Name: בשיטת ההדמיה vivo להבחין דלקת אקוטית וכרונית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-16T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 10 s
Description: למד להבחין בין דלקת חריפה לכרונית בעכברים חיים באמצעות הדמיה ביולומינסצנטית עם luminol ו-lucigenin. שיטה זו מאפשרת מעקב בזמן אמת בתאי חיסון ומחקר מחלות דלקתיות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי ננסי וריא מרקס הקרן. אנו מודים לד&quot;ר ננסי א &#39;קוהל לקריאה ביקורתית של כתב היד. אנו מודים Kin ק וונג לסיועו בהכנת דו&quot;ח בסרטון זה.

הערה: כל המחקרים בבעלי החיים בוצעו תחת פרוטוקולים שאושרו מוסדיים והנחיות טיפול בבעלי חיים. 1. ריאגנטים ופתרונות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרון לPMA SC חיסון: הכן פתרון מניות של phorbol 12-13-Myristate אצטט (PMA) בשעה 5 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​ב DMSO. אחסן את פתרון המניות ב -20 ° C. לפני החיסון, להפשיר את פתרון המניות ולדלל את 1 מ&quot;ג / מיליליטר PMA ב-PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרון לLPS SC חיסון: lipopolysaccharide ממיסים (LPS מסלמונלה enterica סרוטיפ enteritidis) בPBS סטרילי במ&quot;ג / מ&quot;ל 1 לפני SC החיסון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרון לומינול הדמיה שלב אקוטי: להמס לומינול (,4-phthalazinedione, מלח נתרן של 5 אמינו-2 ,3-dihydro-1) במלח רגיל סטרילית (0.9% NaCl) בשעה 10 מ&quot;ג / מ&quot;ל. ניתן לאחסן ב -20 ° C הפתרון לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרון Lucigenin הדמיה שלב כרוני: ממיסים lucigenin (חנקת BIS-N-methylacridinium) במלח רגיל סטריליב2.5 מ&quot;ג / מ&quot;ל. ניתן לאחסן ב -20 ° C הפתרון לפני השימוש. </li></ol> 2. דגם PMA דלקת תת עורית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדימי עכברים בעירום NCR בחדר אינדוקציה עם 1-2% isoflurane. לאשר הרדמה כללית על ידי אובדן של תנועה וקצב נשימה קבועה. העבר את בעל חיים לחרטום מסופק עם גז isoflurane-מעורב ולשמור על בעלי החיים תחת הרדמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש באלכוהול רפואי לנגב לנקות ולחטא את אזור ההזרקה בכנף השמאל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות טכניקה סטרילית, להזריק 50 μl של פתרון חיסון PMA (המכיל 50 מיקרוגרם של PMA) לתוך החלל תת עורי בכנף השמאל. הסר את הנוזלים עודפים מאתר ההזרקה באמצעות כרית אלכוהול איזופרופיל. הימנע מהשימוש בשיכוך כאבים כפי שהוא עשוי להשפיע על תגובות דלקתיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזז את בעלי החיים בחזרה לכלוב הדיור ולעקוב אחר התאוששותה מהרדמה בשיתוף פעולה הדוק. על מנת לסייע בהתאוששות, השתמש בכרית חימום כדי לשמור על בעלי החיים חמים.