li>Wakabayashi, K., Mori, F., Tanji, K., Orimo, S., Takahashi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+the+peripheral+nervous+system+in+synucleinopathies%2C+tauopathies+and+other+neurodegenerative+proteinopathies+of+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Acta.+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Involvement of the peripheral nervous system in synucleinopathies, tauopathies and other neurodegenerative proteinopathies of the brain.</a> Acta. Neuropathol. 120 (1), 1-12 (2010).</li>
<li>Hirst, G. D., Holman, M. E., Spence, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+types+of+neurones+in+the+myenteric+plexus+of+duodenum+in+the+guinea-pig%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Two types of neurones in the myenteric plexus of duodenum in the guinea-pig.</a> J. Physiol. 236 (2), 303-326 (1974).</li>
<li>Clerc, N., Furness, J. B., Bornstein, J. C., Kunze, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+of+electrophysiological+and+morphological+characteristics+of+myenteric+neurons+of+the+duodenum+in+the+guinea-pig%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Correlation of electrophysiological and morphological characteristics of myenteric neurons of the duodenum in the guinea-pig.</a> Neuroscience. 82 (3), 899-914 (1998).</li>
<li>Rugiero, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+whole-cell+currents+by+patch+clamp+of+guinea-pig+myenteric+neurones+in+intact+ganglia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Analysis of whole-cell currents by patch clamp of guinea-pig myenteric neurones in intact ganglia.</a> J. Physiol. 538 (Pt. 2), 447-463 (2002).</li>
<li>Jessen, K. R., Saffrey, M. J., Baluk, P., Hanani, M., Burnstock, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+enteric+nervous+system+in+tissue+culture.+III.+studies+on+neuronal+survival+and+the+retention+of+biochemical+and+morphological+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">The enteric nervous system in tissue culture. III. studies on neuronal survival and the retention of biochemical and morphological differentiation.</a> Brain Res. 262 (1), 49-62 (1983).</li>
<li>Smith, T. H., Grider, J. R., Dewey, W. L., Akbarali, H. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphine+decreases+enteric+neuron+excitability+via+inhibition+of+sodium+channels%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Morphine decreases enteric neuron excitability via inhibition of sodium channels.</a> PLoS One. 7 (9), e45251(2012).</li>
<li>Abdo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enteric+glial+cells+protect+neurons+from+oxidative+stress+in+part+via+reduced+glutathione%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Enteric glial cells protect neurons from oxidative stress in part via reduced glutathione.</a> FASEB J. 24 (4), 1082-1094 (2010).</li>
<li>Aube, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+enteric+neurone+phenotype+and+intestinal+functions+in+a+transgenic+mouse+model+of+enteric+glia+disruption%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Changes in enteric neurone phenotype and intestinal functions in a transgenic mouse model of enteric glia disruption.</a> Gut. 55 (5), 630-637 (2006).</li>
<li>Bassotti, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enteric+glial+cells+and+their+role+in+gastrointestinal+motor+abnormalities%3A+Introducing+the+neuro-gliopathies%5BTitle%5D)+AND+%22World+J.+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">Enteric glial cells and their role in gastrointestinal motor abnormalities: Introducing the neuro-gliopathies.</a> World J. Gastroenterol. 13 (30), 4035-4041 (2007).</li>
<li>Neal, K. B., Parry, L. J., Bornstein, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strain-specific+genetics%2C+anatomy+and+function+of+enteric+neural+serotonergic+pathways+in+inbred+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Strain-specific genetics, anatomy and function of enteric neural serotonergic pathways in inbred mice.</a> J. Physiol. 587 (Pt. 3), 567-586 (2009).</li>
<li>Phillips, R. J., Walter, G. C., Powley, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+changes+in+vagal+afferents+innervating+the+gastrointestinal+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Auton.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Age-related changes in vagal afferents innervating the gastrointestinal tract.</a> Auton. Neurosci. 153 (1-2), 90-98 (2010).</li>
<li>Furness, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Types+of+neurons+in+the+enteric+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Auton.+Nerv.+Syst%22%5BJournal%5D)">Types of neurons in the enteric nervous system.</a> J. Auton. Nerv. Syst. 81 (1-3), 87-96 (2000).</li>
<li>Gulbransen, B. D., Sharkey, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+functional+roles+for+enteric+glia+in+the+gastrointestinal+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Gastroenterol.+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Novel functional roles for enteric glia in the gastrointestinal tract.</a> Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol. 9 (11), 625-632 (2012).</li>
<li>Pomeranz, H. D., Rothman, T. P., Chalazonitis, A., Tennyson, V. M., Gershon, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+crest-derived+cells+isolated+from+the+gut+by+immunoselection+develop+neuronal+and+glial+phenotypes+when+cultured+on+laminin%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Neural crest-derived cells isolated from the gut by immunoselection develop neuronal and glial phenotypes when cultured on laminin.</a> Dev. Biol. 156 (2), 341-361 (1993).</li>
</ol>

החוקרים מצהירים כי אין אינטרסים מתחרים גדולים קיימים.

