איתור, חזותי וquantitating הדור של מינים חמצן תגובתי במערכת מודל אמבה

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לספק פתרון קל ורב-תכליתי לניטור מיני חמצן ריאקטיביים שונים או ROS ולוקליזציה שלהם ולספק תובנות נוספות לגבי מנגנונים תאיים הקשורים ל-ROS. זה מושג על ידי ביצוע שלוש בדיקות שונות, הראשונה שבהן משתמשת בחרוזים ירוקים או מצופים OB G ומיקרוסקופיה חיה, ob g fluorescein ו-Alexa. פלואור 594 מחוברים קוולנטית לפני השטח של שלושה מיקרונים חרוזי סיקה באמצעות BSA.

פליטת הקרינה מהפלואורסצין OBG מצביעה על החמצון על ידי ROS, בעוד שהאות מ-Alexa Fluor 594 מסייע למקם את החרוזים ומשמש כבקרה לכימות הקרינה. השיטה השנייה משתמשת בבדיקה הרגישה לסופראוקסיד דיהידרו אתידיום או DHE בבדיקה מבוססת קורא צלחות. כתוצאה מחמצון על ידי סופראוקסיד, אתידיום מסוגל להשתלב ב-DNA גרעיני ומיטוכונדריאלי והעביר את שיאי העירור והפליטה ב-522 ננומטר ו-605 ננומטר בהתאמה.

עוצמת הקרינה של AUM תואמת את כמות ייצור הסופראוקסיד, ומאפשרת מדידה כמותית של יצירת סופראוקסיד תוך תאית בתאים. השיטה השלישית היא גם בדיקה מבוססת קורא לוחות. הגשושית הרגישה למי חמצן plex אדומה במיוחד או UR משמשת למדידה כמותית של ייצור מי חמצן חוץ-תאי.

עוצמת הפלואורסצנט של UR OX תואמת את כמות מי החמצן המיוצרת מחוץ לתאים. מתקבלות תוצאות המראות לוקליזציה של יצירת ROS דינמית על סמך מבחני O-B-G-D-H-E ו-UR. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני השיטות הקיימות האחרות כגון OB GSA מבוסס קצב צלחות, הוא שהיא מדמיינת באופן דינמי את דור אל רוט ברמת התא הבודד.

במקום שיקוף וממוצע אות רוט מאוכלוסיית תאים. שיטות מיצוע אוכלוסייה כאלה נוטות לטשטש מידע קריטי עקב פגוציטוזיס לא סינכרוני. כדי להתחיל בהליך קידוד חרוזים עם אוקסי, ברט גרין או OBG, הוסף מיליליטר אחד של תרחיף של חרוזי סיליקה קרבוקסיל 3.0 מיקרון לצינור של 1.5 מיליליטר.

סובב את הצינור הסר במהירות את הסופרנטנט. הוסף מיליליטר אחד של PBS ומערבולת באופן זה. שוטפים את החרוזים שלוש פעמים עם PBS.

לאחר הכביסה השלישית, הסר את הסופרנטנט והשהה מחדש את החרוזים. במיליליטר אחד של PBS המכיל 25 מיליגרם למיליליטר ציאניד, יש להכין את תמיסת הציאניד בכל פעם לפני השימוש לדגור על גלגל למשך 15 דקות. זה יפעיל את חרוזי הסיליקה הקרבוקסיליים כדי לקשור קוולנטית BSA מסומן מראש לאחר 15 דקות, לצנטריפוגה את הצינור, להסיר את הסופרנטנט.

