Name: איתור, חזותי וquantitating הדור של מינים חמצן תגובתי במערכת מודל אמבה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-05T18:30:00.000+00:00
Duration: 16 min 41 s
Description: למדו לנטר מינים חמצן תגובתי (ROS) באמבה ותאי יונקים באמצעות מיקרוסקופיה חיה ושיטות פלואורסצנטיות. פרוטוקולים אלה מאפשרים ניתוח איכותני וכמותי של ROS ברמת התא הבודד.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

אנו מודים לד&quot;ר קרל היינץ קראוזה ווינסנט ג&#39;וקס לעזרה וייעוץ להקמת פרוטוקולים אלה, וגם להודות כריסטוף באואר וג&#39;רום Bosset מפלטפורמת bioimaging של NCCR וד&quot;ר Navin Gopaldass לתמיכה הטכנית שלהם. המחקר נתמך על ידי מענק ProDoc של שוויצרי הקרן הלאומית למדע.

1. ויזואליזציה ומדידה איכותית של ROS הייצור בPhagosomes צריכים להיות מוכנים חרוזים מצופים OBG מראש. נהלי ציפוי חרוזים וטכניקת כיסוי אגר מעובדים מאזכור פורסם 5,14. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מיליליטר של השעיה 3.0 מיקרומטר חרוזים carboxylated סיליקה (כ 1.8 x 10 9 חרוזים) לתוך צינור 1.5 מיליליטר, לשטוף את החרוזים 3x עם 1 מיליליטר של PBS על ידי ספין וvortexing מהירים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend את החרוזים 1 מיליליטר של PBS המכיל 25 מ&quot;ג / מיליליטר cyanamide (כדי להפעיל את חרוזים סיליקה carboxylated לקוולנטית לאגד prelabeled BSA), דגירה על גלגלים ל15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 3x לשטוף עם 1 מיליליטר של חיץ צימוד (0.1 borate M נתרן, pH 8.0) על ידי מהיר ספין (צנטריפוגות במלוא המהירות בצנטריפוגה מיני בראש הטבלה למשך 5 שניות או לחלופין צנטריפוגות XG ב 2000 דקות 1 בצנטריפוגה בראש טבלה) ו vortexing להסיר cyanamide העודף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את חרוזים נשטפו עם 500 μl של גoupling מאגר המכיל 1 מ&quot;ג של OxyBurst גרין (OBG) H2HFF (Dihydro-2 &#39;, 4,5,6,7,7&#39;-hexafluorofluorescein)-BSA, למלא את הצינור עם גז חנקן מגז יכול סטנדרטי לפני הסגירה, ו לדגור על גלגלים ל14 שעה (לילה) בשעה RT בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את החרוזים 2x עם 1 מיליליטר של מרווה חיץ (250 מ&quot;מ glycin PBS) כדי להסיר OBG unreacted, ופעמים עם חיץ צימוד כדי להסיר את חיץ מרווה ידי ספין וvortexing מהירים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מיליליטר של חיץ צימוד המכיל 50 מיקרוגרם של אסתר 594 succinimidyl אלקסה פלואוריד כדי להטות לארגון ה-BSA. מלא את הצינור עם חנקן לפני הסגירה, ולדגור על גלגלים ל1.5 שעות בטמפרטורת חדר בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את החרוזים 3x עם 1 מיליליטר של מרווה חיץ ידי ספין וvortexing כדי לעצור את התגובה מהיר, ולאחר מכן לשטוף את החרוזים 3x עם 1 מיליליטר של PBS על ידי ספין וvortexing מהירים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבסוף, resuspend את החרוזים 1 מיליליטר של PBS עם 2 μl של 10% w / v אזיד עבור אחסון לטווח ארוך. מדוד את concentration של חרוזים בהשעיה עם hemocytometer (בדרך כלל סביב 1-2 x 10 9 חרוזים / ml), למלא את הצינור עם חנקן לפני הסגירה, ולאחסן ב 4 ° C בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יעילות הציפוי של העמסת OBG ניתן לבדוק על ידי בדיקת ספקטרום הפליטה באמצעות עירור ב500 ננומטר. כאשר חמצון על ידי H 2 O 2 בנוכחות חזרת peroxidase (HRP), עוצמת הקרינה של חרוזים חמצון, בשיא פליטה (538 ננומטר), היא גבוהה יותר 11-12x יותר מזה של חרוזים מצופים nonoxidized. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקציר גדל באופן אקספוננציאלי תאי Dictyostelium מצלחת פטרי 10 סנטימטר, צלחת צפיפויות שונות של תאים על 3 מנות סנטימטר עם פלסטיק ברור אופטי או בתחתית כוס, ולגדל אותם בין לילה. בחר את המנות שהן מחוברות% על 80 לצורך הניסוי. פרוטוקול מפורט לטיפוח תאי Dictyostelium כבר פורסם 15. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף את מדיום התרבות עם מדיום LoFlo (בינוני LF), דגירה של2 שעות לפני הניסוי על מנת להקטין את autofluorescence תאי וintraendosomal של מדיום תרבות HL5C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במקביל, להמס 10 מיליליטר 1.5% אגר bacto במדיום LF, יוצק אגר על גבי משטח שטוח (כלומר צלחת זכוכית של 10 סנטימטר x 10 סנטימטר) כדי ליצור שכבה אגר על 1 מ&quot;מ עובי, להמתין ל10-15 דקות כדי לחזק. חותכים את השכבה אגר לתוך 2 ס&quot;מ X 2 סנטימטר ריבועים ומקום במדיום LF לשימוש מאוחר יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בינתיים מכין את ספינינג הדיסק או מיקרוסקופ שדה רחב, לקבוע את הטמפרטורה של החדר הסביבתי ב22 ° C ולהתאים את ההגדרות לניסוי זה. (ראה הערות נוספות בדיון). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 2 שעות של דגירה, לשאוב את מדיום LF מצלחת 3 סנטימטר, אבל monolayer התא עדיין צריך להיות מכוסה על ידי שכבה דקה של מדיום. לדלל את חרוזים מצופים ל1.5 x 10 7 מיליליטר / חרוזים, ולהוסיף 10 μl על שכבת התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח גיליון אגר מרובע אחד, ניקוז נוזל עודף אבל לשמור על רטוב. בעדינות לשים את הכיכר אגר דואר על גבי שכבת התאים. אל תזיז את הכיכר אגר כאשר הוא שוכב על התאים. הכיסוי אגר משמש להגברת קשר בין חרוזים ותאים, ובכך לשפר את הספיגה, וזה גם מעט דוחס את התאים, שמירה טובה יותר להם במישור המוקד של המטרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את המכסה על הצלחת, מניח אותו על הבמה מיקרוסקופ, ובאופן אוטומטי לצלם בערוצים האדומים, ירוק ושלב כל 1 דקות לשעה 2 או יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר ולהתמקד באירועים סלולריים המכילים את כל התהליך של phagocytosis. מיזוג 3 הערוצים מותאמים ולהרכיב את התמונות לסרט באמצעות תוכנת עיבוד תמונה מקצועית. לכמת עוצמות הקרינה של כל חרוזים שנבחרו בערוצים אדומים וירוקים, והיחס ירוק / אדום ישקף את ייצור ROS phagosomal הדינמי של התאים. </li></ol> 2. מדידת תפוקה בינונית כמותי ושל תאית Superoxide הפקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף one 80% צלחת ומחוברות של Dictyostelium ב10 מיליליטר של מדיום HL5C. צנטריפוגה תאי Dictyostelium ב850 XG במשך 5 דקות, בזהירות ובינוני עודפים לשאוב לחלוטין. תאי resuspend במאגר SS6.4 [0.12 M סורביטול במאגר סורנסן (14.69 מ&quot;מ KH 2 PO 4 ו6.27 מ&quot;מ Na 2 HPO 4), pH 6.4], לספור תאים ו לדלל את צפיפות סופית של 6 x 10 6 תאים / מיליליטר (ראה הערות נוספות בדיון). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 μl של השעיה תא לתוך באר כל צלחת לא שקופה לבנה 96 היטב (ראה הערות נוספות בדיון). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל מניות DHE (30 מ&quot;מ DMSO) קיפול 500 עם SS6.4, פיפטה 50 μl של DHE המדולל לזה גם בעזרת פיפטה רבה במידת צורך. הריכוז הסופי של DHE הוא 30 מיקרומטר. התגובה מתחילה באופן מיידי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתן להוסיף גירויים או מעכבים, בשלב זה, או בנקודות זמן אחרות בהתאם לצרכים ספציפיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בסופו של דבר הנקודה &quot;ראש הקריאה &amp; #34; מצב של קורא microplate הקרינה, עם עירור הקרינה / פליטה ב522 ננומטר nm/605, לקרוא כל 2 דקות לשעה 1, לנער בינוני 5 שניות / דקות, על 22 ° C. </li></ol> 3. הפקת H כמותי ותפוקה גבוהה מדידה של תאי 2 O 2 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע את השלבים כפי שתואר ב2.1 ו2.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן HRP המדולל על ידי הוספת 5 μl של מניית HRP (100 U / ml במים מזוקקים) ל10 מיליליטר של SS6.4, מערבולת או להפוך את הצינור לערבב היטב ולשמור על קרח לשימוש מאוחר יותר. פתרון HRP בדילול מלא הוא ב0.05 U / ml. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכין את תערובת תגובת AUR ידי ערבוב מניית AUR (10 מ&quot;מ AUR DMSO) ופתרון HRP המדולל למאגר SS6.4 לריכוזים הסופיים של 6.25 מיקרומטר, ו0.005 U / ml, בהתאמה. כדוגמא, כדי להכין את תערובת התגובה ל40 תגובות, לערבב 1600 μl של SS6.4 עם 400 μl של HRP בדילול מלא ו2.5 μl של פתרון מניות AUR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 μl תמהיל AURture לזה גם בעזרת פיפטה רבה במידת צורך. עכשיו מתחילה להיוצר התגובה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתן להוסיף גירויים או מעכבים, בשלב זה, או בנקודות זמן אחרות בהתאם לצרכים ספציפיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במצב נקודת הסיום &quot;הקריאה הראשונה&quot; של קורא צלחת מיקרו הקרינה, עם עירור הקרינה / פליטה ב530 nm/590 ננומטר, לקרוא כל 2 דקות לשעה 1, לנער בינוני 5 שניות / דקות, על 22 ° C. </li></ol>