בעלי חיים המשמשים פרוטוקול זה כבר מותאם לעכברים וובסטר שוויצרי. עם זאת, שיטה זו היא להתאמה בקלות ליונקים אחרים בינוני וקטנים כגון חולדות ולזנים אחרים של עכברים. יש לנו לבצע בהצלחה בידודים ראשוניים עם C57 עכברים וקולטניים μ-אופיואידים לדפוק-outs. עם זאת, ייתכן גם שזנים אחרים של עכברים עשויים להיות בעייתיים עקב שינויים מורפולוגיים במערכת העיכול. יתרה מזאת, קיימים הבדלים בין זני עכבר ידועים (C57BL / 6 לעומת BALB / ג) ב...

מערכת העצבים enteric (ENS) היא רשת עצומה של עצבים וגליה שפועלת לכל האורך של מערכת העיכול (GI). ENS פונקציונלי שולט בכל ההיבטים של מערכת העיכול, כולל תנועת מעיים, קליטה / הפרשת נוזלים, תחושה של גירויים, וכו &#39;(לסקירה ראה 1). הוא מכיל מעל 500 מיליון נוירונים, יותר מאשר נמצא בחוט השדרה, והוא מכיל בכל כיתת מוליך עצבי במוח. יתר על כן, ENS הוא ייחודי בכך שהוא יכול לתפקד רפלקסיבי ללא קלט ממערכת העצבים המרכזית 2. הבנה של ENS היא קריטית, לא רק כדי להבין את התפקיד הפיזיולוגי הרגיל שלו, אבל כדי להבין את מעורבותה במגוון רחב של neuropathies אשר יכולה להיות מולדים (מחלת הירשפרונג של), שנרכשה (Chagas), משנית למחלת הברית (gastroparesis הסוכרתי), תרופה המושרה (תסמונת מעי אופיואידים), או עקב פציעה (ileus לאחר ניתוח) 1. בנוסף לכך, תאי עצב מעיים יכולים להיות מחדשservoir לזיהום נגיפי (אבעבועות רוח זוסטר) 3. בגלל דמיונה למוח ואת הרמות הגבוהות של סרוטונין במעיים, לעתים קרובות יש תרופות שנועדו לטיפול בליקויים במערכת עצבים מרכזיים תופעות לוואי בלתי רצויות על ENS 2. זה גם ראוי לציין כי neuropathies רבים כגון מחלת אלצהיימר ומחלת פרקינסון מראה שינויים תאיים דומים בתאי העצב, הרבה לפני ההופעה שלהם בתאי עצב מרכזיים המעיים, מה שהופך ENS מודל נגיש ללמוד פתוגנזה של מחלות אלו 4. לכן, הבנה מעמיקה של ENS היא הכרח בהבנת מצבי מחלה ומניעה / ניבוי תופעות לוואי תרופתי. הנוירונים של ENS נחקרו באופן מסורתי בחזיר באמצעות הכנות wholemount 5-7 או נוירונים בתרבית 8. למרות הקלות שבה ניתן ללמוד נוירונים בחיה הגדולה הזה, מודל זה יש מגבלות רבות, כוללחוסר של זנים מהונדסים גנטי, חוסר של חומרים כימיים ספציפיים למין זה, ואת העלות הגבוהה הקשורה עם ההזמנה ודיור נושאים אלה. יש ההתפתחות של מודל מערכת עצבים enteric עכברי את היתרון הייחודי של דפיקה שונות מתוך מערכות, מגוון רחב של שיטות אחרות שהוקמו, שניתן להשתמש בשילוב עם טכניקת תרבית התאים, ואת היכולת לספק אימות למודל חזיר גינאה . ENS מורכב משלושה plexi הפועלים אורך של מערכת העיכול: myenteric מקלעת החיצונית (בין השריר האורכי וחוזר) האחראית בעיקר לפעולות הנפיחה של המעיים, כמו גם plexi submucosal והרירי, ( מצא מתחת ובתוך הרירית, בהתאמה), אשר במידה רבה שולטת בקליטה / הפרשת נוזלים וזיהוי של גירויים 1. שיטה זו מתחילה בבידוד של הכנת מקלעת שרירים / myenteric האורך (LMMP) על ידי קילוףאת השכבה החיצונית של השרירים מערכת העיכול. כך יצמצם את הזיהום באופן דרמטי בנושאים שעולים כאשר השכבה הרירית מעורבת בבידוד. כתוצאה מכך, תהליך זה הוא אידיאלי ללימוד שליטה העצבית של תנועתיות ולא פעולות הפרשה של ENS. השיטה שהוצגה כאן תוצאות בתרבות מעורבת של תאי עצב וגליה מעיים. לפחות שני סוגים שונים של תאי עצב מבוססים על תצפיות בהווה ואלקטרו immunocytochemical קודמות 9. הנוכחות של גליה היא יתרון מאוד, כפי שהם לא רק סוג תא חשוב ללמוד בזכות עצמם, אבל הם תורמים להישרדות של תאי עצב enteric 10 ולשמור על ביטוי הקולטן מולדת על פני התא העצבי 11. יתר על כן, ליקויים של גליה enteric עלולים להוביל למצבים חריגים במערכת העיכול מחלות תנועתיות, טבע 12 &#39;נוירו gliopathies&#39;. לכן, תרבות ENS מוצגת כאן Results בכמה סוגי תאים כי הם בשלים לחקירה. היתרונות למתודולוגיה זו הם להקל על בידוד, דרישות כלי זולות, וזמן קצר כדי ללמוד את הטכניקה על ידי אנשי מעבדה מנוסים. מגבלות המתודולוגיה כוללות תשואה נמוכה כוללת של תאים מרקמות כרכים גבוהים והרחקה של נוירונים ENS מplexi הרירי וsubmucosal. הליך זה יהיה יתרון מאוד לחוקרים המתמחים באלקטרופיזיולוגיה, אימונוהיסטוכימיה, תא בודד PCR, ושיטות אחרות.