Name: השתלת פנים ב Laevis Xenopus עוברים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 8 s
Description: למדו את שיטת השתלת רקמת פנים EAD ב-Xenopus laevis לחקר התפתחות הראש והפנים. טכניקה זו מאפשרת לחקור אינטראקציות סיגנלינג ולהבין מומים קרניו-פאציאליים בביולוגיה התפתחותית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לראדק Sindelka על עזרתו, וקאש Bresilla לסיוע עם בעלי צפרדע והכנת עובר. עבודה זו מומנה על ידי NIH באמצעות R01DE021109 המענק לHLS לורה Jacox מומן על ידי הרשל סמית בוגר המלגה באוניברסיטת הרווארד ומענק מלגה בודדת F30 F30DE022989-01 דרך NIDCR.

<ol><li>Gorlin, R. J., Cohen, M., Levin, L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGorlin%2C+RJ+%22Syndromes+of+the+head+and+neck%22">Syndromes of the head and neck</a>. , Oxford University Press. UK. (1990).</li>
<li>Trainor, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Craniofacial+birth+defects%3A+The+role+of+neural+crest+cells+in+the+etiology+and+pathogenesis+of+Treacher+Collins+syndrome+and+the+potential+for+prevention%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Med.+Gen.+A%22%5BJournal%5D)">Craniofacial birth defects: The role of neural crest cells in the etiology and pathogenesis of Treacher Collins syndrome and the potential for prevention.</a> Am. J. Med. Gen. A. 152, 2984-2994 (2010).</li>
<li>Dickinson, A. J., Sive, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+primary+mouth+in+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Bio%22%5BJournal%5D)">Development of the primary mouth in Xenopus laevis.</a> Dev. Bio. 295, 700-713 (2006).</li>
<li>Dickinson, A. J., Sive, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positioning+the+extreme+anterior+in+Xenopus%3A+cement+gland%2C+primary+mouth+and+anterior+pituitary%5BTitle%5D)+AND+%22Sem.+Cell+Dev.+Bio%22%5BJournal%5D)">Positioning the extreme anterior in Xenopus: cement gland, primary mouth and anterior pituitary.</a> Sem. Cell Dev. Bio. 18, 525-533 (2007).</li>
<li>Dickinson, A. J., Sive, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Wnt+antagonists+Frzb-1+and+Crescent+locally+regulate+basement+membrane+dissolution+in+the+developing+primary+mouth%5BTitle%5D)+AND+%22Dev%22%5BJournal%5D)">The Wnt antagonists Frzb-1 and Crescent locally regulate basement membrane dissolution in the developing primary mouth.</a> Dev. 136, 1071-1081 (2009).</li>
<li>Gilbert, S. F. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGilbert%2C+SF+%22Developmental+Biology%22">Developmental Biology</a>. , Sinauer Associates, Inc. Sunderland, MA. (2010).</li>
<li>Borchers, A., Epperlein, H. H., Wedlich, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+assay+system+to+study+migratory+behavior+of+cranial+neural+crest+cells+in+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Genes+Evol%22%5BJournal%5D)">An assay system to study migratory behavior of cranial neural crest cells in Xenopus.</a> Dev. Genes Evol. 210, 217-222 (2000).</li>
<li>Grunz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homoiogenetic+neural+inducing+activity+of+the+presumptive+neural+plate+of+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Growth+Differ%22%5BJournal%5D)">Homoiogenetic neural inducing activity of the presumptive neural plate of Xenopus laevis.</a> Dev. Growth Differ. 32, 583-589 (1990).</li>
<li>Servetnick, M., Grainger, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+neural+and+lens+competence+in+Xenopus+ectoderm%3A+evidence+for+an+autonomous+developmental+timer%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Bio%22%5BJournal%5D)">Changes in neural and lens competence in Xenopus ectoderm: evidence for an autonomous developmental timer.</a> Dev. Bio. 112, 177-188 (1991).</li>
