חוץ גופייה הכנה של נוירונים enteric המבודדים וגליה ממקלעת Myenteric של העכבר הבוגר

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבודד נוירונים ברי קיימא מבחינה תפקודית ו-CLIA מהמקלעת המיאנטרית של העכבר הבוגר. זה מושג על ידי ציפוי תחילה של משטח תרבית התאים הסטרילי בפוליליזין ולמינין. השלב השני הוא הכנת פתרונות ואזור כירורגי לבידוד מקלעת מיאנטרית.

לאחר מכן, הסר את מערכת העיכול ובודד את החלק הרצוי ליצירת הכנת מקלעת מיאנטרית של שרירים אורכיים. השלב האחרון הוא לעכל ברצף את ה-LMMP בקולגנאז וטריפסין, ולאחר מכן ציפוי התאים על משטחי תרבית התאים המקודדים מראש. בסופו של דבר, ניתן להשתמש באלקטרופיזיולוגיה, כימיה של ציטו חיסוני ו-PCR של תא בודד כדי לחקור את ההשפעות של נוירונים אנטריים, גליה, או האינטראקציה בין שני סוגי התאים הללו.

את ההליך ד"ר טרישה הר סמית', פוסט-דוקטורנטית בכל המעבדות, ותסייע לה ג'וי גומבה, דוקטורנטית בכל המעבדות. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני הטכניקות הקיימות הוא שהנוירונים והגליה מגיעים מהעכבר הבוגר. זה מאפשר נוירונים וגליה מתפקדים במלואם, שיכולים להגיע מבעלי חיים מהונדסים גנטית.

אם כי שיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי התכונות החשמליות של נוירונים. ניתן ליישם אותו גם על מתודולוגיות אחרות כגון כימיה של ציטו חיסוני, PCR של תא בודד והדמיית סידן בזמן אמת. התחל הליך זה על ידי הנחת עכבר שעבר המתת חסד בשכיבה גבית על משטח הניתוח.

לאחר מכן, נקו את עור הבטן עם אתנול 70%. לאחר מכן הרם אותו בעזרת זוג מלקחיים ופתח את חלל הבטן במספריים כדי לחשוף את איברי העיכול הפנימיים. לאחר מכן, הרם קטע של אילאום כדי לחשוף את המזנטריה.

הסר את מערכת העיכול וחתוך את המזנטריה במספריים. לאחר מכן הסר בעדינות ופרום את האילאום והמעי הגס. היזהר לא למשוך את המזנטריה מהאילאום והמעי הגס לאחר שהמעי המלא נפרק.

הסר את האילאום על ידי חיתוך דרך המעי הדיסטלי לקיבה ופרוקסימלי לצקום. ניתן לבצע הליך זה גם עם רקמת המעי הגס על ידי הסרת המעי הגס מהדיסטלי לצקום לפרוקסימלי לפי הטבעת. החלק הבא את האילאום לשלוש חתיכות גדולות או יותר.

שפשפו בעדינות את תמיסת הקרב דרך חלק המעיים עד שכל הצואה מוסרת למיכל פסולת נפרד. הנח את החלק הנקי במיכל קרבס המסומן נקי וחזור על ההליכים עד לניקוי האילאום כולו. כדי להסיר את ה-LMMP, חותכים את האילאום למקטעים קטנים של שניים עד ארבעה סנטימטרים.

לאחר מכן, הניחו קטע של אילאום על מוט פלסטיק או זכוכית. האילאום צריך להתאים היטב אך לא רופף או מתוח. מנע ממערכת העיכול להסתובב סביב המוט על ידי הצמדת הצינור בעדינות למוט עם האגודל.

לאחר מכן הסר בעדינות פיסות מזנטריה שעדיין מחוברות למערכת העיכול בעזרת מלקחיים. לאחר מכן, הפרד את ה- LMMP מהשריר המעגלי הבסיסי. על ידי שפשוף עדין של קצה המלקחיים לאורך כל הקו שבו הייתה מחוברת המזנטריה מלמעלה למטה של הקטע.

לאחר מכן, צור בעדינות פער בשריר האורך. לאחר מכן הקניטו בעדינות את שריר האורך באמצעות צמר גפן המשולב בחריצים המתחילים בחלק העליון של הפער, תוך שימוש במשיכה האופקית הקלה ביותר תוך הפעלת לחץ קל מאוד עד ששריר האורך רק מתחיל להיפרד מהשריר המעגלי. עשה זאת לאורך כל הרצועה לאורך נקודת החיבור המזנטרית.

לאחר מכן, עבדו בעדינות סביב צינור העיכול על ידי תנועה מלמעלה למטה ובחזרה. מכיוון ששריר האורך מופרד לאט מהשריר המעגלי כל הדרך סביב הצינור. לאחר השלמתו, ה-LMMP יירד באופן טבעי מצינור מערכת העיכול שנותר.

לאחר מכן הניחו את הרצועה הדקה של שריר האורך המתקבלת בכוס המסומנת LMMP וחזרו על ההליכים עבור כל הקטעים בהליך זה. הנח את השטיפה על מקטעי LMMP לתוך תמיסת העיכול. לאחר מכן חותכים את ה-LMMP לחתיכות זעירות בעזרת מספריים.

לאחר מכן, עכל אותם למשך 60 דקות. באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס עם שייקר תוך כדי בעבוע עדין עם קרבוגן. לאחר השלמת העיכול, אספו את התאים בצנטריפוגה במשך שמונה דקות בטמפרטורה של 356 גרם בצנטריפוגה, מצננים לארבע מעלות צלזיוס.