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reagents</td></tr><tr><td>Fisherbrand Coverglass למשקפי כיסוי צמיחה (קוטר 12 מ"מ)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-82</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>פולי-D-ליזין</td><td>סיגמא</td><td>P6407- 5 מ"ג</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>צלחת תרבית תאים 24 בארות</td><td>CELLTREAT</td><td>229124</td><td>עשוי להשתמש בכל מותג</td></tr><tr><td>Laminin</td><td>BD Biosciences</td><td>354 232</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>ddH2O</td><td></td><td></td><td>יכול להכין במעבדה&nbsp;</td></tr><tr><td>15 מ"ל צינור צנטריפוגה סטרילי</td><td>Greiner Bio-one</td><td>188261</td><td>יכול להשתמש בכל מותג</td></tr><tr><td>50 מ"ל צינור צנטריפוגה סטרילי</td><td>Greiner Bio-one</td><td>227261</td><td>יכול להשתמש בכל מותג</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP358-212</td><td>MW 58.44</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP366-500</td><td>MW 74.55</td></tr><tr><td>NaH2PO4 .2H2</תת>O</td><td>פישר כימיקלים</td><td>S369-3</td><td>MW137.99</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M7506-500G</td><td>MW 120.4</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S6014-5KG</td><td>MW 84.01</td></tr><tr><td>גלוקוז</td><td>פישר כימיקלים</td><td>D16-1</td><td>MW 180.16</td></tr><tr><td>CaCl22H2O</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>C5080-500G</td><td>MW 147.02</td></tr><tr><td>F12 מדיה</td><td>Gibco</td><td>11330</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>איכות ביולוגית בע"מ</td><td>110-001-101HI</td><td>רשאי להשתמש בכל מותג</td></tr><tr><td>אנטיביוטיקה/אנטי-פטריית 100x נוזלי</td><td>Gibco</td><td>15240-062</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Neurobasal A media</td><td>Gibco</td><td>10888</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>200 מ"מ L-גלוטמין</td><td>גיבקו</td><td>25030164</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>גורם נוירוטרופי נגזר גליה (GDNF)</td><td>נוירומיקה</td><td>PR27022</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>מספריים חיתוך מחודדים</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>8940</td><td>עשוי להשתמש בכל מותג</td></tr><tr><td>ניתוח רקמות מלקחיים</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>13-812-41</td><td>עשוי להשתמש בכל מותג</td></tr><tr><td>אפליקטורים עם קצה כותנה</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>23-400-101</td><td>עשוי להשתמש בכל מותג</td></tr><tr><td>250 מ"ל זכוכית מדורגת</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>FB-100-250</td><td>עשוי להשתמש בכל מותג</td></tr><tr><td>2 ליטר בקבוק זכוכית ארלנמאייר</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>FB-500-2000</td><td>עשוי להשתמש בכל מוט</td></tr><tr><td>פלסטיק (מברשת צבע לילד)</td> <td>Crayola</td><td>05 3516</td><td>עשוי להשתמש בכל מותג</td></tr><tr><td>Carbogen</td><td>Airgas</td><td>UN 3156</td><td>5% CO2</td></tr><tr><td>10 ml מזרק Leur-lock</td><td>בקטון דיקינסון</td><td>309604</td><td>ניתן להשתמש בכל מותג</td></tr><tr><td>21 גרם x 1 1/2 אינץ'. מחט היפודרמית</td><td>בקטון דיקינסון</td><td>305167</td><td>עשוי להשתמש בכל מותג</td></tr><tr><td>קולגנאז סוג 2</td><td>וורת'ינגטון</td><td>LS004174</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>סרום בקר אלבומין</td><td>ביואנליטי אמריקאי</td><td>AB00440</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>2 מ"ל צינורות מיקרוצנטריפוגה אפנדורף</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>13-864-252</td><td>עשוי להשתמש בכל מותג</td></tr><tr><td>Nitrex Mesh 500 ומיקרו; M</td><td>Elko Filtering Co</td><td>100560</td><td>רשאי להשתמש בכל מותג</td></tr><tr><td>Pipette Set</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-377-328</td><td>רשאי להשתמש בכל מותג</td></tr><tr><td>Sharpeining</td><td>Stone Fisher Scientific</td><td>NC9681212</td><td>רשאי להשתמש בכל מותג</td></tr><tr><td colspan="4" >Equipment</td></tr><tr><td>LabGard ES 425 Biological Safety Cabinet (קולט אדים לתרבית תאים)</td><td>Nuaire</td><td>NU-425-400</td><td>עשוי להשתמש בכל מותג</td></tr><tr><td>10 L רועד Waterbath</td><td>Edvotek</td><td>5027</td><td>עשוי להשתמש בכל מותג</td></tr><tr><td>Microcentrifuge 5417R</td><td>Eppendorf</td><td>5417R</td><td>עשוי להשתמש בצנטריפוגה אחת גדולה יותר עם מתאמי גודל</td></tr><tr><td>Allegra 6 Series Centrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>366816</td><td>עשוי להשתמש בכל מותג</td></tr><tr><td>HuluMixer Sample Mixer</td><td>Invitrogen</td><td>15920D</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>חממת מעיל מים CO2 AutoFlow</td><td>Nuiare</td><td>NU-4750</td><td>עשויה להשתמש בכל מותג</td></tr><tr><td>סולם איזון אנליטי</td><td>מטלר טולדו</td><td>XS104</td><td>עשוי להשתמש בכל מותג</td></tr></tbody></table>