<li>Servetnick, M., Grainger, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homeogenetic+neural+induction+in+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Bio%22%5BJournal%5D)">Homeogenetic neural induction in Xenopus.</a> Dev. Bio. 147, 73-82 (1991).</li>
<li>Couly, G., Coltey, P., Le Douarin, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+triple+origin+of+skull+in+higher+vertebrates%3A+a+study+in+quail-chick+chimeras%5BTitle%5D)+AND+%22Dev%22%5BJournal%5D)">The triple origin of skull in higher vertebrates: a study in quail-chick chimeras.</a> Dev. 117, 409-429 (1993).</li>
<li>Couly, G. F., Le Douarin, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+of+the+early+neural+primordium+in+quail-chick+chimeras+%3A+I%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+relationships+between+placodes%2C+facial+ectoderm%22%5BJournal%5D)">Mapping of the early neural primordium in quail-chick chimeras : I.</a> Developmental relationships between placodes, facial ectoderm. 110, 422-439 (1985).</li>
<li>Couly, G. F., Le Douarin, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+of+the+early+neural+primordium+in+quail-chick+chimeras+II.+The+prosencephalic+neural+plate+and+neural+folds%3A+Implications+for+the+genesis+of+cephalic+human+congenital+abnormalities%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Bio%22%5BJournal%5D)">Mapping of the early neural primordium in quail-chick chimeras II. The prosencephalic neural plate and neural folds: Implications for the genesis of cephalic human congenital abnormalities.</a> Dev. Bio. 120, 198-214 (1987).</li>
<li>Lievre, A. L., Le Douarin, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+early+development+of+cranial+sensory+ganglia+and+the+potentialities+of+their+component+cells+studied+in+quail-chick+chimeras%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Bio%22%5BJournal%5D)">The early development of cranial sensory ganglia and the potentialities of their component cells studied in quail-chick chimeras.</a> Dev. Bio. 94, 291-310 (1982).</li>
<li>Kennedy, A., Dickinson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Median+facial+clefts+in+Xenopus+laevis%3A+roles+of+retinoic+acid+signaling+and+homeobox+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Bio%22%5BJournal%5D)">Median facial clefts in Xenopus laevis: roles of retinoic acid signaling and homeobox genes.</a> Dev. Bio. 365, 229-240 (2012).</li>
<li>Trainor, P., Tam, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cranial+paraxial+mesoderm+and+neural+crest+of+the+mouse+embryo-+codistribution+in+the+craniofacial+mesenchyme+but+distinct+segregation+in+the+branchial+arches%5BTitle%5D)+AND+%22Dev%22%5BJournal%5D)">Cranial paraxial mesoderm and neural crest of the mouse embryo- codistribution in the craniofacial mesenchyme but distinct segregation in the branchial arches.</a> Dev. 121, 2569-2582 (1995).</li>
<li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSive%2C+HL+%22Early+Development+of+Xenopus+laevis%22">Early Development of Xenopus laevis</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2000).</li>
<li>Tandon, P., Showell, C., Christine, K., Conlon, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morpholino+injection+in+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Morpholino injection in Xenopus.</a> Methods Mol. Biol. 843, 29-46 (2012).</li>
<li>Nieuwkoop, P. D., Faber, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNieuwkoop%2C+PD+%22Normal+Table+of+Xenopus+laevis+%28Daudin%29%22">Normal Table of Xenopus laevis (Daudin)</a>. , Garland Publishing. New York. (1994).</li>
</ol>