<ol><li>Bedard, K., Krause, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+NOX+family+of+ROS-generating+NADPH+oxidases%3A+physiology+and+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">The NOX family of ROS-generating NADPH oxidases: physiology and pathophysiology.</a> Physiol. Rev. 87, 245-313 (2007).</li>
<li>West, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TLR+signalling+augments+macrophage+bactericidal+activity+through+mitochondrial+ROS%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">TLR signalling augments macrophage bactericidal activity through mitochondrial ROS.</a> Nature. 472, 476-480 (2011).</li>
<li>Fey, P., Gaudet, P., Pilcher, K. E., Franke, J., Chisholm, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((dictyBase+and+the+Dicty+Stock+Center%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">dictyBase and the Dicty Stock Center.</a> Methods Mol. Biol. 346, 51-74 (2006).</li>
<li>Basu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((dictyBase+2013%3A+integrating+multiple+Dictyostelid+species%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">dictyBase 2013: integrating multiple Dictyostelid species.</a> Nucleic Acids Res. 41, 676-683 (2013).</li>
<li>VanderVen, B. C., Yates, R. M., Russell, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraphagosomal+measurement+of+the+magnitude+and+duration+of+the+oxidative+burst%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Intraphagosomal measurement of the magnitude and duration of the oxidative burst.</a> Traffic. 10, 372-378 (2009).</li>
<li>Cohn, C. A., Simon, S. R., Schoonen, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+fluorescence-based+techniques+for+the+quantification+of+particle-induced+hydroxyl+radicals%5BTitle%5D)+AND+%22Part.+Fibre+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Comparison of fluorescence-based techniques for the quantification of particle-induced hydroxyl radicals.</a> Part. Fibre Toxicol. 5, 2(2008).</li>
<li>Snyrychova, I., Ayaydin, F., Hideg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+hydrogen+peroxide+in+leaves+in+vivo+-+a+comparison+of+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Plant%22%5BJournal%5D)">Detecting hydrogen peroxide in leaves in vivo - a comparison of methods.</a> Physiol. Plant. 135, 1-18 (2009).</li>
<li>Rodrigues, J. V., Gomes, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+superoxide+and+hydrogen+peroxide+detection+in+biological+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic.+Biol.+Med%22%5BJournal%5D)">Enhanced superoxide and hydrogen peroxide detection in biological assays.</a> Free Radic. Biol. Med. 49, 61-66 (2010).</li>
<li>Chen, J., Rogers, S. C., Kavdia, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Kinetics+of+Dihydroethidium+Fluorescence+with+Superoxide+Using+Xanthine+Oxidase+and+Hypoxanthine+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Analysis of Kinetics of Dihydroethidium Fluorescence with Superoxide Using Xanthine Oxidase and Hypoxanthine Assay.</a> Ann. Biomed. Eng. , (2012).</li>
<li>Lee, C. W., Chen, Y. C., Ostafin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+accuracy+of+Amplex+Red+assay+for+hydrogen+peroxide+in+the+presence+of+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Nanotechnol%22%5BJournal%5D)">The accuracy of Amplex Red assay for hydrogen peroxide in the presence of nanoparticles.</a> J. Biomed. Nanotechnol. 5, 477-485 (2009).</li>
<li>Guimaraes-Ferreira, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short-term+creatine+supplementation+decreases+reactive+oxygen+species+content+with+no+changes+in+expression+and+activity+of+antioxidant+enzymes+in+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Appl.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Short-term creatine supplementation decreases reactive oxygen species content with no changes in expression and activity of antioxidant enzymes in skeletal muscle.</a> Eur. J. Appl. Physiol. 112, 3905-3911 (2012).</li>
<li>Peng, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutathione+peroxidase+7+protects+against+oxidative+DNA+damage+in+oesophageal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Glutathione peroxidase 7 protects against oxidative DNA damage in oesophageal cells.</a> Gut. 61, 1250-1260 (2012).</li>
<li>Walk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipopolysaccharide+enhances+bactericidal+activity+in+Dictyostelium+discoideum+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Comp.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Lipopolysaccharide enhances bactericidal activity in Dictyostelium discoideum cells.</a> Dev. Comp. Immunol. 35, 850-856 (2011).</li>
<li>Fukui, Y., Yumura, S., Yumura, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agar-overlay+immunofluorescence%3A+high-resolution+studies+of+cytoskeletal+components+and+their+changes+during+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Agar-overlay immunofluorescence: high-resolution studies of cytoskeletal components and their changes during chemotaxis.</a> Methods Cell Biol. 28, 347-356 (1987).</li>
<li>Fey, P., Kowal, A. S., Gaudet, P., Pilcher, K. E., Chisholm, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocols+for+growth+and+development+of+Dictyostelium+discoideum%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Protocols for growth and development of Dictyostelium discoideum.</a> Nat. Protoc. 2, 1307-1316 (2007).</li>
<li>Bloomfield, G., Pears, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superoxide+signalling+required+for+multicellular+development+of+Dictyostelium%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">Superoxide signalling required for multicellular development of Dictyostelium.</a> J. Cell. Sci. 116, 3387-3397 (2003).</li>
<li>Dieckmann, R., Gopaldass, N., Escalera, C., Soldati, T. Autophagosomes and Phagosomes. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDieckmann%2C+R+%22Methods+in+Molecular+Biology%22">Methods in Molecular Biology</a>. Deretic, V. 445, Humana Press. Totowa, NJ. 317-328 (2008).</li>
<li>Amir, Y., Edward, O. -A., Utpal, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+in+vivo+detection+of+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22Proto.+Exch%22%5BJournal%5D)">A protocol for in vivo detection of reactive oxygen species.</a> Proto. Exch. , (2008).</li>
<li>Neuhaus, E. M., Soldati, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+myosin+I+is+involved+in+membrane+recycling+from+early+endosomes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A myosin I is involved in membrane recycling from early endosomes.</a> J. Cell Biol. 150, 1013-1026 (2000).</li>
</ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