<em&gt; חוץ גופייה</em&gt; הכנה של נוירונים enteric המבודדים וגליה ממקלעת myenteric של העכבר הבוגר

An In-vitro Preparation of Isolated Enteric Neurons and Glia from the Myenteric Plexus of the Adult Mouse

מערכת העצבים enteric היא רשת עצומה של תאי עצב וגליה לאורכו של מערכת העיכול ששולטת תפקודי תנועתיות מערכת העיכול. הליך לבידוד והתרבות של אוכלוסייה מעורבת של תאי עצב וגליה ממקלעת myenteric מתואר. יכולות להישמר בתרבויות העיקריות במשך 7 ימים, עם קשרים המתפתחים בין תאי עצב וגליה. רצועת השריר האורכי עם myenteric מקלעת המצורפת הוא נגזל השריר המעגלי הבסיסי של המעי גס והעכבר או נתון לעיכול אנזימטי. בתנאים סטריליים, האוכלוסייה העצבית וגליה המבודדת נשמרות בתוך צנטריפוגה הבאה גלולה ומצופית על coverslips. בתוך 24-48 שעות, תוצאה neurite מתרחשת ויכול להיות מזוהה על ידי תאי עצב סמני הפאן עצביים. לאחר יומיים בתרבות, פוטנציאל פעולת אש נוירונים בודד כפי שנצפה על ידי מחקרי מהדק תיקון. יתר על כן, גליה enteric יכולה להיות גם identifמטען חבלה על ידי צביעת GFAP. רשת של נוירונים וגליה בפרד קרוב יוצרת בתוך 5 - 7 ימים. נוירונים מעיים יכולים להיות פרטני וישירות נחקרו באמצעות שיטות כגון אימונוהיסטוכימיה, electrophysiology, הדמיה סידן, ותא בודד PCR. יתר על כן, ניתן לבצע הליך זה בבעלי חיים מהונדסים גנטי. מתודולוגיה זו היא פשוטה לביצוע ולא יקר. באופן כללי, פרוטוקול זה חושף את המרכיבים של מערכת העצבים enteric באופן מניפולציות בקלות, כך שאנו עשויים לגלות טובים יותר את הפונקציונליות של ENS במדינות נורמליות ומחלה.

