מיקרון בקנה מידת רזולוציה אופטית טומוגרפיה של מוח עכבר השלם עם מיקרוסקופית גיליון Confocal אור

המטרה הכוללת של הליך זה היא לשחזר ולדמיין מוח עכבר שלם ברזולוציה בקנה מידה מיקרוני. זה מושג על ידי התייבשות ראשונה, סדרה טטרהדרן משולבת במוח עכבר קבוע. השלב השני הוא לנקות את הדגימה בבנזיל אתר.

לאחר מכן, המוח מצולם באמצעות מיקרוסקופ יריעת אור קונפוקלי. השלב האחרון הוא להשתמש בתוכנה כדי ליישר ולתפור יחד את ערימות התמונות שנרכשו. בסופו של דבר, ניתן להשתמש בכלי הדמיה מרובה רזולוציות כדי לנווט בנפח התמונה המשוחזר

היתרון העיקרי של טכניקה זו בשיטות אחרות כמו קונפוקלי או למיקרוסקופיה צילומית הוא שניתן לצלם את הנפח המלא של מוח העכבר תוך מספר ימים בלבד. שיטה זו יכולה לסייע לענות על שאלות מפתח בתחום מדעי המוח, כגון התפלגות של סוגי תאי עצב שונים בכל המוח. האם כובע מתכת זה מספק תובנה לגבי אוטונומיה עדינה של המוח?

ניתן ליישם אותו גם על עוברי עכברים או זבובי רגליים, מה שמדגים שההליך יהיה reini. סטודנטית לתואר שני מהמעבדה שלי. כדי להתחיל בפרוטוקול זה, בצע קיבוע סטנדרטי של מוחות עכברים באמצעות זלוף לב טרנס ופוסט-קידומת לילה לפני ביצוע התייבשות וניקוי.

לאחר מכן, מאז ממס ההתייבשות, THF מרווה חזק את הקרינה XFP לבצע סינון להסרת פרוקסידים עם תחמוצת אלומיניום פעילה בסיסית באמצעות עמודת כרומטוגרפיה, הימנע מפיצוח העמודה, מה שיפחית את הסרת החמצן במייצב לתמיסה הסופית. גם אם ה-THF כבר התייצב לפני הסינון, המייצב יישמר על ידי תחמוצת האלומיניום. שימו לב ש-THF ללא מייצב עלול לפתח כמויות גדולות של פרוקסידים ויכול להיות נפיץ ומסוכן.

לאחר מכן, ייבשו את כל הסדרה המשולבת של THF במוח העכבר במים טהורים. לאחר מכן הנח את הבקבוקון עם הדגימה על גלגל מסתובב כדי למנוע חשיפה לאור. עוטפים את הבקבוקון בנייר אלומיניום.

לבסוף, סנן את ממס הפינוי עם תחמוצת אלומיניום באמצעות משפך סינון. לאחר מכן נקה את הדגימה ב-100% DBE, ושנה את התמיסה לאחר שלוש ושש שעות כאשר המוח נראה שקוף. בדרך כלל שעה לאחר החלפת ה-DBE השנייה, הרכיבו אותו על לוחית הדמיה מוטה באחת מהשיטות שנראו כאן.

הרכבה ישירה באמצעות דיסק אגרוס או הרכבה באמצעות רמקול אגרו להרכבה ישירה, צללו בעדינות את הדגימה על אחד הקצוות כדי להשתמש בצלילה של דיסק ה-aros. דיסק עשוי ג'ל 6% ארוס על הקצוות. לאחר מכן תקן בעדינות את הדגימה על דיסק האגרוס עם דבק אקרילי והמתן כדקה עד להתקנת הריפוי.

בעזרת צלילת האגרוס, עשויה ג'ל 3% אגרוס על הקצוות. לאחר מכן הניח בעדינות את הדגימה על תחתית הכוס. לאחר הרכבת הדגימה באחת מהשיטות הללו, מקם את לוחית ההדמיה בתוך תא הדגימה באמצעות פינצטה.

ואז מלאו את החדר בתמיסת ניקוי. לאחר מכן, התכוננו לטומוגרפיה. ראשית, הסר את החריץ כדי לאסוף כמה שיותר פלואורסצנטיות, ולאחר מכן האר את הדגימה בעוצמת לייזר נמוכה.

כדי למנוע פוטוהלבנה, הזז את הדגימה בשלושת הכיוונים x, y ו-Z באמצעות מערכת מיקרו מיקום מונעת תוכנה. עבור כל כיוון, זהה את הקואורדינטות המינימליות והמקסימליות שעבורן הדגימה מוארת בשדה הראייה של המצלמה. לאחר מכן הכנס את הקואורדינטות שנקבעו כפרמטרים עבור רוטינת המשנה של קדם טומוגרפיה.

ציין גם את המרחק בין ערימות סמוכות שישמשו בטומוגרפיה ואת שלב הדגימה הקדם-טומוגרפית בכיוון Z. לבסוף, התחל את הקדם-טומוגרפיה, שתאסוף את התמונות בכל ערימה עם פרמטרי הדגימה Z כפי שצוין בשלב הקודם. כדי להתחיל ברכישה, ראשית, העבר את הדגימה מחוץ ליריעת האור באמצעות מערכת המיקום המיקרו.

לאחר מכן הגדל את עוצמת הלייזר ואת תנועת העצירה של כל מערכות הסריקה על מנת להאיר רק קו קבוע במרכז שדה הראייה. לאחר מכן, התקן את החריץ ויישר אותו באמצעות האות האוטומטי הפלואורסצנטי מתמיסת הפינוי. כעת אתה אמור לראות בבירור את קו החריץ במרכז שדה הראייה.

