מיקרון בקנה מידת רזולוציה אופטית טומוגרפיה של מוח עכבר השלם עם מיקרוסקופית גיליון Confocal אור

המטרה הכללית של הליך זה היא לשחזר ולהדמיות מוח של עכבר כולו ברזולוציה של מיקרונים. הדבר מושג תחילה על ידי ייבוש של סדרת טטרהדראנים משולבת של מוח עכבר מקובע. השלב השני הוא ביצוע שקיפות (clearing) לדגימה ב-Benzyl Ether.

בשלב הבא, המוח נסרק באמצעות מיקרוסקופ light sheet קונפוקלי. השלב הסופי הוא שימוש בתוכנה ליישור ותפירה של ערימות התמונות שנרכשו. לבסוף, ניתן להשתמש בכלי ויזואליזציה רב-רזולוציוני כדי לנווט בנפח התמונה השוחזר.

היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות אחרות, כגון מיקרוסקופיה קונפוקלית או פוטו-מיקרוסקופיה, הוא שניתן לצלם את הנפח המלא של מוח עכבר תוך ימים ספורים בלבד. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום מדעי המוח, כגון התהלוכיות של סוגים שונים של נוירונים ברחבי המוח כולו. האם שיטה זו מספקת תובנות לגבי האנטומיה העדינה של המוח?

ניתן להחיל זאת גם על עוברים של עכברים או זבובים, מה שמוכיח כי הפרוצדורה תהיה חוזרת. סטודנט לתואר שני מהמעבדה שלי. כדי להתחיל בפרוטוקול זה, בצעו קיבוע סטנדרטי של מוחות עכברים באמצעות פרפוזיה דרך הלב (trans cardio perfusion) וקיבוע משלים למשך לילה לפני ביצוע דהידרציה והבהרה.

מכיוון ש-THF, הממס המשמש להתייבשות, מכבה בעוצמה את הפלואורסצנציה של XFP, בצע סינון להסרת פרוקסידים באמצעות אלומינה בסיסית (aluminum oxide) בעזרת עמודה כרומטוגרפית; הימנע מסדקים בעמודה, שכן הדבר יפחית את הסרת הפרוקסידים לפני הוספת מייצב לתמיסה הסופית. גם אם ה-THF כבר היה מיוצב לפני הסינון, המייצב ייספג על ידי האלומינה. שים לב כי THF ללא מייצב עלול לפתח כמויות גדולות של פרוקסידים ועלול להיות נפיץ ומסוכן.

בשלב הבא, בצעו דהידרטציה לסדרה המשולבת של מוח העכבר השלם ב-THF במים מזוקקים. לאחר מכן, הניחו את הבקבוקון עם הדגימה על גלגל מסתובב כדי למנוע חשיפה לאור. עטפו את הבקבוקון בנייר אלומיניום.

לבסוף, סננו את ממס השקיפות בעזרת אלומינום אוקסיד באמצעות משפך סינון. לאחר מכן, השקיפו את הדגימה ב-100% DBE, והחליפו את התמיסה לאחר שלוש ושש שעות, כאשר המוח נראה שקוף. בדרך כלל, שעה לאחר החלפת ה-DBE השנייה, קבעו את הדגימה על לוח דימות מוטה באחת השיטות המוצגות כאן.

סמיכה ישירה באמצעות דיסק אגרוס (agros) או סמיכה באמצעות רמקול אגרו (agro) לסמיכה ישירה, טבול בעדינות את הדגימה על אחד הקטרים כדי להשתמש בטבילה של דיסק אגרוס. דיסק העשוי מ-6% ג'ל אגרוס על הקטרים. לאחר מכן, קבע בעדינות את הדגימה על דיסק האגרוס בעזרת דבק אקרילי והמתן כדקה לאשורה לצורך הסמיכה.