<html> מייד לאחר הבידוד של תאים שמקורם LMMP, נוירונים וסוגי תאים אחרים לא יהיה מוכן מאליו. חיים, ניתן לראות תאים עגולים של הפנוטיפ לא ברור, כמו גם שאריות רקמה מברי רקמה מתעכלים חלקי ורקמות חיבור. סחופה זה לא עניין ויוסרה במידה רבה עם שינוי התקשורת הראשונה ביומיים. אל תנסו לנקות את השקופיות לפני זה כמו התאים הבריאים, קיימא יוסרו גם כן. אחרי יום אחד בתרבות, הנוירונים יתחילו להראות תוצאה neurite. זיהוי ספציפי של תאי ...

אנו מדגימים פרוטוקול תרבית תאים למחקר הישיר של רכיבים עצביים וגליה של מערכת העצבים enteric. נוירון / תרבות מעורבת גליה על coverslips מוכן ממקלעת myenteric של עכבר בוגר מתן היכולת לבחון נוירון בודד ופונקציה על ידי גליה electrophysiology, immunohistochemical,<em&gt; וכו &#39;</em&gt;.

<em&gt; חוץ גופייה</em&gt; הכנה של נוירונים enteric המבודדים וגליה ממקלעת Myenteric של העכבר הבוגר

The enteric nervous system is a vast network of neurons and glia running the length of the gastrointestinal tract that functionally controls ...