יש המחברים אין לחשוף.

צעדים ומגבלות קריטיים: הליך השתלת הפנים EAD הוא זמן ועבודה אינטנסיבי. זה דורש תרגול, ידיים יציבים, ומיומנות מושלמת. פרוטוקול השתלת פנים מסתמך על יכולתו של החוקר כדי להסיר ביעילות וברקמות להשתלה. אם אחד לוקח יותר מדי זמן להכניס את ההשתלה בפרצופו של המארח, את פני המארח יתחילו להתכווץ ולרפא. מלקחיים ניתן להשתמש בם כדי להרחיב את אזור הפנים בעדינות. עם זאת, אם התכווצות פצע משמעותי התרחשה, ההשתלה לא תרפא גם כן וייתכן שיהיה הצורך בגודל מופחת להשתלב חור הפנים של המארח. הגודל של ההש...

כדי להבין את המנגנונים העומדים בבסיס ליקויי craniofacial לידת 1-2, רקמות חשובות ותרומות האיתות שלהם במהלך התפתחות craniofacial חייב להיות מזוהה. בצפרדע Xenopus laevis, חלק מהפנים, כוללים את הפה וצורת נחיריים מ&quot; אקסטרים Anterior דומיין &quot;(EAD), שבו האאקטודרם והאנדודרם ישירות לצד זה 3-4. EAD פועל גם כמרכז איתות להשפיע על רקמות הסובבות, כוללים הרכס העצבי גולגולתי, המהווה את הלסתות ואזורי פנים אחרים 5. כדי לזהות את הגנים שתורמים לתפקוד EAD, טכניקה &#39;השתלת הפנים&#39; פותחה, שבו רקמה מושתלת מתורם לעובר מארח, לאחר הסרת אזור המארח המתאים. בעקבות ההשתלה, וכתוצאה מפיתוח פנים הוא העריך. לכן, ההשפעות של אובדן התפקוד (LOF) או רווח של פונקציה (GOF) לגן מסוים בEAD מנותחים באופן מקומי, שבו שאר שעותEAD והגוף מורכב מרקמות מסוג בר. השתלת הגומלין יכולה להתבצע, שבו רקמה מסוג בר שהושתלה עוברים עם LOF הגלובלי או GOF בגנים ספציפיים. השתלה כבר בשימוש תכוף בXenopus וחומוס לומד 6. לדוגמא, השתלת Xenopus התייחסה אינדוקציה homogenetic עצבית, עדשה ויכולת עצבית, והגירה רכס עצבית 7-10. השתלת chimeric שליו חומוס נתחה פיתוח של הצלחת הקדמית העצבית, רכס עצבי קדמי, רכס עצבי, ועצמות גולגולת 11-14. זוהי טכניקת ההשתלה הראשונה למחקר של התפתחות craniofacial Xenopus. טכניקה זו הוכיחה תפקיד רומן למעכבי Wnt Frzb1 וסהר בויסות היווצרות קרום במרתף בפה המשוער 5. Laevis Xenopus הוא מודל אידיאלי למחקר של התפתחות craniofacial כעוברים גדולים, לפתח כלפי חוץ,nd הפנים גלויים ונגיש, המאפשרים המיקרומניפולציה והדמיה של פיתוח. מופיעים מנגנוני פיתוח פנים נשמרו, מה שמעיד כי ממצאים שנעשו בצפרדע לספק תובנות לגבי ההתפתחות אנושית 4,15-16.

<table><tbody><tr><td>פיפטה פסטר</td><td>VWR</td><td>14672-400</td><td>זכוכית ליים&nbsp;</td></tr><tr><td>גודל 5 3/4</td><td>בכותנה פיפטת העברה מדורגת סתומה</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>16001-180</td><td>חד פעמי&nbsp;</td></tr><tr><td>#5/45 מלקחיים</td><td>כלים מדעיים עדינים מאת Dupont medical</td><td>11251-35</td><td>זווית 45&deg;</td></tr><tr><td>מלקחיים דפוס סטנדרטי</td><td>כלי מדע עדינים</td><td>11000-20</td><td>ישר; קצה משונן; צינורות נימי נירוסטה</td></tr><tr><td>(למחטים)</td> <td>FHC</td><td>30-30-1</td><td>Borosil 1.0 מ"מ OD x 0.5 מ"מ ID/</td></tr><tr><td>סיבים כיסוי החלקה&nbsp;</td><td>VWR</td><td>48393 252</td><td>24 x 60 מ"מ&nbsp; זכוכית כיסוי מיקרו;</td></tr><tr><td>חולץ מחטים Ficoll 400</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F9378</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Sutter Instrument</td><td>Co Needle Puller: נימה שהופסקה: FB300B</td><td>מושך המחט הדומה ביותר, הזמין כיום&nbsp; הוא ה-P-97. עבור חוטים, השתמש בחוטי קופסה מרובעים של Sutter 3.00 מ"מ, ברוחב 3.0 מ"מ.</td></tr><tr><td>דגם P-80</td> חולץ <td></td><td></td><td>מיקרופיפטה בוער / חום</td></tr><tr><td>סטריאומיקרוסקופ</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>תאורת סטריאומיקרוסקופ מאת Fostec</td><td>Fostec</td><td></td><td>השתמש בקופסת אור עם 2 זרועות סיבים אופטיים.&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>מחזיק סיכה מצופה ניקל</td><td>כלי מדע עדינים</td><td>26018-17</td><td>קוטר פתיחת לסת: 0-1 מ"מ</td></tr><tr><td>מחזיק סיכה מצופה ניקל מוריה</td><td>כלי מדע עדינים</td><td>26016-12</td><td>קוטר פתיחת לסת: 0-1 מ"מ</td></tr><tr><td>מחטי טונגסטן</td><td>כלי מדע עדינים</td><td>10130-05</td><td>0.125 מ"מ קוטר מוט</td></tr><tr><td>ואן אקן פלסטלינה</td><td>Blick</td><td>#33268-2981</td><td></td></tr><tr><td>דוגמנות חימר- לבן, אדום או mMessage צהוב</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>mMashine SP6 או T7 ערכת</td><td>אמביון</td><td>AM1340</td><td></td></tr></tbody></table>