כעת הפעל מחדש את מערכת הסריקה. הפחת את עוצמת הלייזר והעבר את הדגימה בתוך יריעת האור באמצעות מערכת מיקום המיקרו. שים לב שעוצמת הלייזר המשמשת עם החריץ תהיה גבוהה מזו המשמשת בלעדיו.

מכיוון שהמסנן המרחבי חוסם חלק לא מבוטל של אור, התאם את המשרעת וההיסט של מערכות הסריקה והסריקה באמצעות תוכנת הבקרה עד שהתמונות נראות ברורות ובהירות. לאחר מכן הגדר את שלב ה-Z המתאים לניסוי והפעל את תוכנת רכישת הטומוגרפיה. אמצעי האחסון יצולם בערימות מקבילות רבות, חופפות חלקית, והתמונות יישמרו במבנה תיקיות הירארכי.

על מנת שתוכנת התפירה תעבוד עם נפח מעוקב שלם, השלימו את הנפח הנרכש בתמונות שחורות סינתטיות, כלומר תמונות מאותו סוג ומידות של אלה שנאספו, אך בעוצמה אפסית באמצעות תוכנה אוטומטית. לאחר מכן, הפעל את תוכנת התלת מימד VA A עם תוספים, Terra, Stitcher ו-tarly מותקנים וטען את התוסף Terra Stitcher. בחר את הספרייה המכילה את אמצעי האחסון המצולם וציין את הכיוונים היחסיים של הצירים ביחס למערכת קואורדינטות ימנית וגודל הווקסל.

כעת הפעל את החלק הראשון של התפירה. התוכנה תחשב את התזוזה היחסית בין זוגות ערימות ותמצא מיקום אופטימלי כולל עבור כל הערימות יחד, תבחר לשמור את הנפח התפור ברזולוציה אחת או בפורמט מרובה רזולוציות. הסולם מאפשר הדמיה מרובת רזולוציות עם תוסף tarly.

בשני המקרים, אם התמונה ברזולוציה גבוהה יותר גדולה מכמה ג'יגה-בתים, בחר גם את אופן השמירה של ריבוי ערימות וציין את הגודל של ערימות משנה בודדות. זה יאפשר גישה יעילה לנתונים המאוחסנים. כעת הפעל את החלק השני של התפירה.

התוכנה תמזג את הערימות המיושרות ותשמור אותן במצב מחסנית אחת או מרובה. בסיום, סגור את התוסף Terra Stitcher. לאחר מכן, טען את התוסף terra fly.

בחר את התיקיה עם אמצעי האחסון הרב-רזולוציה מרובה הערימות וציין את גודל השועל וכיווני הציר. אמצעי האחסון ייטען ברזולוציה המינימלית. כדי להגדיל את התצוגה לרזולוציה גבוהה יותר, פשוט השתמש בגלילת העכבר.

לחלופין, ניתן ללחוץ פעמיים על נקודה מסוימת בתמונה או לבחור להתקרב סביב נקודת ציון קיימת או לציין ישירות את הקואורדינטות של נפח העניין. כדי להגדיל את התצוגה לרזולוציה נמוכה יותר, פשוט השתמש בגלילת העכבר. ניתן להשתמש בפרוטוקול המתואר כדי לשחזר ברזולוציה בקנה מידה מיקרוני מוחות עכבר שלמים או חלקים שנכרתו ללא צורך בחתך פיזי.

כתוצאה מייצגת, כל המוח הקטן של עכבר L 7 GFP ביום 10 לאחר הלידה מוצג כאן בחיה זו. כל תאי העצב של גן פרקין מסומנים ב-EGFP. לאחר התקרבות ניתן לראות את המבנה הלמלרי האופייני של קליפת המוח הקטן, התקרבות נוספת מאפשרת להבחין בבירור בכל סומה של תאי בורקיני.

לפיכך ניתן להשתמש בפרוטוקול המתואר כדי לסנן את הארגון המרחבי העצבי במחקרי התפתחות נוירולוגית שונים. כתוצאה מייצגת שנייה, כאן אנו יכולים לראות תמונות ממוח של ירך מבוגרת, עכבר GFPM אחד. בחיה טרנסגנית זו, EGFP מתבטא בתת-קבוצה עצבית אקראית דלילה.

החצי הימני של המוח מוצג כאן. ככל שאנו מתקרבים יותר ויותר, תהליכים עצביים הופכים להיות מובחנים. תוצאה זו מדגימה כי הפרוטוקול המתואר מאפשר הדמיה ברזולוציה בקנה מידה מיקרוני במוחות עכברים בוגרים שלמים, ופותח את האפשרות לחקור אנטומיה של המוח כולו ברזולוציה תאית.

במודלים של עכברים של מחלות ניווניות לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שלושה עד ארבעה ימים אם היא מבוצעת כראוי. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לסנן כראוי את תמיסת ההתייבשות והניקוי על מנת לשמר את הקרינה של GFP. כלי ההדמיה הרב-רזולוציונית המוצג כאן יכול לשמש גם כדי לחקור מערכי נתונים גדולים מאוד המתקבלים בטכניקות אחרות כגון חתך מיקרו אופטי בטומוגרפיה.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לתארך, לדרג ולנקות מוח עכבר קבוע. דמיין אותם במיקרוסקופ גיליון קונפוקלי ודמיין את הנפח המשוחזר עם VR 3D באמצעות התוסף Tely.