הוסף מיליליטר אחד של מאגר צימוד ושטיפת מערבולת שלוש פעמים עם מאגר צימוד על ידי סיבוב מהיר ומערבולת כדי להסיר עודפי ציאניד, ערבב את החרוזים השטופים עם 500 מיקרוליטר של מאגר צימוד המכיל מיליגרם אחד של OBGH שני H-F-F-B-S-A ולאחר מכן מלא את הצינור בגז חנקן מפחית גז רגילה. לאחר סגירת הצינור המודגר על גלגל למשך 14 שעות בטמפרטורת החדר בחושך למחרת, הרוו את ה-OBG הלא תגובתי על ידי שטיפת החרוזים פעמיים עם מיליליטר אחד של מאגר מרווה על ידי סיבוב מהיר ומערבולת ואז שטפו פעמיים עם מאגר צימוד כדי להסיר את מאגר המרווה. לאחר הסרת הסופרנטנט, הוסף מיליליטר אחד של מאגר צימוד המכיל 50 מיקרוגרם של LOR 594 cin אסטר אמצעי כדי להצמיד ל-BSA.

מלאו את הצינור במכסה חנקן ודגרו על גלגל למשך 1.5 שעות בטמפרטורת החדר בחושך. בתום הדגירה של שעה וחצי, עצרו את התגובה על ידי שטיפת החרוזים שלוש פעמים עם מיליליטר אחד של מאגר מרווה. לאחר מכן שוטפים את החרוזים שלוש פעמים עם מיליליטר אחד של PBS.

לבסוף, ריי, תלה את החרוזים במיליליטר אחד של PBS עם שני מיקרוליטר של 10% משקל לנפח. אזיד לאחסון לטווח הארוך. מדוד את ריכוז החרוזים בתרחיף בעזרת ציטומטר המו, זה בדרך כלל אחד עד פעמיים 10 עד התשיעי חרוזים למיליליטר.

מלאו את הצינור במכסה חנקן ואחסנו אותו ארבע מעלות צלזיוס בחושך. התחל הליך זה על ידי קצירת תאי אליום הגדלים באופן אקספוננציאלי מצלחת פטרי בגודל 10 סנטימטרים. צפיפויות שונות של תאים על צלחות של שלושה סנטימטרים עם תחתית פלסטיק או זכוכית שקופה אופטית ומגדלים אותם למשך הלילה למחרת בבוקר.

בחר את המנות שהן בערך 80% מתכנסות לשימוש בניסוי. החלף את מדיום התרבית בזרימה נמוכה או במדיום LF ודגר במשך שעתיים לפני הניסוי על מנת להפחית את האוטופלואורסצנציה החוץ-תאית והאנדוזומלית של מדיום התרבות HL five C. ממיסים 10 מיליליטר של אגר 1.5% BDO במדיום LF, ויוצקים את האגר על משטח ישר על מנת ליצור שכבת אגר בעובי של כמילימטר.

המתן 10 עד 15 דקות עד שהאגר יתמצק. חותכים את שכבת האגר לריבועים של שניים על שני סנטימטרים ומניחים במדיום LF למועד מאוחר יותר. שימוש. תקן את מיקרוסקופ השדה הרחב.

הגדר את הטמפרטורה של תא הסביבה ל-22 מעלות צלזיוס והתאם את ההגדרות הנדרשות לניסוי. לאחר שעתיים של דגירה, שאפו את מדיום ה-LF מהצלחת של שלושה סנטימטרים, אך השאירו את התא חד-שכבתי מכוסה בסרט דק של מדיום. מדללים את החרוזים המצופים OBG שהוכנו בעבר ל -1.5 פעמים 10 עד החרוזים השביעיים למיליליטר ומוסיפים 10 מיקרוליטר לשכבת התא.

קח דף אגר מרובע אחד ונקז את כל עודפי הנוזלים, אך שמור את האגר רטוב. הניחו בעדינות את ריבוע האגר על גבי שכבת התא. שכבת האגר מגבירה את המגע בין חרוזים לתאים, ובכך משפרת את הספיגה.

זה גם דוחס מעט את התאים, ושומר אותם טוב יותר במישור המוקד של המטרה. מניחים את המכסה על הכלי להצלחת הניסוי. אל תזיז את שכבת ה-AGA כשהיא מכסה את התאים וגם זה קריטי להתחיל את שלב ההדמיה באופן מיידי.