בהשוואה לשיטות שתוארו קודם לכן, assay OBG דינמי מדמיין את התהליך של יצירת ROS phagosomal ברמת התא הבודד, במקום למדוד אות ROS ממוצעת מאוכלוסייה של תאים. שיטות אוכלוסיית מיצוע כאלה נוטים לטשטש מידע קריטי הנגרם על ידי phagocytosis nonsynchronous. אנחנו הסתגלנו בהצלחה מבחני DHE וAUR לDictyostelium ומותאמים הפרוטוקולים. והכי חשוב, אנו מצוינים הסוגים ומגוירים subcellular של ROS נמדדו בשני מבחני האלה. יחדיו, המערך השלם של פרוטוקולי מדידת ROS לDictyostelium מספק מערכת שי...

מיני חמצן תגובתי (ROS) מעורבים במגוון רחב של תהליכים ביולוגיים כגון הגנת מארחת, איתות, פיתוח רקמות ותגובה לפציעה, כמו גם יתר לחץ דם וסרטן. מכונות מונואמין NADPH phagosomal למדו היטב מוקדשת לדור ROS המהיר, המכונה פרץ חמצוני, כדי להרוג חיידקי בלע בphagosomes &#39;נויטרופילים 1. בנוסף, זליגה של אלקטרונים כתוצר לוואי של שרשרת הנשימה במיטוכונדריה חשבה בעבר להיות אחראי אך ורק למקור ללא פיקוח של ROS. אבל לאחרונה, זה זוהה כמנגנון חשוב לתרום להרג intraphagosomal של חיידקים במקרופאגים עכבר 2. בשנים האחרונות, האמבה החברתית, Dictyostelium, הפכה למודל רב עוצמה והפופולרי ללמוד מנגנונים פנימיים תא של תגובת החיסון המולדת. ואכן, Dictyostelium וphagocytes האנושי לשתף ברמה גבוהה באופן מפתיע של שימור בmoleculaמנגנונים r אחראים לחיידקים חישה, היבלעות והרג 3,4. Homologs של חלבונים ואנזימים הקשורים לייצור ROS או סילוק רעלים, כגון oxidases NADPH, catalases, dismutases סופראוקסיד, ניתן למצוא בשני בני אדם וDictyostelium. כמו האמבה למדה הטוב ביותר, Dictyostelium מציג מספר יתרונות ייחודיים על פני מערכת מודל של יונקים. הם גדלים בטמפרטורת חדר ללא הצורך בCO 2, עם זמן הכפלה של 8-10 לשעה. הם יכולים להיות כל הזמן בקלות כמו תרבויות חסיד או השעיה. בנוסף, הודות להגנום הפלואידים הרצף מלא והמבואר שלהם, ולמניפולציה גנטית קלה, Dictyostelium הפך אורגניזם מודל ניסיוני מאוד אטרקטיבי. במחקרים קודמים, נגזרים כלור ופלואור שונים של ההעמסה (הידועה קולקטיבי OxyBurst גרין, OBG) שפולט הקרינה לאחר חמצון על ידי ROS, שימש ככתב ROS. est Cell-permeantנגזרי erified משמשים למדידת ROS cytoplasmic, ואילו