באמצעות שימוש בטבילה של כלי ביקר של agros, העבירו ג'ל agros בריכוז של 3% על הקצות. לאחר מכן, הניחו בעדינות את הדגימה בתחתית הכלי. לאחר קיבוע הדגימה באחת מהשיטות הללו, מקמו את לוח הדימוג בתוך תא הדגימות באמצעות פינצטה.

לאחר מכן, מלאו את התא בתמיסת הבהרה. בשלב הבא, הכינו את הדגימה לטומוגרפיה. ראשית, הסירו את המפתח (slit) כדי לאסוף כמה שיותר פלואורסצנציה, ולאחר מכן האירו את הדגימה בעוצמת לייזר נמוכה.

כדי למנוע דהייה פוטוכימית (photobleaching), העבירו את הדגימה בשלושת הצירים x, y ו-Z באמצעות מערכת המיקרו-מיקום המופעלת על ידי התוכנה. עבור כל כיוון, זהו את הקואורדינטות המינימליות והמקסימליות שבהן הדגימה מוארת בעוד היא נמצאת בשדה הראייה של המצלמה. לאחר מכן, הכניסו את הקואורדינטות שנקבעו כפרמטרים עבור תת-השגרה של טרום-הטומוגרפיה.

בנוסף, הגדירו את המרחק בין ערימות סריקה (stacks) סמוכות שישמשו בטומוגרפיה ואת שלב דגימת טרום-הטומוגרפיה בציר Z. לבסוף, התחילו את טרום-הטומוגרפיה, שתאסוף את התמונות בכל ערימה בהתאם לפרמטרי דגימת Z שהוגדרו בשלב הקודם. כדי להתחיל ברכישת התמונות, העבירו תחילה את הדגימה אל מחוץ למישור האור (light sheet) באמצעות מערכת המיקום המיקרומטרית.

לאחר מכן, הגבירו את עוצמת הלייזר ועצרו את תנועת כל מערכות הסריקה כדי להאיר קו קבוע בלבד במרכז שדה הראייה. בשלב הבא, התקינו את החריץ ויישרו אותו באמצעות אות הפלואורסצנציה העצמית של תמיסת ההבהרה. כעת אתם אמורים לראות בבירור את קו החריץ במרכז שדה הראייה.

כעת הפעילו מחדש את מערכת הסריקה. הפחיתו את עוצמת הלייזר והזיזו את הדגימה לתוך לוח האור (light sheet) באמצעות מערכת המיקום המיקרוסקופית. שימו לב כי עוצמת הלייזר המשמשת עם החריץ תהיה גבוהה מזו המשמשת בלעדיו.

כיוון שהמסנן המרחבי חוסם חלק שאינו זניח מהאור, התאימו את האמפליטודה וההיסט (offset) של מערכות הסריקה של d ו-s באמצעות תוכנת הבקרה עד שהתמונות ייראו ברורות ובהירות. לאחר מכן, הגדירו את צעד ה-Z המתאים לניסוי והפעילו את תוכנת הרכישה של הטומוגרפיה. הנפח יסרוק בסדרות רבות של שכבות מקבילות וחופפות חלקית, והתמונות יישמרו במבנה תיקיות היררכי.

על מנת שתוכנת התפירה תעבוד עם נפח קוביה מלא, השלימו את הנפח שנרכש באמצעות תמונות שחורות סינתטיות, כלומר תמונות מאותו סוג ובמימדים של התמונות שנאספו, אך בעצימות אפס, באמצעות תוכנה אוטומטית. לאחר מכן, הפעילו את תוכנת VA A 3D עם התוספים Terra, Stitcher ו-tarly מותקנים, וטענו את תוסף Terra Stitcher. בחרו את הספריה המכילה את הנפח המצולם וציינו את האוריינטציות היחסיות של הצירים ביחס למערכת צירים ימנית מייחסת ואת גודל הווקסל.

כעת הפעילו את החלק הראשון של התפרה (stitching). התוכנה תחשב את ההעתקה היחסית בין זוגות של ערימות ותמצא מיקום אופטימלי כולל עבור כל הערימות יחד. בחרו לשמור את הנפח המתופרה ברזולוציה אחת או בפורמט של רזולוציות מרובות. האחרון מאפשר ויזואליזציה ברזולוציות מרובות באמצעות תוסף tarly.