</li></ol> 3. דגם דלקת תת עורית LPS <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדימי עכברי C57BL/6J עם 1-2% isoflurane בתא אינדוקציה. לאחר הקמת הרדמה כללית, להעביר את בעל חיים לחרטום מסופק עם גז isoflurane ולשמור על בעלי החיים תחת הרדמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש באלכוהול רפואי לנגב כדי לנקות את אזור ההזרקה בשודד שמאל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות טכניקה סטרילית, להזריק 50 μl של פתרון LPS החיסון (המכיל 50 מיקרוגרם של LPS) לשודד שמאל. הסר את הנוזלים עודפים מאתר ההזרקה באמצעות כרית אלכוהול איזופרופיל. הימנע מהשימוש בשיכוך כאבים כפי שהוא עשוי להשפיע על תגובות דלקתיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזז את בעלי החיים בחזרה לכלוב הדיור ולעקוב אחר התאוששותה מהרדמה בשיתוף פעולה הדוק. השתמש בכרית חימום כדי לשמור על חם בעלי החיים במהלך התאוששות. </li></ol> 4. הדמיה פליטת אור של דלקת <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את החיה בחדר אינדוקציה עם 1-2% גז isoflurane-מעורב. שיתוףnfirm הרדמה כללית על ידי אובדן של תנועה וקצב נשימה קבועה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד בעלי החיים עדיין בהרדמה, intraperitoneally (IP) להזריק את פתרון lucigenin (2.5 מ&quot;ג / מ&quot;ל) פתרון לומינול (10 מ&quot;ג / מ&quot;ל), או הדמיה דלקת אקוטית או כרונית, בהתאמה. המינון הסופי הוא 100 מ&quot;ג / ק&quot;ג ללומינול ו25 מ&quot;ג / ק&quot;ג לlucigenin. מינון נמוך יותר של lucigenin (10-15 מ&quot;ג / ק&quot;ג) יכול לשמש כדי למנוע רעילות אפשרית עבור כמה זני עכבר. סימני הרעילות כוללים קוצר נשימה ומצוקה נשימתית. יש המתח נמוכה C57BL/6J lucigenin סבילות מזן עירום NCR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את החיה לחדר ההדמיה של מערכת הדמיה פליטת אור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע הדמיה פליטת אור רציפה במרווחים של 1 דקות. כל צעד הדמיה מורכב של זמן רכישת דקות 1, f / להפסיק = 1, binning = 16 ועיכוב שניות 0. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתוך פנל רכישת התמונה, כדי לאפשר הדמיה רבת שלבים רציפים, לחץ על רצף הגדרת button. לספק צעדי הדמיה מספיקים בפרופיל הרכישה כדי לקבוע פלט הארה מקסימאלי (בדרך כלל 15 צעדים של דקה אחת יספיקו). סעיף 15 דקות ההדמיה מאפשר מספיק זמן לספיגת מצע ומחזור דם מערכתי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את החיה מחדר ההדמיה ולהעביר אותו בחזרה לכלוב הדיור. על מנת לסייע בהתאוששות, השתמש בכרית חימום כדי לשמור על בעלי החיים חמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך ניתוח שלאחר הרכישה, להשתמש בחבילת תוכנת ההדמיה כדי לחשב אות bioluminescent כוללת שיא דרך אזורים סטנדרטיים של עניין (ROI). התמונות הן הווה כמו זוהר בפוטונים / שנייה / 2 ס&quot;מ / SR עם סף מינימאלי ומקסימאלי שצוין. נתונים כמותיים מוצגים כשטף הכולל בפוטונים לשניים לכל החזר על השקעה. </li></ol>

