מציאה גן בקנה מידה גדולה ב ג elegans שימוש בספריות האכלת dsRNA ליצור פנוטיפים הפסד של הפונקציה חזקות

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבצע מסכי הפרעות RNA בקנה מידה גדול באלגנטיות C באמצעות ספריית הזנת RNA חיידקי DS כדי להפיל את ביטוי הגנים. זה מושג על ידי תרבית ראשונה של שיבוטי חיידקים מספריית DS RNA. בתנאי גידול המונעים אובדן פלסמיד מתחילים בשכפול כל לוחית ספרייה ראשונית ולאחר מכן שימוש בלוחית הספרייה המשוכפלת של 96 בארות כדי ליצור גבעולים זמניים של חיידקים על צלחות אומני אגר.

חיידקים מצלחות אומני אלה גדלים בן לילה בתרבית נוזלית ולאחר מכן מועברים אל פני השטח של צלחות האכלת תולעים. כל שיבוט חיידקים מהספרייה נושא פלסמיד מקודד D-S-R-N-A ייחודי המכוון לגן C elgan אחד להפלה. השלב השני הוא הנחת תולעים מסונכרנות על צלחות ההאכלה.

לאחר מכן, התולעים גדלות במשך מספר ימים בתא לח בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס. כאשר התולעים ניזונות מהחיידקים, ה-DS RNA המושרה משתחרר לתוך המעיים של בעל החיים, שם הוא מתפשט לרקמות הסובבות אותו וגורם לאפקטים מערכתיים. השלב האחרון הוא לבחון את החיות שהוזנו עבור השפעות פנוטיפיות הנגרמות על ידי הפלה ספציפית לגנים.

מבחנים פנוטיפיים אלה משמשים לזיהוי גנים חשובים לתהליך הביולוגי הנחקר. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו מיקרו-הזרקה של RNA תקוע כפול לתוך בלוטת התולעת הוא התפוקה הגבוהה שלה. באמצעות ספריות הזנה, אנו יכולים לבחון את התפקוד הביולוגי של כמעט כל הגנים של אלגין הים תוך שבועות ספורים בלבד.

מעבדות רבות נאבקו עם הגישה הזו מכיוון שרוב הגנים ואלגנטיות C מספיקים. ולכן נוקדאון RNA חייב להפחית את ביטוי הגנים ביותר מ-50%כדי לייצר אובדן פנוטיפים בתפקוד. כדי להבטיח הפלת גנים חזקה, זה קריטי שכל החיידקים המוזנים לתולעים יבטאו את פלסמיד ה-RNA הדו-גדילי.

כדי להתחיל בהליך לקביעת אובדן פלסמיד, הסר דגימה קטנה של חיידקים כמתואר בכל שלב רלוונטי והוסף אותה ל-450 מיקרוליטר מים סטריליים. השתמש ב-100 מיקרוליטר מהדגימה המדוללת הזו כדי ליצור דילולים סדרתיים נוספים באמצעות מים סטריליים. מערבבים היטב את התמיסות בין דילול.

מורחים 100 מיקרוליטר מכל דילול על לוחות LB ו-LB AMP ודוגרים למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס למחרת, זהה את צלחת ה-LB המכילה בין 100 ל-500 מושבות חיידקים. ספור את מספר המושבות בצלחת זו ועל צלחת ה- lb amp המתאימה המכילה את אותו דילול של חיידקים. קבע אובדן פלסמיד באמצעות משוואה זו.

אחוז החיידקים שאינם מכילים את הפלסמיד מחושב על ידי הפחתת מספר המושבות על לוחית המגבר של LB ממספר המושבות על צלחת LB, חלוקה במספר המושבות על צלחת LB והכפלה ב-100 אובדן פלסמיד נמנע על ידי גידול חיידקים בריכוזים גבוהים של סלין פחמני לנוקדאון יעיל. בדוק אם יש אובדן פלסמיד לפני האכלת בעלי חיים והמשך רק אם אובדן הפלסמיד נמוך מ-15%התחל הליך זה על ידי הסרת לוחות ספרייה כפולים מהמקפיא השלילי של 80 מעלות צלזיוס. הסר את חותם נייר הכסף בזמן שהתרביות עדיין קפואות.

החזר את מכסה הפלסטיק של הצלחות למקומו והנח את לוחות הספרייה הכפולים על משטח ישר להפשרה בטמפרטורת החדר לא יותר מ-30 דקות. עקר את משכפל 96 הפינים הבוקאלי. הכניסו אותו לאמבטיית אתנול ולאחר מכן שרפו את האתנול.