או dextran-נגזרי תא impermeant-חלבון בשילוב משמשים למדידת ROS תאי. בפרט, חרוזים מצופים BSA OBG כבר נעשו שימוש כדי לזהות ייצור ROS phagosomal בתאי יונקים 5. עם זאת, הגישה המבוססת על קורא microplate יכולה רק לתת עקומת דור ROS בממוצע מאוכלוסייה של תאים. עם הפרוטוקול הנוכחי, באמצעות Dictyostelium, תא בלען מקצועי, ותנאי ניסוי מותאמים, אנו מקבלים phagocytosis היציב והיעיל מבלי להטות כל opsonin על חרוזים. DHE נעשה שימוש במערכות שונות מודל, כגון נויטרופילים ומקרופאגים יונקים, כדי לזהות ייצור ROS 6-9. בינתיים, יש כמה מחלוקות על הסגוליות והרגישות של 8,10 השיטה. כמו גרסה משופרת של Amplex אדום, עוצמת הקרינה של AUR הוא פחות רגיש לחומציות, מה שהופך אותו מתאימים יותר למדידהROS בחוגי nonneutral או חומצי חלש. AUR הוחל לאחרונה במספר מערכות של יונקים 11,12, אך השימוש בו בדגמי nonmammalian, אשר לעתים קרובות דורשים תקשורת צמיחת חומצי חלש, לא דווח עד כה. בנוסף, אין פרוטוקול שפורסם כמותית ודינמית למדידת ייצור ROS ולוקליזציה באמבה החברתית Dictyostelium. המטרה של הקבוצה של פרוטוקולים שהוצגה היא לספק פתרון קל ותכליתי כדי לפקח ROS שונים והלוקליזציה שלהם, ועוד יותר לתת תובנות מנגנונים תאיים הקשורים ל-ROS. עבור assay OBG, השתמשנו במיקרוסקופ חי כדי לפקח על כל התהליך של דור ROS phagosomal לאחר הספיגה של חרוזים מצופים OBG ידי תאי Dictyostelium, וסיפק גישה חדשה כדי ללמוד את מנגנון הרג intraphagosomal של חיידקים. יש לנו אופטימיזציה מבחני DHE וAUR בינוני תפוקה בDictyostelium, למדוד superox תאיתIDE ו-H 2 O 2 תאי ייצור, בהתאמה, על ידי שימוש בLPS כממריץ ROS חזק. שים לב שLPS הוצג לאחרונה על הגדלת פעילות bactericidal של Dictyostelium כלפי חיידקי phagocytosed 13. בנוסף, הטיפול בDEDTC וקטלאז במפורש אישר כי שתי השיטות הללו באופן ספציפי למדוד סוגים שונים ומגויר subcellular של ROS בDictyostelium. לבסוף, assay OBG יכול להיות מותאם לכל תא phagocytic חסיד, על ידי opsonizing נוסף חרוזים עם ligands לקולטנים phagocytic של תאי חיים. באופן עקרוני, מבחני DHE וAUR יכולים להיות גם למדידות בכל תא חסיד או nonadherent תחת תנאי ניסוי מתאימים מכויל.

