Name: מעיל זרע מצעים Assay לחקור גנטי במבחנה כיצד נביטת זרעי בקרת האנדוספרם ב Thaliana ארבידופסיס (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-09T21:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: חקור את השפעת האנדוספרם על נביטת זרעים ב-Arabidopsis thaliana באמצעות מעיל זרע מצעים Assay. שיטה זו מאפשרת ניתוח גנטי מבוקר של תהליכי נביטה בתנאי מעבדה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהשויצריים הקרן הלאומית למדע ועל ידי המדינה של ז&#39;נבה.

ברגע שSCBA מורכב, הצמיחה של עוברים מנוטרת על פני כמה ימים. לכן, לפני הליך הזרע לנתיחה וההרכבה של SCBA, צריך לעקר זרעים כדי למנוע זיהומים בעתיד שיכול למנוע הערכה נכונה של ההשפעה של חומר מעיל זרע על צמיחה עוברית. 1. עיקור זרע <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים 50-60 μl של זרעי ארבידופסיס בוגרים ויבשים בצינור microcentrifuge 1.5 מ&quot;ל ולהכין פתרון אתנול 70%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מיליליטר של 70% אתנול פתרון לצינור microcentrifuge המכיל את הזרעים ולנער בטמפרטורת חדר למשך 10 דקות ב 1,200 סל&quot;ד בvortexer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צינור microcentrifuge צנטריפוגות במשך 3 שניות ב4,000 XG להתרכז זרעים בחלק התחתון של הצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את פתרון אתנול 70% באמצעות קצה יניקת ואקום שעזב בזהירות את הזרעים בחלק התחתון של צינור microcentrifuge. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מיליליטר של מים מזוקקים סטריליים כדי לא<html> הוא צינור microcentrifuge עדיין מכיל את הזרעים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנער בטמפרטורת חדר למשך 10 דקות ב 1,200 סל&quot;ד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צינור microcentrifuge צנטריפוגות במשך 3 שניות ב4,000 XG להתרכז זרעים בחלק התחתון של הצינור. לשאוב supernatant מים באמצעות קצה יניקת ואקום שעזב בזהירות את הזרעים בחלק התחתון של הצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מיליליטר של מים מזוקקים מים סטריליים לצינור microcentrifuge עדיין מכיל את הזרעים. ודא כי זרימת המים homogenously משהה את הזרעים בתוך הצינור. המטרה כאן היא למנוע טלטול נוסף, כדי לשמור על שלמות הגרעינים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בואו הזרעים להתיישב על ידי כוח הכבידה בחלק התחתון של הצינור על ידי השארת הצינור עדיין ל30 שניות. לשאוב supernatant מים באמצעות קצה יניקת ואקום שעזב בזהירות את הזרעים בחלק התחתון של הצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על פעולה ארבע פעמים על שלבים 1.8-1.9. בסך הכל הליך העיקור לוקח בערך 30 דקות. </li></ol> 2. זרעי ציפוי ontent &quot;&gt; כל הצעדים הבאים מבוצעים בתוך זרימה למינרית לשמור על תנאים סטריליים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן צלחת צלחת פטרי (קוטר 100 מ&quot;מ, 20 גובה מ&quot;מ) המכיל 30 מיליליטר של מדיום נביטה שהוכן על ידי מעוקר תמיסה המכילה 4.3 g / L Murashige ובינוני Skoog ב2.5 מ&quot;מ 2 - (N-morpholino) חומצת ethanesulfonic (MES-KOH ; PH 5.7) ואגר 0.8 גר &#39;/ ליטר. תן הפתרון להתקרר באמבט מים 50 מעלות צלזיוס לפני ששופך אותה על צלחת צלחת פטרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 200 μl של מים מזוקקים סטריליים לצינור המכיל את הזרעים. Resuspend את הזרעים ולהעביר אותם על פני השטח של מדיום הנביטה באמצעות פיפטה סטנדרטית עם טיפ 1 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המים המקיפים את הזרעים על פני השטח של מדיום הנביטה באמצעות קצה יניקת ואקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאר את צלחת פטרי המכילה את הזרעים בלי המכסה שלו בתוך הזרימה למינרית לשעה 2 לייבוש נוסף. סגור את צלחת פטרי עם המכסה ולתת לזה לעמוד מתחת למינריתזרימת ממשלה כ -90 דקות, כך שבערך 4 שעות חלפו מאז תחילתו של הליך עיקור זרעים (שלב 1.2). </li></ol> 3. Dissection הזרע השלבים הבאים מחייבים עבודה עם סטראו הונח בתוך ארון הזרימה למינרית. מלקחיים דומון # 5 עם טיפים קטומים (כלומר קהה) מקל באופן משמעותי את הטיפול בזרעים (איור 1 א). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן צלחת מנה חדשה פטרי המכילה 30 מיליליטר של מדיום נביטה. מקום על פני השטח של שני מסמכים זה לצד זה מלבני הבינוני סטרילי Whatman 3MM (1.5 סנטימטר x 1.0 סנטימטר; איור 1, שלב 1). טמן 3MM נייר מעוקר ב החיטוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את הזרעים על ניירות Whatman 3MM באמצעות מלקחיים סטריליים (איור 1, שלב 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחזיק זרע בודד נגד עיתון Whatman 3MM ידי הלחיצה בעדינות את הזרע באמצעות טיפים בוטים לצד זה של המלקחיים הקטומים ( <strong&gt; איור 1, שלב 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את קליפת הזרע (Testa והאנדוספרם) של הזרע באמצעות מחט מזרק (מזרק מיליליטר למשל U100 אינסולין מזרק + 1, 0.33 מ&quot;מ (29 G) x 12.7 מ&quot;מ) (איור 1 ב, שלב 4). הצורה של זרעי ארבידופסיס היא ellipsoidal ומומלצת לחתוך את מעיל הזרע לאורך הציר למחצה העיקרי הארוך ביותר הקרוב ככל האפשר למקום שבו הפסיגים מצטרפים לradicle (כלומר הרחק בקצה הקיצוני). זה עוזר לשחרורו הבטוח של העובר בשלב הבא של הליך הנתיחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדחוף את הזרע נגד עיתון Whatman 3MM באמצעות טיפים בוטים לצד זה של המלקחיים הקטומים (איור 1, שלב 5). צעד זה משחרר את העובר מתוך מעיל הזרע דרך הפתח שנוצר בשלב 3.4 (איור 1 ב, שלב 6). מומלץ ליישם את הדחיפה בזרע שבו קצה הפסיגים נמצא בקרוב ביותר לקצה radicle (כלומר משם frאום הפתיחה). </li></ol> 4. הרכבה של מעיל זרע מצעים Assay (SCBA) ראה דיון לבחירה הנכונה של מספר שכבות זרע והעוברים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן צלחת מנה חדשה פטרי המכילה 30 מיליליטר של מדיום נביטה. מקום על פני השטח של מדיום חתיכת סטרילי מלבנית (3.5 סנטימטר x 5.0 סנטימטר) של רשת ניילון (איור 2, שלב 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי למנוע נזק, ניתן להעביר עוברים ומעילי זרע אל פני השטח של הקצוות המתכתיים של המלקחיים על ידי בעדינות דוחף אותם באמצעות מחט המזרק (איור 2, שלב 2). העברת עוברים ומעילי זרע על רשת ניילון (איור 2, שלב 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרכיב שכבה מעגלית ובודדה של מעילי זרע באמצעות המלקחיים הקהות ואת המחט ולוודא כי מעילי זרעים נמצאים בקרבה כהרבה יותר קרובה ככל האפשר (איור 2, שלב 4). נסה לחשוף עד כמה שניתן את פתיחת מעיל הזרע שנוצרה על ידימחט כלפי מעלה. צעד זה לא נבדק באופן שיטתי. עם זאת, זה יכול להגביר את היעילות של SCBA מאז חומרי diffusible עיכוב הצמיחה של העובר צפויים לנטרל ישירות לכיוון את העובר ולא ממנו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את העוברים כשכבת אחת עגולה במרכז מיטת מעיל הזרע שנאספה בשלב 4.3 (איור 2, שלב 5). להבטיח כי העוברים נמצאים בקרבה כהרבה יותר קרובה ככל האפשר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה SCBAs תחת אור הרציף (40 μmol / m 2 של EC) בשעה 20-21 ° C. במקרה שבו דופק FR משמש לעצור את הנביטה, להרכיב SCBA תחת אור רגיל, להחיל את דופק FR כמתואר 9 ולהשאיר צלחת פטרי בחושך. </li></ol>

<ol><li>Debeaujon, I., Leon-Kloosterziel, K. M., Koornneef, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+the+testa+on+seed+dormancy%2C+germination%2C+and+longevity+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Influence of the testa on seed dormancy, germination, and longevity in Arabidopsis.</a> Plant Physiol. 122, 403-414 (2000).</li>
<li>Baroux, C., Spillane, C., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+origins+of+the+endosperm+in+flowering+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Evolutionary origins of the endosperm in flowering plants.</a> Genome Biol. 3, reviews1026(2002).</li>