השתלת פנים ב<em&gt; laevis xenopus</em&gt; עוברים

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

מומים מולדים Craniofacial להתרחש ב1 מתוך כל 700 לידה חיות, אבל אטיולוגיה ידועה לעתים רחוקות בגלל הבנה מוגבלת של פיתוח craniofacial. כדי לזהות היכן מסלולים ורקמות איתות לפעול בדפוסים של הפנים פיתוח, טכניקה &#39;השתלת הפנים&#39; פותחה בעוברים של צפרדע Xenopus laevis. אזור של רקמות פנים משוערות (&quot;אקסטרים Anterior דומיין&quot; (EAD)) מוסר מעובר תורם בשלב tailbud, ולהשתיל לעובר מארח של אותו השלב, שממנו האזור שווה הערך הוסר. זה יכול לשמש כדי ליצור פנים chimeric בי הרקמה המארחת או תורם יש הפסד או רווח של תפקוד בגן, ו / או כוללת תווית שושלת. לאחר ריפוי, התוצאה של פיתוח היא בפיקוח, ומצביעה על תפקידים של מסלול האיתות תוך התורם או רקמות מארח שמסביב. Xenopus הוא מודל יקר ערך לפיתוח פנים, כמו אזור הפנים הוא גדול וקלותccessible להמיקרומניפולציה. ניתן assayed עוברים רבים, על פני פרק זמן קצר מאז פיתוח מתרחש במהירות. ממצאים בצפרדע רלוונטיים להתפתחות אנושית, שכן תהליכי craniofacial מופיעים נשמרים בין Xenopus ויונקים.

רקמות המושתלות צריכים להיות מוכנסות במלואו לתוך ראש המארח לאחר ההשתלה כפי שמוצגות באיור 3 א, ויש לי גשר זכוכית להציב כראוי על פניו של העובר, כפי שמוצגים באיור 2Bc. הרקמות המושתלות התורמות חייבים להיות בגודל נכון לפתיחה המארחת, להשתלה כדי להצליח. רקמת EAD לא צריכה לבלוט מהראש, בכל דרך, כפי שניתן לראות ב3B דמויות ו3C. בנוסף, השתלת הפנים לא צריכה להיות מסובבת יחסית למיקומה בגוף התורם, כפי שמוצג באיור 3D. לאחר כמה שעו...

טכניקה להשתלה &quot;אקסטרים Anterior דומיין&quot; רקמות פנים בין Xenopus laevis עובר כבר מפותחת. רקמה ניתן להעביר מהרקע ביטוי גנים אחת לאחרת, ומאפשרת הלימוד של דרישות מקומיות לפיתוח craniofacial ולאיתות אינטראקציות בין אזורי פנים.

השתלת פנים ב<em&gt; Laevis Xenopus</em&gt; עוברים

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. ...