המטרה הכללית של הליך זה היא לבודד נוירונים ו-CLIA בעלי חיוניות תפקודית מהמקלעת המיאנטרית (myenteric plexus) של עכבר בוגר. זאת על ידי ציפוי ראשוני של משטח סטרילי לתרבית תאים בפוליליזין ולמינין. השלב השני הוא הכנת התמיסות ואזור הניתוח לצורך בידוד המקלעת המיאנטרית.בשלב הבא, יש להוציא את מערכת העיכול ולבודד את המקטע הרצוי כדי ליצור תכשיר של פלקסוס מיאנטריץ של שריר אורכי (LMMP). השלב הסופי הוא עיכול רצוף של ה-LMMP בקולגנאז ובטריפסין, ולאחריו זריעת התאים על משטחי תרבית תאים מקודדים מראש. לבסוף, ניתן להשתמש באלקטרופיזיולוגיה, אימונוציטוכימיה ו-PCR של תא בודד כדי לחקור את השפעותיהם של נוירונים אנטריים, גליא, או את האינטראקציה בין שני סוגי תאים אלו.את הפרוצדורה תדגים ד"ר Trisha Har Smith, עמיתת פוסט-דוקטורט במעבדה, ותסייע לה Joy Gombe, דוקטורנטית במעבדה. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני טכניקות קיימות הוא שהנוירונים והגליא מגיעים מעכבר בוגר. דבר זה מאפשר שימוש בנוירונים ובגליא תפקודיים לחלוטין, שעשויים להגיע מבעלי חיים שעברו שינוי גנטי.למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי התכונות החשמליות של נוירונים, ניתן ליישמה גם במתודולוגיות אחרות כגון אימונו-ציטוכימיה, PCR של תא בודד ודימוי סידן בזמן אמת. התחילו את הפרוצדורה על ידי הנחת עכבר שהורדם במצב שכיבה גבית על משטח הניתוח.בשלב הבא, נקה את עור הבטן עם 70%ethanol. לאחר מכן, הרם אותו באמצעות פינצטה ופתח את חלל הבטן בעזרת מספריים כדי לחשוף את איברי העיכול הפנימיים. לאחר מכן, הרם קטע מה-ileum כדי לחשוף את ה-mesentary.הסירה את מערכת העיכול וגזור את המסרק (mesentery) באמצעות מספריים. לאחר מכן, הסר בעדינות ופרם את האילאום (ileum) ואת המעי הגס (colon). הקפד לא למשוך את המסרק מהאילאום ומהמעי הגס לאחר שכל אורכו של המעי נפרם.הסר את האיליאום על ידי חיתוך המעי באופן דיסטלי לקיבה ופרוקסימלי לעקום (cecum). ניתן לבצע הליך זה גם עם רקמה מהמעי הגס על ידי הסרת המעי הגס מהחלק הדיסטלי לעקום ועד לחלק הפרוקסימלי לפיגס.שפשפו בעדינות תמיסת kreb דרך מקטע המעי עד שכל השאריות הצואריות יוסרו אל תוך מיכל פסולת נפרד. העבירו את המקטע הנקי למיכל Krebs המסומן כנקי וחזרו על הפעולות עד לניקוי כל ה-ileum. כדי להסיר את ה-LMMP, חתכו את ה-ileum למקטעים קטנים של שני עד ארבעה סנטימטרים.לאחר מכן, הניחו מקטע של ileum על מוט פלסטיק או זכוכית. ה-ileum צריך להתאים באופן הדוק, אך לא להיות רפוי או מתוח מדי. מנעו את סיבובו של דרכי העיכול סביב המוט על ידי קיבוע עדין של הצינור למוט באמצעות האגודל.לאחר מכן, הסר בעדינות בעזרת פינצטה שאריות של קרום הבטן (mesentery) שעדיין מחוברות למערכת העיכול. לאחר מכן, הפרד את ה-LMMP מהשריר המעגלי שמתחתיו. עשה זאת על ידי שפשוף עדין של קצה הפינצטה לאורך כל הקו שבו היה מחובר קרום הבטן, מהחלק העליון לחלק התחתון של המקטע.לאחר מכן, צרו בעדינות מפתח בשריר האורכי. לאחר מכן, הדירו בעדינות את השריר האורכי בעזרת מקלון צמר ספוג ב-crebs, החל מהחלק העליון של המפתח, תוך שימוש בתנועה אופקית קלילה ביותר ובשילוב לחץ קל מאוד, עד שהשריר האורכי רק מתחיל להיפרד מהשריר המעגלי. בצעו זאת לכל אורך הפס בנקודת החיבור למסנטריום (מעיקולן).לאחר מכן, עבדו בעדינות מסביב לצינור ה-GI על ידי תנועה מלמעלה למטה וחזרה. השריר האורכי מופרד באיטיות מהשריר המעגלי לאורך כל היקף הצינור. עם השלמת הפעולה, ה-LMMP ינשוף באופן טבעי מהצינור ה-GI שנותר.לאחר מכן, העבירו את רצועת השריר האורכית הדקה שהתקבלה לכלי הביקר המסומן כ-LMMP וחזרו על הפעולות עבור כל המקטעים בהליך זה. העבירו את מקטעי ה-LMMP השטופים לתוך תמיסת העיכול. לאחר מכן, גזרו את ה-LMMP לחתיכות קטנות מאוד באמצעות מספריים.לאחר מכן, בצעו עיכול למשך 60 דקות. השתמשו במקלח מים בטמפרטורה של 37 °C עם ניעור, תוך כדי הזרמה עדינה של carbogen. עם סיום העיכול, אספו את התאים באמצעות סבב צנטריפוגה למשך שמונה דקות ב-356 Gs בצנטריפוגה, וקררו ל-4 °C.