<ol><li>Premack, B. A., Schall, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemokine+receptors%3A+gateways+to+inflammation+and+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Chemokine receptors: gateways to inflammation and infection.</a> Nat. Med. 2, 1174-1178 (1996).</li>
<li>Singer, A. J., Clark, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutaneous+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Cutaneous wound healing.</a> N. Engl. J. Med. 341, 738-746 (1999).</li>
<li>Wellen, K. E., Hotamisligil, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation%2C+stress%2C+and+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Inflammation, stress, and diabetes.</a> J. Clin. Invest. 115, 1111-1119 (2005).</li>
<li>Weitzman, S. A., Gordon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+and+cancer%3A+role+of+phagocyte-generated+oxidants+in+carcinogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Inflammation and cancer: role of phagocyte-generated oxidants in carcinogenesis.</a> Blood. 76, 655-663 (1990).</li>
<li>Ridker, P. M., Cushman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation%2C+aspirin%2C+and+the+risk+of+cardiovascular+disease+in+apparently+healthy+men%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Inflammation, aspirin, and the risk of cardiovascular disease in apparently healthy men.</a> N. Engl. J. Med. 336, 973-979 (1997).</li>
<li>Wyss-Coray, T., Mucke, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+in+neurodegenerative+disease--a+double-edged+sword%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Inflammation in neurodegenerative disease--a double-edged sword.</a> Neuron. 35, 419-432 (2002).</li>
<li>Hamilton, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colony-stimulating+factors+in+inflammation+and+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Colony-stimulating factors in inflammation and autoimmunity.</a> Nat. Rev. Immunol. 8, 533-544 (2008).</li>
<li>Harlan, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte-endothelial+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Leukocyte-endothelial interactions.</a> Blood. 65, 513-525 (1985).</li>
<li>Bedard, K., Krause, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+NOX+family+of+ROS-generating+NADPH+oxidases%3A+physiology+and+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">The NOX family of ROS-generating NADPH oxidases: physiology and pathophysiology.</a> Physiol. Rev. 87, 245-313 (2007).</li>
<li>Rest, R. F., Spitznagel, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+distribution+of+superoxide+dismutases+in+human+neutrophils.+Influence+of+myeloperoxidase+on+the+measurement+of+superoxide+dismutase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Subcellular distribution of superoxide dismutases in human neutrophils. Influence of myeloperoxidase on the measurement of superoxide dismutase activity.</a> Biochem. J. 166, 145-153 (1977).</li>
<li>Hampton, M. B., Kettle, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inside+the+neutrophil+phagosome%3A+oxidants%2C+myeloperoxidase%2C+and+bacterial+killing%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Inside the neutrophil phagosome: oxidants, myeloperoxidase, and bacterial killing.</a> Blood. 92, 3007-3017 (1998).</li>
<li>Serhan, C. N., Savill, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolution+of+inflammation%3A+the+beginning+programs+the+end%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Resolution of inflammation: the beginning programs the end.</a> Nat. Immunol. 6, 1191-1197 (2005).</li>
<li>Jiang, F., Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NADPH+oxidase-mediated+redox+signaling%3A+roles+in+cellular+stress+response%2C+stress+tolerance%2C+and+tissue+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol.+Rev%22%5BJournal%5D)">NADPH oxidase-mediated redox signaling: roles in cellular stress response, stress tolerance, and tissue repair.</a> Pharmacol. Rev. 63, 218-242 (2011).</li>
<li>Calafat, J., Kuijpers, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+small+intracellular+vesicles+in+human+blood+phagocytes+containing+cytochrome+b558+and+the+adhesion+molecule+CD11b%2FCD18%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Evidence for small intracellular vesicles in human blood phagocytes containing cytochrome b558 and the adhesion molecule CD11b/CD18.</a> Blood. 81, 3122-3129 (1993).</li>
<li>Johansson, A., Jesaitis, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+subcellular+localization+of+cytochrome+b+and+the+dormant+NADPH-oxidase+in+neutrophils+and+macrophages%3A+effect+on+the+production+of+reactive+oxygen+species+during+phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Different subcellular localization of cytochrome b and the dormant NADPH-oxidase in neutrophils and macrophages: effect on the production of reactive oxygen species during phagocytosis.</a> Cell. Immunol. 161, 61-71 (1995).</li>
<li>Kumar, A. P., Piedrafita, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peroxisome+proliferator-activated+receptor+gamma+ligands+regulate+myeloperoxidase+expression+in+macrophages+by+an+estrogen-dependent+mechanism+involving+the+-463GA+promoter+polymorphism%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Peroxisome proliferator-activated receptor gamma ligands regulate myeloperoxidase expression in macrophages by an estrogen-dependent mechanism involving the -463GA promoter polymorphism.</a> J. Biol. Chem. 279, 8300-8315 (2004).</li>