המטרה הכללית של הליך זה היא להשתיל רקמה פנימית מהדומיין הקדמי הקיצוני (extreme anterior domain או EAD) של הפנים בין עוברים של Xenopus laevis. דבר זה מושג תחילה על ידי הסרת רקמת ה-EAD מעוברים תורמים ומקבלים בעלי רקעים גנטיים שונים. לאחר מכן, נגזרי ה-EAD מהעוברים התורמים מוחדרים אל פני העוברים המקבלים.בשלב הסופי, העוברים המעותקים נשמרים למשך 60 עד 70 שעות לאחר ההפריה לצורך תצפית. לבסוף, ניתן להשתמש במיקרוסקופיה בשדה בהיר ובמיקרוסקופיית פלואורסצנציה כדי לבחון שינויים בהתפתחות הקרניו-פציאלית (פנים וגולגולת) של בעלי החיים שבוצע בהם ההשתלה. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום ההתפתחות הקרניו-פציאלית כדי לשפר את הבנתנו לגבי עיוותים קרניו-פציאליים, כגון אותות חדשים הנדרשים להתפתחות הפה הנובעים מהדומיין הקדמי הקיצוני. לפני הפעולה, טענו צינורות נימיים למכשיר מתיחה של מחטים (needle puller), ולאחר מכן מתחו ארבע עד שש מחטים ושברו כל מחט, כך שהחלק הגמיש דמוי-השיער באורך שני עד שלושה מילימטרים של קצה הזכוכית יוסר לחלוטין.הקצה חייב להיות קשיח יחסית, אך צר מספיק כדי לשמש ככלי חיתוך. לאחר מכן, הדליקו מבער בנזן והניחו את קצה פיפטת פסטור מזכוכית בחלק הכחול של הלהבה; סובבו את הפיפטה כך שהקצה יימס והחור ייסגר לחלוטין, ובכך ייווצר קצה עגול סגור. ליצירת גשרי זכוכית, השתמשו בפינצטה סטנדרטית ארוכה כדי לשבור בזהירות חתיכות של זכוכית מכסית בגודל 3 מילימטר על 3 מילימטר.לאחר מכן, החזיקו את פיסת זכוכית הכיסוי בעזרת פינצטה והניחו את הזכוכית בלהבה עד שכל ארבעת הקצוות יתרככו ויתכופפו כלפי מטה ויצרו כיפת זכוכית זעירה. בשלב הבא, רפדו צלחת פטרי מפלסטיק בקוטר 60 מילימטר בחימר פיסול בצבע אדום, לבן או צהוב. מלאו את הצלחת ב-3%phi.הכינו תמיסת 0.5 XMBS. לאחר מכן, השתמשו בכלי עיגול מחומם בלהבה כדי ליצור 40 עד 60 שקעים רדודים בעומק של שני עד שלושה מילימטרים, בערך בעומק גופו של עובר בשלב 20, בתוך החימר 48 שעות לפני הניסוי. השגיו ביצים מנקבות צפרדעים והפריו אותן in vitro.לאחר השזרקת העוברים ב-capped membrane, GFP mRNA ובכל מסר נוסף, אחסנו אותם בטמפרטורה של 15 °C למשך 48 שעות עד שיגיעו לשלב 19 עד 20. ביום ניסוי ההשתלה, השתמשו במיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לבחור את העוברים המוזרקים המראים פלואורסצנציה בהירה ואחידה. לאחר ניגוב משטח העבודה, המיקרוסקופ הסטראו והכלים ב-70% ethanol, השתמשו בפינצטה מסוג 5 45 dumont כדי להסיר את קרומי הוויטלין (Vitale membrane) של כל עובר נבחר תחת מיקרוסקופ סטראו.לאחר מכן, השתמשו בפיפטה מדורגת מפלסטיק שקצהה גזור כדי להעביר את עוברי המארח אל צלחת העבודה. היזהרו שלא להביא את העוברים למגע עם הממשק בין המים לאוויר. הכניסו את העוברים כאשר הצד האחורי פונה כלפי מטה אל תוך השקעים בחימר, והשתמשו בפינצטה כדי לסגור בעדינות את החימר סביב בסיסו של כל עובר, כך שהראש יבלוט מהשקע. כדי להסיר את התורם פנים כלפי מעלה, הכניסו אחד מהמחטים שנמשכו לתוך ראשו של העובר, משמאל לבלוטת הדבק, בעומק מספיק כדי שהמחט תעבור מהצד החיצוני של העובר, דרך הראש ואל תוך המעי הקדמי.