<table><tbody><tr><td colspan="4"><חזק>ריאגנטים</חזקים>OxyBURST</td></tr> <tr><td>ירוק H2HFF BSA</td><td>Invitrogen</td><td>O-13291</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594</td><td>Invitrogen</td><td>A-20004</td><td></td></tr><tr><td>חרוזי סיליקה קרבוקסילטים</td><td>Kisker Biotech</td><td>PSi-3.0COOH</td><td></td></tr><tr><td>HL5C בינוני</td><td>לבינוני</td><td>HLC0102</td><td></td></tr><tr><td>LoFlo בינוני</td><td>לבינוני</td><td>LF1001</td><td></td></tr><tr><td>בקטו אגר</td><td>BD</td><td>204010</td><td></td></tr><tr><td>דיהידרואתידיום</td><td>סיגמא</td><td>37291-25MG</td><td></td></tr><tr><td>אמפלקס אולטרה אדום</td><td>Invitrogen</td><td>A36006</td><td></td></tr><tr><td>חזרת פרוקסידאז</td><td>רוש</td><td>10108090001</td><td></td></tr><tr><td>דיאתילדיתיוקרבמט (DEDTC)</td><td>Sigma</td><td>D3506-100G</td><td></td></tr><tr><td>קטלאז</td><td>סיגמא</td><td>C9322-1G</td><td></td></tr><tr><td>ציאנמיד</td><td>סיגמא</td><td>187364-25G</td><td></td></tr><tr><td>ליפופוליסכרידים</td><td>סיגמא</td><td>L2630-25G</td><td></td></tr><tr><td colspan="4" ><חזק>ציוד</חזק></td></tr><tr><td>איבידי &mu;-צלחת 35 מ"מ,</td><td>איבידי</td> גבוה <td>81156</td><td>תחתית עשויה פלסטיק שקוף אופטית</td></tr><tr><td>צלחת MatTek 35 מ"מ</td><td>תאגיד MatTek</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td>תחתית עשויה זכוכית coverslip</td></tr><tr><td>שרביט תא דלפק</td><td>Merck Millipore</td><td>PHCC00000</td><td></td></tr><tr><td>לבן 96 באר צלחת</td><td>Nunc</td><td>236108</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה</td><td>SORVALL</td><td>Legend RT</td><td></td></tr><tr><td>Microplate קורא</td><td>BioTek</td><td>Synergy Mx</td><td></td></tr></tbody></table>

איתור, חזותי וquantitating הדור של מינים חמצן תגובתי במערכת מודל אמבה

Detecting, Visualizing and Quantitating the Generation of Reactive Oxygen Species in an Amoeba Model System

מיני חמצן תגובתי (ROS) מהווים מגוון של מולקולות וקצרות מועד, המכיל חמצן, שהם באופן דינמי interconverted או בוטלו או catalytically או באופן ספונטני. בשל אורך חיים הקצר של רוב ROS והגיוון של מקורותיהם והמגוירים subcellular, ניתן לקבל תמונה שלמה רק על ידי מדידות מדוקדקות באמצעות שילוב של פרוטוקולים. כאן, אנו מציגים סט של שלושה פרוטוקולים שונים באמצעות OxyBurst גרין (OBG) מצופה חרוזים, או dihydroethidium (DHE) וAmplex UltraRed (AUR), כדי לפקח איכותי וכמותית ROS השונים בphagocytes המקצועי כגון Dictyostelium. אנו מותאמים נהלי חרוזים ציפוי וחרוזים מצופים OBG משומשים ומיקרוסקופיה חיות לדמיין דור ROS intraphagosomal דינמי ברמת התא הבודד. זיהינו lipopolysaccharide (LPS) מE. coli כממריץ רב עוצמה לייצור ROS בDictyostelium. בנוסף, אנו דזמן אמת eveloped, מבחני בינוני תפוקה באמצעות DHE וAUR למדוד באופן כמו סופראוקסיד תאיים ו-H 2 O 2 תאי ייצור, בהתאמה.

