זיהוי שינויים גנטיים סומטי בדגימות גידול על ידי לכידת אקסון וריצוף מקביל מסיבי

המטרה הכוללת של הליך זה היא לזהות מוטציות סומטיות בגנים הקשורים לסרטן של תאים מרקמת הגידול על ידי שימוש בספריות DNA מרובות ברקוד, ולאחר מכן ריצוף מקביל מסיבי. זה מושג על ידי קשירה ראשונה של מתאמי ריצוף ברקוד לשברי DNA שבודדו מגידולים משומרים. השלב השני של ההליך הוא הכלאה לאוליגונוקלאוטידים ביוטיניים מותאמים אישית, המשלימים את כל האקסונים של ציפוי החלבון של 279 אונקוגנים וגנים מדכאי גידולים.

השלב השלישי הוא לבצע ריצוף מקביל מסיבי של מאגרי הברקוד מהספריות שנלכדו. השלב האחרון הוא לחפש בנתוני הרצף שינויים הקשורים לסרטן עבור 279 הגנים הממוקדים. הליך זה יכול לחשוף מוטציות ברצף, הוספות קטנות, מחיקות קטנות, שינויים במספר העותקים ושינויים מבניים נבחרים.

אז היתרונות העיקריים של טכניקה זו על פני השיטות הקיימות הם שהיא מאפשרת לחקור אקסונים שלמים עבור המוטציות הנפוצות והנדירות כאחד, כמו גם לזהות שינויים גנומיים נוספים כגון אובדן ורווחים של מספר עותקים, ולהשיג רגישות רבה יותר בדגימות הטרוגניות. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הגנומיקה של הסרטן, כגון מהן המוטציות המניעות העיקריות בסוגי סרטן שונים, והאם מוטציות אלו בדגימות קליניות מתואמות עם תוצאות או תגובה לטיפולים ממוקדים? ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על אבחון וטיפול בסרטן מכיוון שניתן לזהות מוטציות באופן פרוספקטיבי ולהשתמש בהן כדי לסייע בהכוונת חולים לטיפולים מתאימים ולניסויים קליניים.

הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית מכיוון שקשה ללמוד שלב נקי דבורים בשל טכניקת זהירות הדרושה בעת שטיפה והתחמקות מ-DNA מחרוזים הכן את תערובת המאסטר לתיקון הקצה. מערבבים את הנפחים המתאימים כדי לקבל 50 מיקרוליטר לדגימה. ציטט את 50 המיקרוליטרים של כל DNA טהור לבארות נפרדות של צלחת מזהה שש בארות.

לאחר מכן הוסיפו 50 מיקרוליטר מתערובת מאסטר תיקון הקצה המוכנה לכל תגובה ודגרו את הצלחת בתרמו-סייקלר למשך 30 דקות בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס כדי לנקות את התגובה. ראשית, הוסף 200 מיקרוליטר של חרוזי XP טהורים של AMP לכל דגימה והעבר בעדינות את כל הנפח למעלה ולמטה 10 פעמים באמצעות פיפטר רב-ערוצי. עקוב אחר זה על ידי דגירה של הצלחת בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות.

לאחר מכן, העבירו את הצלחות למעמד המגנטי והניחו להן להתפנות למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הניקוי, הסר בעדינות והשליך את רוב הסופרנטנט תוך הקפדה לא להפריע לחרוזים. נוזל מסוים עשוי להישאר בבארות.

לאחר מכן הוסיפו בעדינות 200 מיקרוליטר של אתנול 80% טרי לכל דגימה ודגרו את הצלחת בטמפרטורת החדר למשך 30 שניות. פיפטה בזהירות את האתנול וחזור על הכביסה פעם נוספת. לאחר מכן, הניחו לצלחת להתייבש בטמפרטורת החדר עד שכל האלכוהול בורח.

כעת השעו מחדש את החרוזים המיובשים ב -44.5 מיקרוליטר מים סטריליים. הזרימו בעדינות כל דגימה דרך הפיפטה 10 פעמים עם הפליטה האחרונה. שוטפים את כל החרוזים המחוברים לצד הבאר.

כעת דגרו את חרוזי המים התלויים בטמפרטורת החדר למשך שתי דקות, ולאחר מכן העבירו אותם למעמד המגנטי למשך חמש דקות עד שהבארות צלולות. לבסוף, העבירו בעדינות 42 מיקרוליטר של הסופרנטנט השקוף בכל באר, המכיל את הדגימה לבאר חדשה. כעת ניתן לאחסן את הדגימות במינוס 20 מעלות צלזיוס עד שבוע.

התחל בהכנת תערובת מאסטר הזנב D בצינור מיקרו צנטריפוגה סטרילי. הוסף שמונה מיקרוליטר מתערובת מאסטר הזנב המוכנה של DA לכל באר של DNA מתוקן סופי. לאחר מכן דגרו את הצלחת בתרמו-סייקלר למשך 30 דקות בחום של 37 מעלות צלזיוס כדי לנקות את התגובה.

השתמש באותו תהליך המתואר בסעיף הקודם בנפח כפול וסיים על ידי Resus השעיית החרוזים ב-33.75 מיקרוליטר מים סטריליים. בשלב זה, ניתן לאחסן את הדגימות במינוס 20 מעלות צלזיוס עד שבוע. להמשך הכינו תערובת מאסטר קשירה ל-15 מיקרוליטר לתגובה.

הוסף 15 מיקרוליטר מתערובת מאסטר הקשירה לכל באר המכילה את ה-DNA של זנב D. לאחר מכן, הוסף 1.25 מיקרוליטר מתוך 25 המיקרומולר המתאימים. הבא מתאם ברקוד גמיש.