לאחר מכן, הניחו את המנה על במת המיקרוסקופ וצלמו באופן אוטומטי בערוצים האדומים, הירוקים והפאזה כל דקה למשך שעתיים או יותר. כדי למדוד את ייצור ה-ROS, בחר והתמקד באירועים תאיים המכילים את כל תהליך הפגוציטוזה. באמצעות תוכנת עיבוד תמונה מקצועית, מזג את שלושת הערוצים המותאמים והרכיב את התמונות לסרט.

כמת את עוצמות הקרינה של כל אחד מהחרוזים שנבחרו בערוצים האדומים והירוקים. היחס בין אדום לירוק ישקף את הייצור הדינמי של FOMO R os של התאים. כדי למדוד תחילה את ייצור הסופראוקסיד התוך-תאי, יש לאסוף צלחת אליום של 180% ב-10 מיליליטר של תאי אליום צנטריפוגה בינוניים HL 5 C ב-850 פעמים G למשך חמש דקות ולשאוף בזהירות ובאופן מלא את תאי ההשעיה הבינונית בתאי ספירת חיץ SS 6.4 ולדלל לצפיפות סופית של שש פעמים 10 לששת התאים למיליליטר.

הוסף 50 מיקרוליטר של תרחיף תאים לכל באר של צלחת לבנה לא שקופה של 96 בארות דיהידרו אתידיום מדולל או מלאי DHE 500 קיפול עם מאגר SS 6.4. ואז השתמש בפיפטה רב-ערוצית כדי להוציא 50 מיקרוליטר מה-DHE המדולל לכל באר של צלחת 96 הבאר. הריכוז הסופי של DHE הוא 30 מיקרומולר.

התגובה תתחיל מיד. ניתן להוסיף גירויים או מעכבים בשלב זה או בנקודות זמן אחרות בהתאם לצרכים הספציפיים. דגרו על התאים עם טלטול בינוני בטמפרטורה של 22 מעלות צלזיוס.

קרא פלואורסצנטי עם קורא מיקרו-פלטות פלואורסצנטיות כל שתי דקות למשך שעה. השתמש במצב הקריאה העליונה של נקודת הקצה עם עירור פלואורסצנטי ב-522 ננומטר ופליטה ב-605 ננומטר. התחל הליך זה על ידי הכנת צלחת 96 בארות עם תאי דיום כפי שהודגם בקטע הקודם.

הכן פרוקסידאז צנון סוסים מדולל או HRP על ידי הוספת חמישה מיקרוליטר של מלאי HRP לתוך 10 מיליליטר של מאגר SS 6.4. הפוך את הצינור כדי לערבב היטב ולשמור על קרח. תמיסת ה- HRP המדוללת היא 0.05 יחידות למיליליטר.

הכן את תערובת התגובה האולטרה-אדומה או ה-UR על ידי ערבוב מלאי ה-UR ותמיסת ה-HRP המדוללת למאגר SS 6.4 לריכוזים סופיים של 6.25. מיקרומולרית UR ו-0.005 יחידות למיליליטר. HRP מוסיפים 50 מיקרוליטר של תערובת UR לכל באר.

התגובה תתחיל מיד. ניתן להוסיף גירויים או מעכבים בשלב זה או בנקודות זמן אחרות בהתאם לצרכים הספציפיים. דגרו על התאים עם טלטול בינוני בטמפרטורה של 22 מעלות צלזיוס.

קרא פלואורסצנטי עם קורא מיקרו-פלטות פלואורסצנטיות כל שתי דקות למשך שעה. השתמש במצב הקריאה העליונה של נקודת הקצה עם עירור פלואורסצנטי ב-530 ננומטר ופליטה ב-590 ננומטר. יעילות הציפוי של ה-OB g fluorescein נבדקת על ידי שימוש במי חמצן ו-HRP כדי לחמצן את החרוזים המצופים במבחנה ובדיקת ספקטרום הפליטה באמצעות עירור ב-500 ננומטר.