בשני המקרים, אם תמונת הרזולוציה הגבוהה גדולה מכמה גיגה-בייטים, בחרו גם במודאליות שמירה של ריבוי-מחסניות (multi-stack) והגדירו את הגודל של תתי-מחסניות בודדות. פעולה זו תאפשר גישה יעילה לנתונים השמורים. כעת הפעילו את החלק השני של התפירה (stitching).

התוכנה תמזג את המערכות המיושרות תשמור אותן במצב של מערכת אחת או מספר מערכות. עם הסיום, סגור את תוסף ה-Terra Stitcher. לאחר מכן, טען את תוסף ה-terra fly.

בחר את התיקייה המכילה את הנפח ברזולוציות מרובות ובמערכות שכבות מרובות, וציין את גודל ה-"foxhole" ואת כיווני הצירים. הנפח ייטען ברזולוציה המינימלית. כדי להגדיל לרזולוציה גבוהה יותר, פשוט השתמש בגלגלת העכבר.

לחלופין, ניתן ללחוץ פעמיים על נקודה ספציפית בתמונה, לבחור בהגדרה (zoom in) סביב נקודת ציון קיימת, או להגדיר ישירות את הקואורדינטות של הנפח המבוקש. כדי לחזור לרזולוציית נמוכה יותר, פשוט השתמשו בגלגלת העכבר. ניתן להשתמש בפרוטוקול המתואר כדי לשחזר ברזולוציית מיקרון מוחי עכבר שלם או חלקים שנכרתו, ללא צורך בחיתוך פיזי.

כתוצאה מייצגת, מוצג כאן השחמני (cerebellum) השלם של עכבר L seven GFP ביום 10 לאחר הלידה. כל נוירוני פרקין (Perkin) מסומנים ב-EGFP. לאחר הגדלה, ניתן לראות את המבנה הלמינרי האופייני של קליפת השחמני, והגדלה נוספת מאפשרת להבחין בבירור בכל גוף תא (soma) של תאי פורקיני (Purkinje).

ניתן להשתמש בפרוטוקול המתואר לסריקת הארגון המרחבי הנוירונלי במחקרים שונים של התפתחות מערכת העצבים. כתוצאה מייצגת שנייה, ניתן לראות כאן תמונות מנתח מוח של עכבר בוגר מסוג GFPM. בבעל חיים טרנסגני זה, EGFP מובע בתת-קבוצה דלילה ואקראית של נוירונים.

החצי הימני של המוח מוצג כאן. ככל שנבצע הגדלה נוספת, בליטות עצביות יהפכו למובחנות. תוצאה זו מדגימה כי הפרוטוקול המתואר מאפשר הדמיה ברזולוציה של סדר גודל מיקרוני במוחות שלםים של עכברים בוגרים, מה שפותח את האפשרות לחקר האנטומיה של המוח השלם ברזולוציה תאית.

במודלים של עכברים למחלות נוירודגנרטיביות, ברגע ששולטים בטכניקה זו, ניתן לבצעה בתוך שלושה עד ארבעה ימים אם היא מבוצעת כהלכה. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לסנן כראוי את תמיסאות ההתייבשות והניקוי על מנת לשמר את הפלואורסצנציה של GFP. ניתן להשתמש בכלי הוויזואליזציה ברזולוציות מרובות המוצג כאן גם כדי לחקור מערכי נתונים גדולים מאוד שהתקבלו בטכניקות אחרות, כגון micro optical section in tomography.

לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה של אופן התאריך, הדירוג והפינוי של מוח עכבר מקובע. תלמדו כיצד לצלם אותם באמצעות מיקרוסקופיית גיליות קונפוקלית (confocal sheet microscopy) ולהציג את הנפח השחזורי ב-VR 3D באמצעות תוסף ה-Tely.