לכל אחד מהם, ובכן, כל דגימה צריכה לקבל מתאם ברקוד נפרד. לאחר טעינת המתאמים, דגרו את הצלחת למשך 15 דקות בחום של 20 מעלות צלזיוס. כעת באמצעות 50 מיקרוליטר חרוזים, בצע ניקוי קשירת מתאם פוסט והשהה את הדגימה במים סטריליים ל -50 מיקרוליטר.

לאחר מכן בצע את תהליך הניקוי בפעם השנייה וסיים עם 23 מיקרוליטר מים. בשלב זה, ניתן לאחסן את הדגימות במינוס 20 מעלות צלזיוס עד שבוע. השלב הבא הוא להגביר כל דגימה, המפורטת בפרוטוקול הטקסט על הפשרת קרח, חוסמי האוליגונוקלאוטידים האוניברסליים והאינדקס, הספרייה הקלה של CCAP ורכיבי לכידת הדור הזריזים, הכוללים את מאגר ההכלאה של con TNA two X ורכיב הכלאה.

ת. כעת הכינו מאגר מילי-מולרי אחד של חוסמי אוליגונוקלאוטידים אינדקס המתאימים לרצפי המתאם הברקודים הספציפיים המשמשים בהכנת הספרייה. שלב מיקרוליטר אחד מכל חוסם ומערבל אותם יחד למשך 10 שניות בצינור חדש של 1.5 מיליליטר, הכינו את תערובת הלכידה המורכבת מחמישה מיקרוליטר של קונטה A במיליגרם אחד למיליליטר, שני מיקרוליטר של חוסם אוניברסלי ושני מיקרוליטר של מאגר החוסם. אגד 24 ספריות מקודדות לתגובה אחת.

הוסף בסך הכל 1 עד 3 מיקרוגרם של ספריית רצף ברקוד במאגר לתמהיל הלכידה. מחוררים 15 עד 20 חורים במכסה באמצעות מהירות מחט של 20 מד או פחות, שואבים את התערובת ברכז ואקום DNA ב-60 מעלות צלזיוס עד שהיא יבשה לחלוטין. לאחר מכן, יש להרטיב את התערובת במאגר הכלאה ורכיב הכלאה A.מכסים את החורים במכסה עם סרט ומערבל את הדגימה למשך 10 שניות.

לאחר מכן צנטריפוגה את התערובת במהירות מקסימלית למשך 10 שניות. כעת, דגרו לזמן קצר את התערובת ב-95 מעלות צלזיוס כדי לפגוע בדנטורציה של ה-DNA. עקוב אחר זה עם 10 שניות של צנטריפוגה במהירות מקסימלית בטמפרטורת החדר בתערובת צינור PCR של 0.2 מיליליטר 2.25 מיקרוליטר של ccap בדיקות לכידת ספרייה קלה לאותו נפח של מים סטריליים ללא נוקלאז.

ואז בתגובת הצנטריפוגה מערבבים לצינור וזורמים בעדינות את הנפח הכולל דרך קצה פיפטה 10 פעמים. כעת דגרו את הצינור של 0.2 מיליליטר במחזור תרמי בטמפרטורה של 47 מעלות צלזיוס למשך 48 עד 96 שעות. שמור על טמפרטורת המכסה של המחזור התרמי על 57 מעלות צלזיוס כדי למנוע אידוי ולייצב את טמפרטורת התגובה ימים לאחר מכן.

השתמש בשלבים לשטיפה ושחזור של ה-DNA שנלכד. לאחר מכן השתמש בפרוטוקול Gen זריז שונה של Roche כדי להגביר את גימור ה-DNA שנלכד על ידי כימות ה-DNA המוגבר שנלכד באמצעות מבחן הרגישות הגבוהה של קיוביט. מאגר אחד של 24 ספריות רצף ברקוד שהכילו 12 זוגות נורמליים של גידול נלכד באמצעות בדיקות של 279 גנים סרטניים ורוצף כשניים על ידי 75.

קריאות זוג בסיסים בנתיב יחיד של גידול תאי זרימה HighSeq 2000 וספריות רגילות אוחדו ביחס של שניים לאחד. תמונת ה-IGV מציגה את הספציפיות של כיסוי הרצף באקסונים של EGFR בסרטן ריאות פסים אפורים מייצגים קריאות רצף ייחודיות. המוטציה ההטרוזיגוטית T two G מימין הייתה נוכחת ב-24% מהקריאות, מה שמצביע על כך שמדובר בהחלפת חומצת אמינו סומטית L 8 58 R.

אף אחת מהקריאות של רקמת ריאה תקינה לא הראתה את מוטציית TTA G זו, כמה אינדלי בגידול סרטן המעי הגס, זוג נורמלי הראה החדרת מסגרת סומטית למחשב או מחיקה סומטית של שבעה זוגות בסיסים. ב-TP 53 נצפו גם שינויים במספר העותקים בין זוגות נורמליים של הגידול. כל נקודת נתונים מייצגת אקסון יחיד מ-279 גני מטרה.

רווחים והפסדים של מספר עותקים מוסקים מעליות וירידות ברצף הגידול כיסוי לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שש וחצי שעות לשיתוף הכנת ספרייה ו-48 עד 96 שעות להכלאת לכידה אם מבוצעת כראוי. בעוד שביצוע בדיקה זו חשוב ביותר להיזהר ממזהמים במהלך הכנת הספרייה, מכיוון שהיא עלולה לבלבל ניתוח נתונים בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו ריצוף סנגר וניתוח שברים על מנת לענות על שאלות כמו, כיצד אוכל לאמת שינוי מפוקפק? לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להכין ספריות DNA מקודדות ולבצע לכידת אקסון בספריות המאגר הללו.