בינתיים, הכינו תמיסת trypsin בריכוז 0.05% במנדף לתרביות תאים על ידי הוספת מיליליטר אחד של 0.25%trypsin מחומם וארבעה מיליליטרים של HBSS מחומם לתוך מבחנה סטרילית לתרביות תאים בנפח 50 מיליליטר. לאחר הצנטריפוגציה, השליכו את העלייה, הוציאו בזהירות את משקע התאים והעבירו אותו למבחנה נקייה עם חמישה מיליליטרים של תמיסת 0.05%tryin. לאחר מכן, בצעו עיכול של התאים בתמיסת 0.05%tryin באמבט מים בטמפרטורה של 37 degree Celsius תוך써 ניעור למשך שבע דקות, ונטרלו את ה-tryin באמצעות 10 מיליליטרים של מצע שטיפה קר.לאחר שבע דקות של טיפול ב-trypsin, סבב את התאים בצנטריפוגה למשך שמונה דקות ב-356 gs. בינתיים, הנח חלק מאוזן של רשת TX סטרילית על גבי מבחנת תרבית תאים סטרילית של 15 מיליליטר. לאחר הסבב בצנטריפוגה, השלף את העלייה (supernatant) ותלה את תערובת התאים בעדינות על ידי ערבובם ב-3 מיליליטר.מדיום השלמה לנוירונים. יש לבצע את כל השינויים בעדינות רבה כדי למנוע היווצרות בועות אוויר, ולאחר מכן לסנן את תמיסת התאים דרך רשת NYX אל תוך מבחנה נקייה לתרבית תאים בנפח 15 מיליליטר. יש לרכז את התאים על ידי סנטריפוגציה למשך שמונה דקות ב-356 gs.לאחר מכן, הסירו והשליכו את הנוזל העליון (supernatant). השביו את התאים ב-1200 µL מתוך מצע גידול מלא לנוירונים. לאחר מכן, תסמירו את התאים בעדינות באמצעות טיפ פלסטיק של 1 mL.הקפידו שלא ליצור בועות אוויר; פעלו עם הפפיט בצורה איטית ועדינה עד שרוב הגושים יפורקו והתאים יהיו תלויים בנוזל. כעת, הוסיפו 750 µL של המצע המלא לכל אחת מ-12 הבארות המכילות כיסוי זכוכית מקודד מראש. לאחר מכן, הוסיפו 100 µL של תמיסת התאים המדורגת.דגרו את הנוירונים באינקובטור לתרביות תאים בטמפרטורה של 37°C ובריכוז של 5% carbon dioxide. החליפו מחצית ממצע התרבית בכל יומיים. הנוירונים מוכנים להקלטות אלקטרופיזיולוגיות לאחר יום עד יומיים בתרבית.מוצג כאן האפיון האימונוהיסטוכימי של נוירונים אנטריים המבודדים מעכבר. מיקרוסקופיה קונפוקלית של השריר האורכי חשפה את הצביעה של beta three tubulin הספציפי לנוירונים בדגימה שלמה (whole mount) של השריר האורכי של האילי מהעכבר.ואלו הם התאים שבודדו מהכנות ה-LMMP, המכילים את הנוירונים שנצבעו באופן חיובי עבור cal binding; תאי הגליה המוצגים כאן הודגמו באמצעות הסמן GFAP הספציפי לגליה. עם זאת, לא נצפתה צביעה כאשר הושמט הנוגדן הראשוני. כאן מוצגים הנוירונים והגליה שבודדו מהשריר האורכי של העכבר, הגדלים בקרבה רבה זה לזה.תמונות המיקרוסקופיה הקונפוקאלית מעידות על כך שהנוירונים הירוקים וה-ggl האדומים גדלים בקלות זה לצד זה ונראה כי הם מקיימים אינטראקציה in vitro. איור זה מציג את האלקטרופיזיולוגיה של הנוירונים האנטריים וה-CLIA שגודלו בתרבית במצב current clamp. כל הנוירונים הציגו פוטנציאלי פעולה בעת הזרקת זרם.לתאי CLIA אין פוטנציאלי פעולה, אך הם מציגים פוטנציאלים אלקטרוטוניים גדולים בתגובה להזרקת זרם. הנוירונים שגודלו מאיליאום של עכבר מהווים אוכלוסייה אלקטרופיזיולוגית הטרוגנית. במצב של current clamp, הזרקת זרם של 0.09 nano amps לנוירונים גורמת להיווצרות פוטנציאלי פעולה.נוירונים בעלי HP שלילי חוזרים מיד לפוטנציאל מmembrane המנוחה לאחר גירוי. לעומת זאת, נוירונים בעלי HP חיובי מראים A HP בעקבות הגירוי, שבו פוטנציאל מmembrane המנוחה יורד מתחת לקו הבסיס לפני שחוזר לאט לערכו הראשוני. לאחר השליטה בטכניקה, ניתן לבצע אותה בארבע שעות אם היא מבוצעת כראוי.בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור לשמור על כלי הזכוכית והמכשירים הכירורגיים נקיים ככל האפשר. כמו כן, יש לבצע תנועות סיבוביות והבעבה עדינה של התאים, ולהחליף מחצית ממצע גידול התאים מדי יומיים לאחר הליך זה. ניתן לבצע שיטות כגון אלקטרופיזיולוגיה ואימונוציטוכימיה כדי לענות על שאלות נוספות, כגון האופן שבו תעלות יונים במעי מגיבות לטיפול תרופתי, וכדי ללמוד על ביטוי של חלבונים בנוירונים וגליא, וכיצד האינטראקציה בין שני סוגי תאים אלה משתנה תחת טיפולים שונים לאחר פיתוחם.טכניקה זו סללה את הדרך עבור חוקרים בתחום הנוירוביולוגיה לחקור את התפקודים הבסיסיים של נוירופתיות ונוירופתיות של מערכת העצבים האנטרית בבעלי חיים שעברו שינוי גנטי. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו מבודדים נוירונים וגליה מה-TER plexus של מערכת העצבים האנטרית של עכבר בוגר.