<li>Tseng, J. C., Kung, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+inflammatory+phagocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of inflammatory phagocytes.</a> Chem Biol. 19, 1199-1209 (2012).</li>
<li>Gross, S., Gammon, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescence+imaging+of+myeloperoxidase+activity+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Bioluminescence imaging of myeloperoxidase activity in vivo.</a> Nat. Med. 15, 455-461 (2009).</li>
<li>Kielland, A., Blom, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+reactive+oxygen+and+nitrogen+species+in+inflammation+using+the+luminescent+probe+L-012%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic.+Biol.+Med%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of reactive oxygen and nitrogen species in inflammation using the luminescent probe L-012.</a> Free Radic. Biol. Med. 47, 760-766 (2009).</li>
<li>Zhou, J., Tsai, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+assessment+of+localized+inflammatory+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic.+Biol.+Med%22%5BJournal%5D)">Noninvasive assessment of localized inflammatory responses.</a> Free Radic. Biol. Med. 52, 218-226 (2012).</li>
<li>Karlsson, A., Nixon, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phorbol+myristate+acetate+induces+neutrophil+NADPH-oxidase+activity+by+two+separate+signal+transduction+pathways%3A+dependent+or+independent+of+phosphatidylinositol+3-kinase%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Leukoc.+Biol%22%5BJournal%5D)">Phorbol myristate acetate induces neutrophil NADPH-oxidase activity by two separate signal transduction pathways: dependent or independent of phosphatidylinositol 3-kinase.</a> J. Leukoc. Biol. 67, 396-404 (2000).</li>
<li>Taylor, R. G., McCall, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histopathologic+features+of+phorbol+myristate+acetate-induced+lung+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">Histopathologic features of phorbol myristate acetate-induced lung injury.</a> Lab Invest. 52, 61-70 (1985).</li>
<li>Fukaya, S., Matsui, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+TNF-alpha-converting+enzyme+in+fibroblasts+augments+dermal+fibrosis+after+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">Overexpression of TNF-alpha-converting enzyme in fibroblasts augments dermal fibrosis after inflammation.</a> Lab Invest. 93, 72-80 (2013).</li>
<li>Lu, Y. C., Yeh, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LPS%2FTLR4+signal+transduction+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine%22%5BJournal%5D)">LPS/TLR4 signal transduction pathway.</a> Cytokine. 42, 145-151 (2008).</li>
<li>Aitken, R. J., Buckingham, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+oxygen+species+and+human+spermatozoa%3A+analysis+of+the+cellular+mechanisms+involved+in+luminol-+and+lucigenin-dependent+chemiluminescence%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Reactive oxygen species and human spermatozoa: analysis of the cellular mechanisms involved in luminol- and lucigenin-dependent chemiluminescence.</a> J. Cell. Physiol. 151, 466-477 (1992).</li>
<li>Allen, R. C., Loose, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytic+activation+of+a+luminol-dependent+chemiluminescence+in+rabbit+alveolar+and+peritoneal+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Phagocytic activation of a luminol-dependent chemiluminescence in rabbit alveolar and peritoneal macrophages.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 69, 245-252 (1976).</li>
<li>Caldefie-Chezet, F., Walrand, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+the+neutrophil+reactive+oxygen+species+production+measured+by+luminol+and+lucigenin+chemiluminescence+intra+or+extracellular%3F+Comparison+with+DCFH-DA+flow+cytometry+and+cytochrome+c+reduction%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Chim.+Acta%22%5BJournal%5D)">Is the neutrophil reactive oxygen species production measured by luminol and lucigenin chemiluminescence intra or extracellular? Comparison with DCFH-DA flow cytometry and cytochrome c reduction.</a> Clin. Chim. Acta. 319, 9-17 (2002).</li>
<li>Dahlgren, C., Aniansson, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern+of+formylmethionyl-leucyl-phenylalanine-induced+luminol-+and+lucigenin-dependent+chemiluminescence+in+human+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Pattern of formylmethionyl-leucyl-phenylalanine-induced luminol- and lucigenin-dependent chemiluminescence in human neutrophils.</a> Infect. Immun. 47, 326-328 (1985).</li>
<li>Dahlgren, C., Karlsson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+burst+in+human+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Respiratory burst in human neutrophils.</a> J. Immunol. Methods. 232, 3-14 (1999).</li>
<li>Aerts, C., Wallaert, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Release+of+superoxide+anion+by+alveolar+macrophages+in+pulmonary+sarcoidosis%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+N.Y.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Release of superoxide anion by alveolar macrophages in pulmonary sarcoidosis.</a> Ann. N.Y. Acad. Sci. 465, 193-200 (1986).</li>
<li>Zhang, N., Francis, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+detection+of+myeloperoxidase+activity+in+deep+tissues+through+luminescent+excitation+of+near-infrared+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Enhanced detection of myeloperoxidase activity in deep tissues through luminescent excitation of near-infrared nanoparticles.</a> Nat Med. , (2013).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין ניגוד העניינים במחקר זה.