כפי שמוצג בגרף זה, החרוזים המחומצנים מראים שיא פליטה משמעותי ב-538 ננומטר בהשוואה לזה של חרוזים לא מחומצנים עם יחס עוצמה של לפחות פי 11 עד 12. ניתן להמחיש את יצירת ה-ROS בפאגוזומים בתאי דיום באופן איכותי ודינמי על ידי מיקרוסקופיה כפי שמוצג בסרטון זמן-lapse מייצג זה שהוקלט במשך 40 דקות באמצעות הגדלה של פי שש במהלך הדקה הראשונה לאחר העלייה. על ידי פגוציטוזיס, הקרינה של חרוזים מצופים פלואורסצ OBG השתנתה מאדום לכתום בוהק, מה שמצביע על כך ש-ROS ככל הנראה נוצרו ישירות בתוך הפאגוזומים.

ייצור סופראוקסיד תוך-תאי ומי חמצן חוץ-תאיים נמדדים כמותית על ידי מבחני DHE ו-UR בהתאמה. מוצג סיכום של התגובות הביוכימיות הקשורות לשתי הבדיקות הללו. סופראוקסיד מומר למי חמצן על ידי סופראוקסיד דיסמוטאז או SOD ומי חמצן מומרים למים וחמצן על ידי קטלאז בבדיקת HEE.

קורא מיקרו-פלטות משמש למדידה כמותית של תפוקה בינונית של סופראוקסיד תוך תאי. ניסוי מייצג מראה שכאשר מגורה עם ליפופוליסכריד LPSA מ-e coli, ייצור הסופראוקסיד הדינמי משני תאי AX גבוה משמעותית מהרמה הבסיסית משני תאים AX לא מגורים והרקע של התגובה במאגר, הירידה של הקרינה הכחולה ועליית הקרינה האדומה נמצאים בקורלציה הפוכה. כצפוי.

הלוקליזציה של ייצור R os הנמדדת על ידי בדיקת DHE מאושרת על ידי התוצאות הבאות. תוספת של מעכב סופראוקסיד דיסמוטאז ממברנת D-E-D-T-C-A הגדילה את אות ה-DHE באופן תלוי מינון המצביע על כך ש-D-E-D-T-C גרם להצטברות של מצע הסופראוקסיד דיסמוטאז. לחלופין, תוספת של מרווה מי חמצן IMP ממברנה לא השפיעה על ייצור הסופראוקסיד בבדיקת A UR.

קורא מיקרו-פלטות משמש למדידה כמותית של תפוקה בינונית של ייצור מי חמצן חוץ-תאי. ניסוי מייצג מראה כי כאשר מגורה עם LPS, ייצור מי החמצן הדינמי משני תאים AX גבוה משמעותית מהרמה הבסיסית של שני תאים AX שאינם מגורים ותגובת הרקע כאשר מטופלים בריכוזים שונים של D-E-D-T-C או קטלאז, אות A UR יורד באופן תלוי מינון עקב עיכוב ייצור מי חמצן מסופראוקסיד תוך תאי ודלדול מי חמצן חוץ-תאיים בהתאמה. הטיפולים ב-D-E-D-T-C וקטלאז אישרו במפורש כי מבחני DHE ו-UR מודדים באופן ספציפי סוגים שונים ולוקליזציות תת-תאיות של ROS Indicum בעקבות הליך זה.

ניתן לבצע שיטות אחרות כגון שיקוף דור רוס במהלך זיהום בחיידקים פתוגניים או לא פתוגניים על מנת לענות על שאלות נוספות כגון כיצד סוס דיקטל יגיב לזיהום חיידקים שונים במונחים של יצירת אובדן. ואל תשכח שעבודה עם חיידקים פתוגניים כגון מיקרובקטריה, מרום עלולה להיות מסוכנת ביותר, ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות כגון BSL מתאים, שני אמצעים בעת ביצוע הליך זה.