an-vitro-preparation-isolated-enteric-neurons-glia-from-myenteric

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

דרך אלטרנטיבית של בידוד motoneurons עכבר עובריים מן חוט השדרה מתואר. השיטה לוקחת בחשבון את העובדה לקטינים יכולים לאגד את הזיקה נמוך עצב p75NTR גורם הגדילה לקולטן. זה preplating לקטינים מבוססי מאפשרת טיהור דומה לזה עם נוגדן ספציפי נגד p75NTR.

לקטינים מבוססי בידוד תרבות Motoneurons עכבר עובריים

סרטון זה מדגים שיטה לבידוד תאי גליה אנטריים מהתת-רירית והלמינה פרופריה של מעי העכבר. הוא מתאר את השלבים הכרוכים בחילוץ רקמה תת-רירית ולמינה פרופריה, בידוד תאי הגליה האנטרית מהם, וטיפוח התאים על צלחת באר מצופה כדי להקים תרבית תאי גליה אנטריים.

בידוד תאי גליה אנטריים מהתת-רירית והלמינה פרופריה של עכבר

עצב סנסורי שרירים מעורב באיתות proprioceptor וגם לדווח על אירועים ממלכתיים ופציעה קשורה חילוף חומרים. אנו מתארים עכבר בוגר בהכנת שריר עצבים מבחנה ללימודים בafferents שרירים מופעל מתיחה.

במבחנה עכבר למבוגרים ללימוד מאפייני ירי afferents השריר

סרטון זה מדגים פרוטוקול לביצוע הקלטות אלקטרופיזיולוגיות של סיב יחיד על הכנת עצב המעי הגס של עכבר במבחנה.

באפיון פונקציונלי מבחנה של עכבר המעי הגס מביא Endings

מערכת העצבים המעי (ENS) היא רשת של נוירונים וגליה הממוקמת בדופן המעי ושולטת ברפלקסים של המעי. פרוטוקול זה מתאר שיטות לרישום הפעילות של נוירונים מעיים וגליה בתכשירים חיים של ENS באמצעות הדמיית Ca2+.

בהדמיה 2 + Ca Situ של מערכת העצבים המעיים

מערכת העצבים המעי נוצרת על ידי תאי פסגה עצבית שמתרבים, נודדים ומתיישבים במעיים. תאי פסגה עצבית מתמיינים לנוירונים עם סמנים ספציפיים לפנוטיפ המוליך העצבי שלהם. פרוטוקול זה מתאר טכניקה לניתוח, קיבוע וצביעה חיסונית של מערכת העיכול העוברית של העכברים כדי להמחיש ביטוי נוירוטרנסמיטר של מערכת העצבים המעי.

Immunostaining לדמיין פיתוח מערכת עצבים Murine מעיים

כאן, אנו מתארים את ניתוקה של המעית-גלייה מ המעי-submucosa באמצעות incubations EDTA רציפים כדי chelate קטיונים דו ערכיים ולאחר מכן הדגירה ב פתרון שחזור תאים שאינם אנזימטיות. ציפוי התליה תא תוצאות על פולי-D-ליזין ו- laminin תוצאות בתרבות מועשר של תאי גליה submucosal לניתוח פונקציונלי.

בידוד תאי גליה המעית מן Submucosa פרופריה. מוסקולריס של העכבר למבוגרים

כאן, אנחנו מציגים בטכניקה המיקרוכירורגית הרומן על בידודו של תאי גזע עצביים מ E13 העכבר עובר ganglionic קדושתו.

בידוד והתרבות של תאי גזע עצביים עובריים בעכבר

כאן אנו מציגים פרוטוקול לבידוד חוץ גופי של אוכלוסיות תאי גליה מרובות ממערכת CNS של עכבר. שיטה זו מאפשרת הפרדה של מיקרוגליה אזורית, תאים מבשרי אוליגודנדרוציטים ואסטרוציטים כדי לחקור את הפנוטיפים של כל אחד מהם במגוון מערכות תרבית.

דיסקציה ובידוד של מורין גליה ממספר אזורים במערכת העצבים המרכזית

פרוטוקול זה מציג דרך ייחודית ליצירת תרביות תאים של מערכת העצבים המרכזית ממוחות עכברים עובריים ביום ה-17 לצורך מחקר נוירו(אימונו)לוגי. ניתן לנתח מודל זה באמצעות טכניקות ניסיוניות שונות, כולל RT-qPCR, מיקרוסקופיה, ELISA וציטומטריית זרימה.

ביסוס תרביות תאי עצב וגליה מעורבים ממוחות עכברים עובריים לחקר זיהומים וחסינות מולדת

פרוטוקול זה מתאר את הבידוד של אסטרוציטים מטוהרים ותאי מיקרוגליה מחוט השדרה של העכבר הבוגר, ומקל על יישומים עתידיים כגון ניתוח RNA ותרבית תאים. הוא כולל שיטות ונהלים מפורטים לדיסוציאציה של תאים שנועדו לשפר הן את האיכות והן את התפוקה של תאים מבודדים.

בידוד אסטרוציטים טהורים ותאי מיקרוגליה מחוט השדרה של העכבר הבוגר עבור בדיקות חוץ גופיות ומחקרי שעתוק

למדו הכנה של תרבית תאים מעורבת של נוירונים וגליה מהמקלעת Myenteric בעכבר בוגר. שיטה זו מאפשרת חקר תפקודי תאים בודדים במערכת העצבים המעיים באמצעות אלקטרופיזיולוגיה ואימונוהיסטוכימיה.

גלה סרטונים נוספים