ציפוי הסיכות באמצעות לחמנייה ומבער. הניחו ללהבה לכבות ואז חזרו על הפעולה. יש לשטוף את הסיכות של משכפל נקי במים מזוקקים ולאחר מכן לעקר לפני כל שימוש.

הנח את המשכפל המעוקר לבארות הצלחת הכפולה המופשרת והשתמש בו כדי לערבב בעדינות את התרבויות. נפחים קטנים של התרבות ידבקו לסיכות המשכפל. הסר בזהירות את המשכפל מהבארות של הצלחת המשוכפלת והנח אותו בעדינות על פני צלחת האומני.

היזהר לא לנקב את משטח האגר. השאירו את המשכפל על פני לוחית האומני למשך שלוש עד ארבע שניות כך שחיידקים מהפינים של המשכפל יועברו אל פני האגר. כדי למנוע אובדן פלסמיד במדיה מוצקה, המזון מכיל שני מיליגרם למיליליטר.

סלין פחמני. הסר את המשכפל ואפשר לנפח הקטן של תרבית חיידקים להיספג לתוך האגר. לאחר ששתי הלוחות שוכפלו.

דגרו את לוחות האומני הפוכים למשך 15 עד 18 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בבוקר שלמחרת. ניתן להשתמש בצלחות אומני אלה לחיסון 96 תרביות נוזליות באר או לאחסן עד שבעה ימים בארבע מעלות צלזיוס. חיידקים להאכלת תולעים מוכנים כתרביות נוזליות באמצעות חיידקים מלוחות האומני באמצעות פיפטר חוזר וקצה קומבי של 50 מיליליטר, מחלקים מיליליטר אחד של מצע גידול חיידקים לכל שני מיליליטר.

באר עמוקה של צלחת 96 בארות מעקרת את המשכפל ומניחה אותו על פני צלחת אומני המכילה מושבות חיידקים, ומוודאת שהפינים נמצאים במגע עם כל אחת מ-96 מושבות החיידקים. העבר בזהירות את המשכפל מפני השטח של צלחת האומני לתוך צלחת הבאר העמוקה, וודא שהסיכות לא מגרדות את דפנות הבארות העמוקות עד לטבילה באמצעי גידול. כדי לעקור את החיידקים למצע הגידול.

הזז את המשכפל לאט בתנועה מרובעת בעקבות הקיר הפנימי של לוחית הבאר העמוקה. היזהר לא להתיז ולחצות בארות מזהמות. עבור כל צלחת תרבית באר עמוקה של 96 באר יש לכלול שני בקרות.

חיידקים המבטאים DS RNA כבקרה חיובית על הפלה הצפויה, פנוטיפ וחיידקים המכילים וקטור DS RNA ריק כבקרה שלילית. בעזרת לולאת חיסון סטרילית, הסר מושבה בודדת היטב אחת מצלחת הבקרה החיובית וחסן באר ריקה בבאר העמוקה הנקראת צלחת. רשום את מיקום הבאר שחוסנה.

חזור על השליטה השלילית. נענע את לוחות הבאר העמוקים במצב שטוח ב 650 סל"ד על מיקרו שייקר ב -37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. לאחר דגירה של תרביות במהלך הלילה, החיידקים מ-96 לוחות הבאר העמוקים יועברו ל-12.

ובכן, העברת צלחות האכלה יכולה להיעשות ארבע בארות בכל פעם. הנח קצות פיפטה על כל תעלה שלישית של פיפטה רב-ערוצית בת 12 ערוצים. הסר 150 מיקרוליטר של תרבית חיידקים מצלחת הבאר העמוקה והוצא אל פני השטח של ארבע בארות של צלחת האכלת 12 הבארות.

חשוב לא לנקב את פני האגר במהלך ההעברה מכיוון שתולעים יחפרו ולא ניזונו מחיידקים המבטאים את ה-DS RNA. לאחר העברת כל קבוצה של ארבע בארות, החלף את ארבעת קצות הפיפטה בארבעה קצות פיפטה סטריליים חדשים וזרע את ארבע הבארות הבאות של צלחת ההזנה אחסנו את צלחות הזרעים זקופות בחושך בטמפרטורת החדר למשך הלילה כדי שהחיידקים יוכלו להיספג לתוך האגר. לפני העברת L, אחד עצר זחלי C elgan על צלחות הזנה של DS RNA למסך האכלה.