בדו&quot;ח זה, אנו מדגימים שיטת פליטת אור הדמיה לא פולשנית של דלקת ביצורי חיים. ניצול של שני מצעים זורח, לומינול וlucigenin, השיטה יכולה להבדיל בין שלבים שונים של דלקת. פליטת אור לומינול קשורה נויטרופילים בשלב החריף של דלקת, ואילו פליטת אור lucigenin מתווכת על ידי מקרופאגים בשלב הכרוני. קטן יחסית (MW = 177.16 g / mol) ובלתי טעון חשמלי, לומינול בקלות יכול לחדור פלזמה וגם קרום phagosomal 25-29. בנוסף, הארה לומינול היא ספציפית לפעילות MPO תאית בנויטרופילים 9. מצ...

דלקת היא תגובה ביולוגית מוסדרת מאוד מעורבת במגוון רחב של מחלות בבני אדם, ובכלל זה זיהום מיקרוביאלי 1, ריפוי פצעים 2, 3 סוכרת, סרטן 4, 5 לב וכלי דם, ניוון עצב 6, ומחלות אוטואימוניות 7. דלקת רקמות דורשת תיאום נכון של תאי מערכת חיסון שונים על מנת להשיג אישור הפתוגן, תיקון רקמות, ורזולוציה מחלה. נויטרופילים ומקרופאגים הם מתווכים חיסוניים מרכזיים של דלקת ברקמה. בשלב החריף של דלקת, הנויטרופילים הם מגישי העזרה הראשונות לגירויים מזיקים שונים ונזק לרקמות 8. את הנויטרופילים extravasate במהירות ממחזור לאתר של פציעה, שבו התאים להשבית פולשים חיידקים על ידי שחרור גרגרים ופאגוציטוזיס אנטי מיקרוביאליים. במהלך phagocytosis, נויטרופילים לבלוע את חיידקים פולשים לphagosomes, שבמהלכה התאים לייצר רמות גבוהות של superoxIDE (O 2 · -). סופראוקסיד Phagosomal הוא המקור העיקרי של מיני חמצן תגובתי רבים במורד הזרם (ROS). לדוגמה, ניתן סופראוקסיד dismutated למי חמצן (H 2 O 2) על ידי dismutation הספונטני או על ידי סופראוקסיד דיסמוטאז (SOD) 9, 10. בנויטרופילים, myeloperoxidase (MPO) עוד יותר ממיר מי חמצן לחומצת hypochlorous אנטי מיקרוביאליים (HOCl) 11. ככל שתגובות דלקתיות להמשיך, מונוציטים במחזור להעביר בהדרגה לאתר של פציעה ולהתמיין למקרופאגים בוגרים 2, שphagocytic פונקציה לסייע להסיר פתוגנים מומתים ותא פסולת. בנוסף לכך, כרגולטור מרכזי בשלב מאוחר יותר של דלקת, מקרופאג מקדם תיקון רקמות על ידי ייצור ציטוקינים נוגד דלקת 12 ועל ידי יצירת ROS תאי ברמה נמוכה 9. ROS שנוצר בשלב מאוחר יותר לווסת את שיפוץ רקמות, היווצרות כלי חדשה, וreepithelialization 13. מונואמין NADPH תא בלען (phox) הוא המקור העיקרי לייצור סופראוקסיד בשני נויטרופילים ומקרופאגים 9. Phox הנו קומפלקס רב למקטע הייצור שמוסדר בחוזקה 9. Holoenzyme מכיל כמה יחידות משנה רגולטוריים cytosolic (P67 phox, p47 phox, P40 phox, וRAC) וheterodimer קרום הנכנס ציטוכרום b 558 (מורכב מהמקטע CYBA וCYBB). ציטוכרום ב 558 היא תגובת הליבה שבתוכו מקטע CYBB (הידוע גם בP91 phox וNOX2) מבצע תגובת שרשרת חיזור העיקרית 9. מעניין לציין, כי אתרי הייצור שלה הם שונים בין נויטרופילים ומקרופאגים. בנויטרופילים מנוחה, ציטוכרום ב 558 הוא בעיקר בהווה בקרום של גרגרי אחסון תאיים 14. במהלך phagocytosis, נויטרופילים להרכיב את שעותoloenzymes ב9 phagosomes, שבו רמות גבוהות של פעילות MPO גם בהווה. נויטרופילים phox מהירות צורך חמצן ומפעיל כוח microbicidal על ידי ייצור ROS, תופעה שמכונה הנשימה פרץ 11. בניגוד לכך, יש לי מקרופאגים רמה נמוכה יותר של ביטוי MPO וציטוכרום ב 558 נמצא בעיקר בקרום הפלזמה 15, 16. לפיכך נויטרופילים לייצר רמות גבוהות של סופראוקסיד לפעילות אנטי מיקרוביאלית, בעוד מקרופאגים לייצר פחות סופראוקסיד עבור פונקציות רגולטוריות 15. מאז דלקת היא תהליך מורכב בvivo, שיטות הדמיה בלתי פולשניות ספציפיות לשלבים שונים של דלקת תאפשר הערכה כמותית ואורך של מודלים מחלה. באמצעות מחקרים מכניסטית, יש לנו הוכיחו את השימוש של שני סוכני chemiluminescent, לומינול (5-אמינו-2 ,3-dihydro-1 ,4-phthalazinedione) וlucigenin (חנקת BIS-N-methylacridinium) בעבר, עבור הדמיה בלתי פולשנית של (כרוני) שלבים חריפים והמאוחרים של דלקת, בהתאמה 17. לומינול מאפשר הדמיה של פעילות MPO נויטרופילים בשלב האקוטי של דלקת 18-20, בעוד שניתן להשתמש בו כדי להעריך את פליטת אור lucigenin פעילות מקרופאג בשיתוף עם השלב המאוחר או דלקת כרונית 17. בכתב היד הזה, השתמשנו בשני מודלים דלקת ניסיוניים (SC PMA וSC LPS) כדי להדגים שיטות הדמיה אלה.