הנח את המחט בתנועה מהירה (Flick) מצד שמאל לצד ימין של הראש, לרוחבה של בלוטת הצמנט כולה, כדי להשיג חיתוך נקי. לאחר מכן, מקם את המחט בתחילת החיתוך בגבולה השמאלי של בלוטת הצמנט והנח את המחט בתנועה מהירה כלפי מעלה עד שתגיע לתחתית העין השמאלית, כדי ליצור חיתוך אנכי מהגבול השמאלי של בלוטת הצמנט ועד לתחתית העין השמאלית. לאחר מכן, מקם את המחט בגבולה הימני של בלוטת הצמנט והנח את המחט בתנועה מהירה כלפי מעלה עד שתגיע לתחתית העין הימנית, כדי ליצור חיתוך אנכי מהגבול הימני של בלוטת הצמנט ועד לתחתית העין הימנית.כדי להסיר את הרקמה במלואה, הניעו את המחט מהחלק התחתון של העין השמאלית לחלק התחתון של העין הימנית, תוך יצירת חתך אופקי שישחרר את הרקמה. כעת דחפו בעדינות את הרקמה שהוסרה אל קצה המחט והרימו אותה דרך התמיכה (buffer) אל החלק בצלחת המכיל עוברים מאכסנים. הסירו את הרקמה מהעובר המאכסן כפי שהודגם כעת, השליכו את המאכסן ואת ה-EAD explan, והכניסו את ה-explan התורם אל החלל שנוצר במאכסן.לאחר שהרקמה התורמת ממוקמת כראוי ומוחדרת בזהירות ובמלואה, הניחו אחד מגשרי הזכוכית שהוכנו מראש על פניו של העובר כדי לקבע את הש transplanted במקומו, והחדירו את קצות הגשר לתוך החימר כדי לייצב אותו. לאחר הפעולה, השאירו את העוברים ללא הפרעה בטמפרטורת החדר למשך שתיים עד שלוש שעות. לאחר שהשתש transplanted החלימו, הסירו בזהירות את גשרי הזכוכית מהעוברים ואת החימר מסביב לבסיסם.לאחר מכן, השתמשו בפיפטת העברה פלסטית מדורגת כדי לשאוב בעדינות את העוברים מהשקעים שלהם. העבירו את העוברים לצלחת פטרי עם תיוג מתאים, המלאה עד מחציתה ב-0.1 XMBS נקי בתוספת Gentamycin, וגדלו את העוברים בטמפרטורה של 15 עד 18 °C למשך מספר ימים עד שיגיעו לשלב 40. החליפו את תמיסת ה-MBS מדי יום ובחנו את הרקמה המושתלת באמצעות פלואורסצנציה כדי לוודא שהרקמה המושתלת (explan) נותרה מחוברת במקומה.יש להחדיר את הרקמות המושתלות באופן מלא לראש המאחס לאחר ההשתלה, כפי שהודגם כעת, והן חייבות להיות מותאמות בגודלן לפתח של המאחס כדי שההשתלה תצליח. רקמת ה-EAD לא צריכה לבלוט מהראש בשום אופן, כפי שניתן לראות בשני התמונות הללו של explan שמוקם באופן שגוי. בנוסף, אין לסובב את השתלת הפנים ביחס למיקומה בגוף התורם, כפי שמוצג כאן.לאחר מספר שעות, הרקמה המושתלה ופני השטח שסביבה אמורות להירפא, ועד למחרת, העובר אמור להיראות כפי שמוצג בדוגמה בתמונות אלו; כפי שהודגם, ניתן להשתמש במיקרוסקופיית פלואורסצנציה כדי לאשר שהשתלה נותרה במקומה במהלך תהליך ההחלמה. בשלב 42, רקמת הבקרה המושתלת תתרום ליצירת הפה ותישאר ירוקה פלואורסצנטית. לאחר צפייה בסרטון זה, צריכה להיות לכם הבנה טובה של האופן שבו משתילים רקמת EAD מעובר אחד לאחר.הפשטת השימוש בשיטה זו לצורך זיהוי השכבה העוברית או האזור ב-EAD שהם הקריטיים ביותר להתפתחות הפנים.