יש לקבוע את ריכוז הזחלים שנעצרו בעבר. מערבבים את בקבוק הארלנמאייר המכיל את זחלי L one שנעצרו כדי לחלק את החיות. לאחר מכן הסר מנה של 10 מיקרוליטר והניח טיפה על צלחת NGM לא מושבתת של שישה סנטימטרים.

בארבע עד חמש טיפות במרכז הצלחת. ודא שכל המדיה נפלטת מהפיפטה. בעזרת קצה קצה הפיפטה, מורחים את נקודות תרחיף התולעת ליצירת קו נוזל רציף אחד המשתרע על קוטר הצלחת.

בעזרת מיקרוסקופ חיתוך, ספרו את כל החיות, החל מקצה אחד של קו הנוזל והמשיכו לקצה השני לפני שהנוזל נספג בצלחת והחיות מתפזרות. זה עשוי לדרוש מיקוד מחדש מתמיד של טווח הניתוח כדי להיות בטוחים שאף בעל חיים לא מתפספס. חזור על הליך ספירה זה עבור שלוש מנות נפרדות של 10 מיקרוליטר כדי לקבוע את המספר הממוצע של תולעים למיקרוליטר של תרחיף תולעת ורשום מספר זה ישירות על בקבוק ארלנמאייר.

כדי להתחיל את מסך ההזנה, השתמש בתרחיף של זחלי L אחד שנעצרו ומים סטריליים כדי להכין תמיסה המכילה 2000 תולעים למיליליטר. כל צלחת האכלה של 12 בארות תדרוש 120 מיקרוליטר של תרחיף תולעים זה מעורבב היטב כדי להבטיח פיזור אחיד של בעלי החיים ולהעביר את בעלי החיים למאגר סטרילי לצנרת. בעזרת הפיפטה הרב-ערוצית שהוגדרה עם קצות בכל מיקום שלישי, העבירו 10 מיקרוליטר מתמיסת התולעת ישירות לדשא החיידקים של צלחות ההאכלה.

הקפד לא לנקב את פני האגר מכיוון שתולעים יחפרו לתוך האגר ולא ניזונו מהחיידקים המבטאים D-S-R-N-A. לאחר העברת תמיסת התולעים לכל שתי שורות של צלחות האכלה, ערבבו מחדש את תמיסת התולעים במאגר על ידי ערבוב עדין שלה בזמן שהתולעים מתיישבות במהירות ובחנו במהירות כמה בארות בשלב מוקדם תחת טווח הניתוח כדי לוודא שכל באר מקבלת 20 עד 30 תולעים. לאחר שבכל צלחות ההאכלה יש תולעים, אחסן את הצלחות זקופות בקופסה לחה באינקובטור של 20 מעלות צלזיוס למחרת לאחר שתרחיף התולעים נספג בצלחת, הפוך את הצלחות והחזר לתיבת הלחות בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס.

ניתן לצפות בבעלי חיים על צלחות אלה לאחר שלושה ימים עבור פנוטיפים P אפס ולאחר מכן שוב לאחר שישה ימים עבור פנוטיפים F1. הפרוטוקול המתואר כאן שימש לבדיקת ארבעה גנים לביצית נופלת L 30 dumpy 17, PAT 10, ועל ארבע ביצים L 30 ועל ארבע באים לידי ביטוי במערכת העצבים. Pat 10 מתבטא בשריר דופן הגוף ו-dumpy 17 מתבטא בתאי אפידרמיס.

מוטציות Erie one Lin 15 B שימשו במסכים בגלל הרגישות המוגברת שלהם ל-RNAi כבקרה שלילית. התולעים הוזנו בחיידקים המכילים את הפלסמיד הריק PL 44 40 שלא ביטא RNA DS כצפוי. RIE אחד Lin 15 B בעלי חיים שהוזנו בחיידקים המכילים את הפלסמיד הריק לא הראו פגמים מורפולוגיים או התנהגותיים.

תמונה זו מציגה בעלי חיים הנעים בחופשיות, כפי שמעידה תנוחת הגוף הרגילה שלהם. החץ השחור מציין את מיקומה של חיה בוגרת צעירה. החץ הלבן מציין את מיקומה של קבוצת ביצים מוטלות.

ההתנהגות הנורמלית של התולעים מוצגת בסרטון וידאו זה ביצה L 30 מקודדת את היומן האלגנטי של הים של תת-היחידה G alpha Q.כאשר L שלב אחד ארי אחד לין 15 זחלי B הוזנו בחיידקים המבטאים ביצה L 30 DS RNA. הזחלים גדלו והפכו לבוגרים שהראו פגמים ברורים בתנועה ובהתנהגות הטלת הביצים. לאחר שלושה ימים, 100% מבעלי החיים שהוזנו ב-DS RNA כנגד ביצה L 30 היו משותקים ולא יכלו להטיל ביצים.