<table><tbody><tr><td>פורבול 12-מיריסטאט 13-אצטט (PMA)</td><td>סיגמא-אולדריץ' ושות', סנט לואיס, מיזורי</td><td>P8139</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>ליפופוליסכריד מSalmonella enterica serotype enteritidis</td><td>Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO</td><td>L2012</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>לומינול (5-אמינו-2,3-דיהידרו-1,4-פתלאזידיון, מלח נתרן)</td><td>סיגמא-אולדריץ' ושות', סנט לואיס, מיזורי</td><td>A4685</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>לוסיגנין (ביס-N-מתילקרידיניום חנקתי)</td><td>סיגמא-אולדריץ' ושות', סנט לואיס, MO</td><td>M8010</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>מערכת הדמיה IVIS Spectrum עם חבילת תוכנה Living Imaging 4.2</td><td>Caliper LS/Perkin Elmer, Hopkinton, MA</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr></tbody></table>

בשיטת ההדמיה vivo להבחין דלקת אקוטית וכרונית

In vivo Imaging Method to Distinguish Acute and Chronic Inflammation

דלקת היא היבט בסיסי של מחלות בבני אדם רבים. בדו&quot;ח הסרטון הזה, אנחנו מדגימים טכניקות פליטת אור הדמיה בלתי פולשנית המבדילות דלקת אקוטית וכרונית בעכברי מודל. עם נזק לרקמות או פלישת הפתוגן, נויטרופילים הם קו הגנה הראשון, ששיחק תפקיד מרכזי בתיווך התגובה הדלקתית חריפה. עם התקדמות התגובה הדלקתית, מונוציטים במחזור להעביר בהדרגה לאתר של פציעה ולהתמיין למקרופאגים בוגרים, אשר מתווכים דלקת כרונית ולקדם תיקון רקמות על ידי הסרת פסולת רקמה וייצור ציטוקינים נוגדות דלקת. זריקת intraperitoneal של לומינול (,4-phthalazinedione, מלח נתרן ,3-dihydro-1-5-2 אמינו) מאפשרת זיהוי של דלקת חריפה בתיווך במידה רבה על ידי נויטרופילים רקמות הסתננות. לומינול במיוחד מגיב עם סופראוקסיד נוצר בתוך phagosomes של נויטרופילים מאז תוצאות פליטת אור מmyeloperoxidase (MPO) תגובת תיווך. Lucigenin (חנקה BIS-N-methylacridinium) גם מגיב עם סופראוקסיד על מנת ליצור פליטת אור. עם זאת, פליטת אור lucigenin הוא עצמאית של MPO וזה אך ורק מסתמך על מונואמין NADPH תא בלען (phox) במקרופאגים בדלקת כרונית. יחד, לומינול וlucigenin לאפשר להדמיה לא פולשנית והערכת אורך של תא בלען אוכלוסיות שונות ברחבי שלבים דלקתיים הן כרוניים וחמורים. בהתחשב בתפקיד החשוב של דלקת במגוון רחב של מחלות בבני אדם, אנחנו מאמינים ששיטת ההדמיה לא פולשנית זו יכולה לעזור לחקור את התפקידים דיפרנציאליים של נויטרופילים ומקרופאגים במגוון רחב של מצבים פתולוגיים.

בצענו הדמיה פליטת אור אורך להעריך דלקת אקוטית וכרונית במודלים של דלקת ניסיונית. Phorbol 13-12-Myristate אצטט (PMA) הוא חלבון קינאז אגוניסט חזק C (PKC) שמפעיל phox לייצור אניון סופראוקסיד ומעורר תגובות דלקתיות חריפות עזות 21. הזרקת SC של 50 מ&quot;ג של PMA בעכברים בעירום NCR גרמה לגירוי עור ומהיר דלקת חריפה באתרי הזרקה 18, 22, 23. בצענו הדמיה ביום למשך 4 ימים עם התמונות הראשונות שהתקבלו כבר ב 3 שעות לאחר הזרקת PMA. איור 1 מדגים את שימוש בהדמית...