הדור של ROS בphagosomes ניתן דמיינו איכותי ודינמי על ידי מיקרוסקופ (S1 קובץ). הקרינה האדומה הנפלטת על ידי Alexa פלואוריד 594 היא pH-רגיש ונשאר קבוע בסביבת phagosomal, בעוד חמצון של OBG מגביר הקרינה שלו במסלול הירוק. ספקטרום הפליטה של במבחנה מתחמצן וחרוזים מצופים OBG nonoxidized מושווים באיור 1, מראים עלייה משמעותית בעוצמת לאחר חמצון. כדי להקל על הדמיה של האירועים בשידור חי, שני הערוצים מתמזגים וכתוצאה מהשינויים בצבע מאדום לכתום במהלך phag...

מתאמנים את סט של פרוטוקולים למדידה של מיני חמצן תגובתי (ROS) שניתן ליישם במודלים סלולריים אמבה ויונקים שונים למחקרים איכותיים וכמותיים.

Reactive oxygen species (ROS) comprise a range of reactive and short-lived, oxygen-containing molecules, which are dynamically interconverted or ...

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא לספק פתרון פשוט ורב-גוני לניטור מינים שונים של חמצן רדיקליים (ROS), מיקומם, ומסירת תובנות נוספות לגבי מנגנונים תאיים הקשורים ל-ROS. מטרה זו מושגת על ידי ביצוע שלושה בדיקות שונות, שהראשונה שבהן משתמשת בחרוזי RST green או OB G ובמיקרוסקופיה של תאים חיים; OB G fluorescein ו-Alexa Fluor 594 מקושרים קוולנטית לפני השטח של חרוזי סיליקה בגודל 3 מיקרון באמצעות BSA.פליטת הפלואורסצנציה מ-OBG fluorescein מעידה על חמצון על ידי ROS, בעוד שהאות מ-Alexa Fluor 594 מסייע במיקום החרוצים ומשמש כביקורת לכימות הפלואורסצנציה. השיטה השנייה משתמשת בגשושית הרגישה לסופראוקסיד dihydro ethidium או DHE בבדיקה המבוססת על קורא לוחות. כתוצאה מחמצון על ידי סופראוקסיד, ethidium מסוגל להשתחל לתוך DNA גרעיני ומיטוכונדריאלי, ובעל שיאי עירור ופליטה מוסטים ב-522 nanometers ו-605 nanometers בהתאמה.עוצמת הפלואורסצנציה של AUM תואמת לכמות ייצור הסופראוקסיד, מה שמאפשר מדידה כמותית של יצירת סופראוקסיד תוך-תאי בתאים. השיטה השלישית היא גם בדיקה המבוססת על קורא לוחות. הגשוש plex ultra red או UR, הרגיש למימן פחמון, משמש למדידה כמותית של ייצור מימן פחמון חוץ-תאי.העוצמה הפלורסצנטית של UR OX תואמת לכמות מימן פחמון (hydrogen peroxide) המיוצרת מחוץ לתאים. התוצאות המתקבלות מראות לוקליזציה של ייצור דינמי של

detecting-visualizing-quantitating-generation-reactive-oxygen-species

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

שיטה יעילה כדי להשיג תובנות לדמיין את האינדוקציה אוטוקריני הנגזרות ROS של האנדותל Ca2 + איתות מתואר. שיטה זו מנצלת את מדידת ROS נגזר אוטוקריני מופעלות Ca2 + לגיוס בתאי האנדותל בכלי הדם במודל שיתוף תרבות.

ויזואליזציה של כלי דם Ca 2 + איתות מופעלות על ידי ROS נגזר אוטוקריני

מונואמין NADPH הוא המקור העיקרי של מיני חמצן תגובתי (ROS) בphagocytes. בשל האופי הארעי של ROS, קשה למדוד ולעקוב אחר רמות ROS חי חיות. שיטה פולשנית לכימות סידורית של ROS בעכברים חיים מתוארת.

הדמית פליטת אור של פעילות מונואמין NADPH במודלים של בעלי חיים שונים

סרטון זה מתאר את הטכניקה של הדמיה של עקה חמצונית באורגנואידים בתרבית. עבודה זו מסייעת בהבנת רמת העקה החמצונית עקב הצטברות ROS בסוגי התאים השונים הקיימים באורגנואיד לאחר טיפול במודולטורים שונים של ROS.