תצלום זה מראה כי כל בעלי החיים אימצו מראה נוקשה האופייני לבעלי חיים משותקים. יש לציין גם את היעדר מוחלט של ביצים מוטלות על הצלחת. דמפי 17 מקודד חלבון קולגן הדרוש להיווצרות קוטיקולה בים.

אלגן ו-17 מוטאנטים אפסיים הם נמוכים ושמנים יותר מחיות בר. בניסוי זה, לא נצפו פגמים מורפולוגיים בבעלי חיים P zero שהוזנו ב-17 D-S-R-N-A. עם זאת, 98% מבעלי החיים F1 כפי שמוצג באיור זה הראו את הפנוטיפ הדפוק.

שימו לב שבעלי החיים הבוגרים בשדה, שאחד מהם מסומן בחץ, נמוכים ושמנים יותר מהחיה הבוגרת המסומנת בחץ השחור. בפאנל A.היעדר בעלי חיים נמוכים ושמנים P zero מצביע על כך שתפקוד גן 17 נדרש בשלבי הזחל המוקדמים למורפולוגיה תקינה של הגוף. Pat 10 מקודד את חלבון הטרופונין CA של שריר דופן הגוף המכיל ארבעה מוטיבים ידניים EF הקושרים סידן.

במחקר זה נצפה כי 100% מבעלי החיים של Erie one Lin 15 B שניזונו מ-Pat 10 DS RNA הפכו למשותקים תוך שלושה ימים ולא הטילו ביצים, מה שהוביל לפנוטיפ קטלני. שימו לב שלמרות שבעלי החיים משותקים, הם עדיין יכולים להזיז את שרירי הראש שלהם כדי לאכול כפי שמצוין על ידי פינוי חיידקים ליד הראש המסומן על ידי החץ בארבעה מקודדים, חלבון תחום הומאו המתבטא בתאי עצב מוטוריים של חוט הגחון ונדרש לקלט סינפטי תקין. בחירה על ארבע נבחרה כגן בדיקה במחקר זה מכיוון שהיא הוכיחה את עצמה כעמידה לאסטרטגיות הזנה קודמות של DS RNA.

תוצאות מחקר זה הראו כי 62% מבעלי החיים שניזונו מארבעה חיידקים המבטאים RNA DS מתכשיר הספרייה הראו פגמים בהתנהגות התנועה בהשוואה לחיות בר שחוזרות בחופשיות בתנועה סינוסואידית כאשר דוחפים אותן על הראש, ארבע מוטציות אפס UNC אינן נסוגות, אלא מכווצות את כוונן בחוזקה וגורמות לכופף גבי. שלעתים קרובות הופך להיות כל כך קיצוני עד שהראש והזנב של החיה נוגעים ומציבים את הגוף במצב מפותל. טבלה זו מציגה את אחוז החיות שמציגות פנוטיפים דמויי אפס כאשר הוזנו ב-DS RNA כנגד כל אחד מארבעת הגנים שנבדקו, 100 בעלי חיים נבדקו עבור כל ניסוי נוקדאון. תוצאות אלו מדגימות את החשיבות של שימור פלסמיד להצלחת DS RNA.

ניתן להבחין במסכי הפרעות חזקים וחודרים מאוד של פנוטיפים של אובדן תפקוד בכל הרקמות. כאשר כל החיידקים המוזנים לתולעים מבטאים DS RNA לאחר שליטה, כל ספריית ההזנה יכולה להיבדק על ידי אדם אחד תוך כחודשיים. כדי לשפר את התפוקה, אנו בודקים כל שיבוט חיידקים רק פעם אחת במסך האכלה.

כל הגנים שזוהו במעבר הראשון דרך הספרייה נבדקים מחדש. במשולש, אנו מתעקשים שהפנוטיפ הרצוי נצפה בכל הבדיקות החוזרות כדי שהגן יהיה בריבוע כפגיעה חיובית. לאחר מכן מטוהר הפלסמיד מהחיידקים ומרוצף כדי לאמת את זהות הגן המקודד.

לאחר זיהוי גן, אנו מזמינים מוטציה L אם קיימת ובודקים אותה לפנוטיפ הרצוי לפני ביצוע אפיון נוסף של הגן.