אנו מתארים שיטת הדמיה לא פולשנית להבחנה שלבים דלקתיים. משלוח מערכתי של לומינול מגלה תחומים של דלקת חריפה תלויות על פעילות MPO בנויטרופילים. לעומת זאת, הזרקה של lucigenin מאפשרת הדמיה של דלקת כרונית תלויה בפעילות phox במקרופאגים.

Inflammation is a fundamental aspect of many human diseases. In this video report, we demonstrate non-invasive bioluminescence imaging techniques that ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להבחין באופן חזותי בין דלקת חריפה לכרונית בעכברים חיים. הדבר מושג באמצעות הזרקה תת-עורית של ארבעה, ball 12 me state, 13 acetate או PMA כדי לעורר תגובה דלקתית חריפה ועוצמתית. לאחר מכן, מבוצעת הזרקה תוך-בטנית של מצע כימילומנצנטי, luminol או lucigen, כדי להשרות אותות אור באתר הדלקת.לומינצנציה (Luminescence) של לומנול מעידה על דלקת חריפה. בעוד שלומינצנציה של לוסיגן חושפת אזורים של דלקת בשלב מאוחר או דלקת כרונית, מניחים לאחר מכן את בעל החיים בתוך מכשיר לדימות ביולומינצנציה, המדמיה את אותות הלומינצנציה הנוצרים על ידי מצעי הכמילומנצנציה באתרי הדלקת. לאחר מכן מבוצעים שלבי דימות רצופים כדי ללכוד את פליטת הלומינצנציה המקסימלית לצורך ניתוח כמותי, ופרוצדורת הדימות חוזרת על עצמה בנקודות זמן שונות כדי לעקוב אחר תגובות דלקתיות שונות.בסופו של דבר, תוצאות ההדמיה האורכית מראות תגובות דלקתיות שונות בהתבסס על קינטיקת הפליטה של שני התסמיכים הלומניסצנטיים. בהינתן התפקיד החשוב של הדלקת במגוון מחלות אנושיות, אנו מאמינים ששיטת הדמיה לא פולשנית זו יכולה לסייע בחקירת התפקידים השונים של נויטרופילים ומקרופאגים במגוון מצבים פתולוגיים. את הפרוצדורה תדגים גב'טאניה טופר וטכנולוגיות דימות מהמעבדה. התחילו פרוטוקול זה בהכנת הריאגנטים והתמיסות כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב; הרדימו עכברי NC

in-vivo-imaging-method-to-distinguish-acute-and-chronic-inflammation

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

כאן אנו מתארים פולשני שני הפוטונים (2P) הגישה מיקרוסקופיה ללמוד ליקוציט ביות ב שודד את העכבר. אנו דנים בהיבטים הטכניים של ההכנה שלנו רקמות הדמיה ללכת את הקורא דרך בניסוי אופייני הראשונית להגדיר לאוסף ביצוע ונתונים.

לא פולשני הדמיה של ביות ליקוציט והגירה In vivo</em

אנו מדגימים כיצד לבצע מקרופאג MR הדמיה באמצעות חומר ניגוד פאראמגנטי ultrasmall (USPIO) בדלקת מפרקים ספיגה, המאפשרת ראשוני...

In vivo Macrophage ההדמיה באמצעות חומר ניגוד ממוקד MR להערכת אורך של דלקת מפרקים ספיגה

אנו מתארים הדמיה אופטית סיבוב זווית רב במערכת (MAROI) כדי לכמת את vivo של סמן פלואורסצנטי מועבר על ידי C saposin (SapC)-dioleoylphosphatidylserine nanovesicles (DOPS). העסקת מודלים עכבר של סרטן ודלקת פרקים, אנו מדגימים כיצד הניתוח עקום אות MAROI יכול לשמש למיפוי המדויק ואפיון ביולוגי של תהליכי מחלה.

בדימות אופטי Vivo של גידולים במוח ודלקת פרקים באמצעות פלורסנט SapC-DOPS nanovesicles

המטריצה ​​תאית עוברת שיפוץ משמעותי בריפוי פצעים, דלקות והיווצרות גידול. אנו מציגים גישה מיקרוסקופית immunofluorescence intravital רומן כדי להמחיש את הדינמיקה של סיבי, כמו גם רכיבי מטריצת רשת כמו עם רזולוציה מרחבית וזמנית גבוהה באמצעות epifluorescence או שני פוטונים במיקרוסקופ.