בדיקת הדמיה פלואורסצנטית: טכניקה להמחשת עקה חמצונית בתאי אורגנואיד בתרבית של מיני חמצן תגובתי שטופלו על ידי השראת תאים אורגנואידים במעי

כתב יד זה מתאר את השימוש fluorogenic מקודד גנטית כתבים ביישום של הדמיה לחיות תאים עבור הבחינה של xenobiotic-induced סטרס חמצוני. זו גישה נסיונית מציע רזולוציית ייתכן ללא תחרות, רגישות וספציפיות תוך הימנעות רבים את חסרונותיה של שיטות קונבנציונליות המשמש את הגילוי של רעילות סטרס חמצוני.

הדמיה גישות הערכות של רעילות לחץ חימצוני באמצעות חיישנים Fluorogenic מקודד גנטית

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לזהות סה כ חמצן הסלולר מינים (ROS) באמצעות 2 ', 7 '-diכלור דיהידרוטסטוסטרון diאצטט (DCFH-DA). שיטה זו יכולה להמחיש לוקליזציה של רוס הסלולר בתאי חסיד עם מיקרוסקופ פלואורסצנטית ועוצמה ROS מכמת עם קורא צלחת הקרינה. פרוטוקול זה הוא פשוט, יעיל וחסכוני.

גילוי של מינים החמצן תגובתי כוללת בתאי חסיד על ידי 2 ', 7 '-Diכלור דיהידרוטסטוסטרון di, מכתים

פרוטוקול זה מתאר את ההערכה של מצב החמצון הייחודי של תא משנה בתוך התא. בדיקה פלואורסצנטית תלויית-חמצון רגישה מאפשרת ניתוח טימטרי נוח בתאים שלמים.

הערכה של חמצון הסלולר באמצעות מערכת משנית ספציפי לחמצון-רגיש ירוק פלורסנט ירוקה

Escherichia coli הוא הגורם המוביל לדלקת קרום המוח חיידקית גראם שלילית יילודים. במהלך הזיהום החיידקי, מיני חמצן תגובתי המיוצר על ידי נויטרופילים לשחק תפקיד bactericidal גדול. כאן אנו מציגים שיטה לגילוי מינים חמצן תגובתי נויטרופילים בתגובה דלקת קרום המוח E. coli.

כימות בזמן אמת של מינים חמצן תגובתי נויטרופילים נגועים מנינגיטי Escherichia קולי

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה לזיהוי מינים של חמצן תגובתי (ROS) באורגנוידים של מורין במעיים באמצעות הדמיה איכותית ובדיקות ציטומטריה כמותית. עבודה זו יכולה להיות מורחבת באופן פוטנציאלי לבדיקות פלואורסצנטיות אחרות כדי לבדוק את ההשפעה של תרכובות נבחרות על ROS.

ניתוח עקה חמצונית באורגנוידים מעיים מורין באמצעות גשושית פלואורוגנית רגישה למינים של חמצן תגובתי

כאן, אנו מציעים פרוטוקול שיטתי, נגיש, לשחזור כדי לזהות מינים חמצן תגובתי תאית (ROS) באמצעות 2′,7′-dichlorofluorescein diacetate בדיקה (DCFH-DA) בתאי גליה מולר (MGCs). שיטה זו מכמתת את סך רמות ה- ROS התאיות עם ציטומטר זרימה. פרוטוקול זה קל מאוד לשימוש, מתאים וניתן לשחזור.

כימות של מינים חמצן תגובתי באמצעות 2′,7′-Dichlorofluorescein Diacetate בדיקה וזרימה-Cytometry בתאי גליה מולר

פרוטוקול זה מתאר שיטה חדשנית לכימות מיני חמצן תגובתי תוך-תאי (ROS) באמצעות דיהידרואתידיום (DHE) כבדיקת צבע פלואורסצנטי באמצעות גישת סינון בתפוקה גבוהה. הפרוטוקול מתאר את השיטות להערכה כמותית של מיני חמצן תגובתי תוך-תאי (ROS) בשלושת קווי תאי הקרצינומה ההפטוצלולרית השונים.

הערכת סינון בתפוקה גבוהה של ייצור מיני חמצן תגובתי (ROS) באמצעות צבע פלואורסצנטי Dihydroethidium (DHE)

למדו לנטר מינים חמצן תגובתי (ROS) באמבה ותאי יונקים באמצעות מיקרוסקופיה חיה ושיטות פלואורסצנטיות. פרוטוקולים אלה מאפשרים ניתוח איכותני וכמותי של ROS ברמת התא הבודד.

איתור, חזותי וquantitating הדור של מינים חמצן תגובתי במערכת מודל אמבה

גלה סרטונים נוספים