facial-transplants-in-xenopus-laevis-embryos

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

דג הזברה השתלת מאפשר שילוב של גנטיקה אמבריולוגיה ליצור מפלצות רקמות ספציפיות. וידאו זה מדגים gastrula מבוים השתלות תא אפשרו במעבדה שלנו כדי לחקור את התפקידים של אוכלוסיות astroglial ו רמזים הנחיות ספציפיות במהלך היווצרות השליכה בקידמתו.

ממוקד רקמות מפלצות עובריים: דג הזברה Gastrula השתלת תאים

בעלי חיים כמוסות overexpressing הגן המוצר (ים) שנמצאים מושתלים האגף...

רקמות קביעת שווי שימוש בבעלי חיים להשתלות (ACT) Assay ב Xenopus laevis</em

זה פרוטוקול וידאו מדגים שיטה להפקת...

הפקה של טראנסגנטי Xenopus laevis על ידי שילוב אנזימים מתווכת הגבלת והשתלות גרעיני

הסחוסים Craniofacial לפתח בקשר הדוק עם רקמות אחרות וקשה לתפעל חיות לחיות. אנחנו משתמשים electroporation לספק כלים מולקולריים במהלך הצמיחה של השלד craniofacial תוך עקיפת תופעות העוברית המוקדמת. גישה זו תאפשר לנו לבחון ביעילות מולקולות...

Electroporation של Mesenchyme Craniofacial

פרוטוקול זה מתאר כיצד לנתח פסגת premigratory גולגולת עצבית (NC) מneurulas laevis Xenopus. יכול להיות מצופה explants אלה בפיברונקטין ותרבית במבחנה, או מורכב בחזרה לעוברי מארח. טכניקה זו מאפשרת חקר המנגנונים של מעבר NC האפיתל לmesenchyme, הגירה, ובידול.

Dissection של<em&gt; Laevis Xenopus</em&gt; העצבי קרסט עבור<em&gt; במבחנה</em&gt; Explant תרבות או<em&gt; In vivo</em&gt; השתלות

שיטה לכמת את גודלו וצורת orofacial של עוברי laevis Xenopus פותחה. בפרוטוקול זה, מדידות גודל מסורתיות בשילוב עם morphometrics הגיאומטרי כדי לאפשר ניתוחים מתוחכמים יותר של התפתחות וליקויי orofacial.

כימות Orofacial פנוטיפים ב צפרדעים

בעוברי קסנופוס, תאים מגג הבלסטוקואל הם פלוריפוטנטיים וניתן לתכנת אותם ליצירת רקמות שונות. כאן, אנו מתארים פרוטוקולים לשימוש בצמחי גג בלסטוקואל דו-חיים כמערכת בדיקה לחקירת תכונות מפתח in vivo  ו-in vitro של התפתחות עצבית מוקדמת.

כמו תא גזע<em&gt; Xenopus</em&gt; Explants העובריים לחקר תכונות המוקדמות עצבי התפתחותית<em&gt; במבחנה</em&gt; ו<em&gt; In vivo</em

גנים חיוניים להישרדות מהווים מכשולים טכניים עבור יצירת שורות מוטציה. קפיצת מדרגה עוקף קטלני על-ידי שילוב הגנום עריכה עם השתלת תא נבט הקדמונים ליצירת חיות פראי-סוג נושאת germline מוטציות. קפיצת מדרגה מאפשרת גם הדור יעיל של מוטציות null homozygous דור1 F. . הנה, הצעד השתלת הוא הפגין.

השתלת תא נבט הקדמוני עבור מבוססת על CRISPR/Cas9 וקפיצת המדרגה של צפרדע רפואית

פרוטוקול זה נועד להדגים כיצד להחדיר מיקרוקל DNA/dotap תערובת לתוך eyebuds של יום אחד xenopus זריזה העוברים, וכיצד התמונה ולשחזר חלבון פלורסנט בודדים ירוק (gfp) המבטא האופטית סיבי סוכת ב tectal מידות של . שלמים וחיים של...

הזרקת דנ א לתוך eyebuds ב xenopus זריזה העוברים והדמיה של gfp המבטא האופטי axonal הביע בשלמותו, חי xenopus tadpoles

מאמר זה מתאר טכניקת השתלת רקמות שנועדה לבחון את תכונות האיתות והדפוס של המוח הקדמי הבסיסי במהלך התפתחות הגולגולת.

יצירת כימרות במוח הקדמי של העופות להערכת התפתחות הפנים

מניפולציות עובריות כגון סילוק והשתלת תאים הן כלים חשובים לחקר ההתפתחות המוקדמת. פרוטוקול זה מתאר מכשיר השתלה פשוט ויעיל לביצוע מניפולציות אלה בעוברי דגי זברה.

מכשיר השתלה פשוט ויעיל לעוברי דגי זברה

למדו את שיטת השתלת רקמת פנים EAD ב-Xenopus laevis לחקר התפתחות הראש והפנים. טכניקה זו מאפשרת לחקור אינטראקציות סיגנלינג ולהבין מומים קרניו-פאציאליים בביולוגיה התפתחותית.

השתלת פנים ב

גלה סרטונים נוספים