לטווח ארוך Intravital Immunofluorescence הדמיה של רקמות מטריקס רכיבים עם Epifluorescence ומיקרוסקופי שני פוטונים

הפעלת המיקרוגלים וmicrogliosis הן תגובות מפתח לניוון של מערכת עצבים כרוניות. כאן, אנו מציגים שיטות לin vivo, הדמיה לטווח הארוך של תאים ברשתית microglial CX3CR1-GFP + על ידי ophthalmoscopy confocal, ולסף וmorphometric מנתח לזהות ולכמת ההפעלה שלהם. אנו עוקבים אחר שינויי microglial בגלאוקומה הקשורות לגיל שלבים מוקדמים.

בVivo הדינמיקה של רשתית microglial הפעלה במהלך מוחיה: Confocal Ophthalmoscopic הדמיה וMorphometry הסלולרי בעכבר גלאוקומה

אנו מפרטים פרוטוקול לניטור התנהגותם של נויטרופילים ומונוציטים בוורידים מזנטריים במצב יציב ובתנאים דלקתיים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית תוך-חיונית בעכברים מורדמים.

הדמיה נויטרופילים ומונוציטים בmesenteric ורידים על ידי מיקרוסקופית Intravital על עכברים מורדמים בזמן אמת

מאמר זה מסביר את היישום של הדמיה פלואורסצנטי באמצעות בדיקת הדמיה אופטית activatable לדמיין את הפעילות vivo של metalloproteinases מטריצה ​​מפתח בשני מודלים ניסיוניים שונים של דלקת.

לא פולשני<em&gt; בויבו</em&gt; פלואורסצנטי הדמיה אופטית של פעילות MMP דלקתית באמצעות Activatable פלואורסצנטי סוכן הדמיה

הגששים במטרה לייצג כלי חדשני עבור ניתוח המנגנונים המולקולריים, כגון חלבון ביטוי בסוגים שונים של המחלה (למשל, דלקת, זיהום, ו- tumorigenesis). במחקר זה, אנו מתארים הערכה כמותית טומוגרפי תלת מימדי של הסתננות מקרופאג מעיים במודל מאתר של קוליטיס באמצעות טומוגרפיה בתיווך פלורסצנטיות F4/80-ספציפיות.

בתיווך פלורסצנטיות טומוגרפיה זיהוי, כימות הקשורות מקרופאג דלקת מעיים מאתר

שינויים מורפולוגיים מתרחשים בתאי החיסון החיסונית התגובה בעקבות ההפעלה ולקדם שינויים בגיוס הסלולר. ניצול 2-פוטון הדמיה בשילוב עם חלבון מהונדס בצורה גנטית לפיברוסט-1 (FSP1)-יצור; tdTomato פלומפולט-stop-floxed (tb/tb) קו העכבר הירוק fluorescently מתויג ליפופוליל-fitc, אנחנו יכולים להדגים ספיגה ספציפית מאוד של ליפופוליד בפיברוהכדורים ושינויים מורפולוגיים ב vivo.

ב Vivo שני צבעים 2-פוטון הדמיה של תאי כתב שתייגת גנטית בעור

מאמר זה מתאר שיטה לתצפית כרונית in vivo של תאי מיקרוגליה במנוחה בהיפוקמפוס עכבר CA1 באמצעות ניתוח מבוקר מדויק ומיקרוסקופ שני פוטונים.

ב Vivo הדמיה כרונית של שני פוטונים של תאי מיקרוגליה בהיפוקמפוס העכבר

הדמיה ב-vivo של המפרקים היא טכניקה חשובה לחשיפת התנהגות הנדידה של לויקוציטים ודינמיקה מולקולרית בתוך המפרקים הדלקתיים. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט להדמיה בתוך המפרקים באמצעות מודל עכברי לדלקת מפרקים מסוג II המושרה על ידי קולגן (CIA).

In Vivo הדמיה חושפת את ההתנהגות הנדידה של לויקוציטים בתוך המפרקים

למד להבחין בין דלקת חריפה לכרונית בעכברים חיים באמצעות הדמיה ביולומינסצנטית עם luminol ו-lucigenin. שיטה זו מאפשרת מעקב בזמן אמת בתאי חיסון ומחקר מחלות דלקתיות.

בשיטת ההדמיה vivo להבחין דלקת אקוטית וכרונית

גלה סרטונים נוספים