בינתיים, הכינו תמיסת טריפסין של 0.05% במכסה תאים על ידי הוספת מיליליטר אחד מחומם 0.25% טריפסין וארבעה מיליליטר HBSS מחומם לתוך צינור תרבית תאים סטרילי של 50 מיליליטר. לאחר הצנטריפוגה, השליכו את הסופרנטנט, הסירו בזהירות את כדור התא והניחו אותו בצינור נקי עם חמישה מיליליטר של תמיסת טריין של 0.05%. לאחר מכן, עכל את התאים בתמיסה של 0.05% באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס עם ניעור למשך שבע דקות, נטרל ניסיון עם 10 מיליליטר של חומר שטיפה קרה.

לאחר שבע דקות של טיפול בטריפסין, צנטריפוגה של התאים למשך שמונה דקות ב-356 גרם. בינתיים, קטע איזון של רשת TX מעוקרת על גבי צינור תרבית תאים סטרילי של 15 מיליליטר. לאחר הצנטריפוגה, השליכו את הסופרנטנט והשעו בעדינות את תערובת התאים על ידי הפעלתה בשלושה מיליליטר.

מדיה נוירונית מלאה. כל השינויים צריכים להיעשות בעדינות רבה כדי להימנע מיצירת בועות אוויר, יש לסנן את תמיסת התא דרך רשת NYX לתוך צינור תרבית תאים נקי של 15 מיליליטר. אסוף את התאים על ידי צנטריפוגה למשך שמונה דקות ב -356 גרם.

לאחר מכן, הסר והשליך את הסופרנטנט. Re להשעות את התאים ב-1200 מיקרוליטר מדיה נוירונית מלאה. לאחר מכן, t את התאים בעדינות באמצעות קצה פיפטה מפלסטיק של מיליליטר אחד.

היזהר לא לייצר בועות אוויר פיפטה לאט ובעדינות עד שרוב הנתחים מתפרקים והתאים תלויים לנוזל. כעת, הוסף 750 מיקרוליטר של המדיה השלמה לכל אחת מ-12 הבארות המכילות פתק כיסוי זכוכית מקודד מראש. לאחר מכן הוסף 100 מיקרוליטר מתמיסת התא המדורגת.

דגרו את הנוירונים בחממת תרבית תאים ב-37 מעלות צלזיוס עם שינוי של 5% פחמן דו חמצני. מחצית מהמדיה הסלולרית כל יומיים. נוירונים מוכנים לרישום אלקטרופיזיולוגי לאחר יום עד יומיים בתרבית.

מוצג כאן האפיון האימונוהיסטוכימי של נוירונים אנטריים. לאה בודדה מהעכבר. מיקרוסקופיה קונפוקלית של שריר אורכי חשפה את צביעת הבטא הספציפית הנוירונית שלוש טובולין בכל הכנת שריר האורך של הר איליאלי מהעכבר.

ואלה התאים שבודדו מתכשירי LMMP, המכילים את הנוירונים שנצבעו באופן חיובי לקשירת קלוריות ותאי גליה של רטין המוצגים כאן הודגמו עם הסמן הספציפי לגליה, GFAP. עם זאת, לא נצפה כתמים כאשר הנוגדן הראשוני הושמט. הנה הנוירונים והגליה המבודדים משריר האורך של העכבר הגדלים בסמיכות זה לזה.

תמונות המיקרוסקופיה הקונפוקלית מצביעות על הנוירונים הירוקים וה-ggl האדום הגדלים בקלות בסמוך זה לזה ונראה שהם מתקשרים במבחנה. איור זה מציג את האלקטרופיזיולוגיה של נוירוני המעי המתורבתים ו-CLIA במצב המהדק הנוכחי. כל הנוירונים הראו פוטנציאל פעולה עם הזרקת הזרם.

ל-CLIA אין פוטנציאל פעולה, אך הם מציגים פוטנציאלים אלקטרוטוניים גדולים בתגובה להזרקת זרם. הנוירונים המתורבתים מהעכבר הם אוכלוסייה הטרוגנית אלקטרופיזיולוגית. במצב המהדק הנוכחי, הזרקת זרם של 0.09 ננו אמפר לתאי עצב מביאה לפוטנציאל פעולה.

נוירונים שליליים של HP חוזרים מיד לפוטנציאל הממברנה במנוחה לאחר הגירוי. בעוד שתאי עצב חיוביים של HP מציגים HP A בעקבות הגירוי שבו פוטנציאל הממברנה במנוחה יורד מתחת לקו הבסיס לפני שהוא חוזר לאט לערך ההתחלתי. לאחר שליטה, טכניקה זו יכולה להיעשות תוך ארבע שעות אם היא מבוצעת כראוי.

כאשר מנסים הליך זה, חשוב לזכור לשמור על כלי זכוכית ומכשירים כירורגיים נקיים ככל האפשר. כמו כן, חזרו על התאים ובעבעו בעדינות והחליפו מחצית ממצע תרבית התאים כל יומיים לאחר הליך זה. ניתן לבצע שיטות כמו אלקטרופיזיולוגיה וכימיה של אימונו-ציטו על מנת לענות על שאלות נוספות כמו כיצד תעלות יונים במעי מגיבות לטיפול תרופתי, וללמוד על ביטוי חלבונים בתאי עצב וב-lia, וכיצד האינטראקציה בין שני סוגי התאים הללו משתנה על ידי טיפולים שונים לאחר התפתחותו.

טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הנוירוביולוגיה לחקור את הפונקציות הבסיסיות של נוירופתיות ונוירופתיות g של מערכת העצבים המעי בבעלי חיים מהונדסים גנטית. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבודד נוירונים וגליה ממקלעת ה-TER של מערכת העצבים האנטרית של העכבר הבוגר.