<li>Debeaujon, I., Lepiniec, L., Pourcel, L., Routaboul, J. -M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDebeaujon%2C+I+%22Seed+development%2C+dormancy+and+germination%22">Seed development, dormancy and germination</a>. , Blackwell Publishing. 25-43 (2007).</li>
<li>Finch-Savage, W. E., Leubner-Metzger, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seed+dormancy+and+the+control+of+germination%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytol%22%5BJournal%5D)">Seed dormancy and the control of germination.</a> New Phytol. 171, 501-523 (2006).</li>
<li>Bethke, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Arabidopsis+aleurone+layer+responds+to+nitric+oxide%2C+gibberellin%2C+and+abscisic+acid+and+is+sufficient+and+necessary+for+seed+dormancy%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">The Arabidopsis aleurone layer responds to nitric oxide, gibberellin, and abscisic acid and is sufficient and necessary for seed dormancy.</a> Plant Physiol. 143, 1173-1188 (2007).</li>
<li>Lee, K. P., Piskurewicz, U., Tureckova, V., Strnad, M., Lopez-Molina, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+seed+coat+bedding+assay+shows+that+RGL2-dependent+release+of+abscisic+acid+by+the+endosperm+controls+embryo+growth+in+Arabidopsis+dormant+seeds%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A seed coat bedding assay shows that RGL2-dependent release of abscisic acid by the endosperm controls embryo growth in Arabidopsis dormant seeds.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 19108-19113 (2010).</li>
<li>Reed, J. W., Nagatani, A., Elich, T. D., Fagan, M., Chory, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phytochrome+A+and+Phytochrome+B+Have+Overlapping+but+Distinct+Functions+in+Arabidopsis+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Phytochrome A and Phytochrome B Have Overlapping but Distinct Functions in Arabidopsis Development.</a> Plant Physiol. 104, 1139-1149 (1994).</li>
<li>Shinomura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Action+spectra+for+phytochrome+A-+and+B-specific+photoinduction+of+seed+germination+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Action spectra for phytochrome A- and B-specific photoinduction of seed germination in Arabidopsis thaliana.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 8129-8133 (1996).</li>
<li>Lee, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatially+and+genetically+distinct+control+of+seed+germination+by+phytochromes+A+and+B%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Spatially and genetically distinct control of seed germination by phytochromes A and B.</a> Genes Dev. 26, 1984-1996 (2012).</li>
<li>Lee, K. P., Lopez-Molina, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+seed+germination+in+the+shade%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Control of seed germination in the shade.</a> Cell Cycle. 11, 4489-4490 (2012).</li>
<li>Piskurewicz, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+gibberellic+acid+signaling+repressor+RGL2+inhibits+Arabidopsis+seed+germination+by+stimulating+abscisic+acid+synthesis+and+ABI5+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">The gibberellic acid signaling repressor RGL2 inhibits Arabidopsis seed germination by stimulating abscisic acid synthesis and ABI5 activity.</a> Plant Cell. 20, 2729-2745 (2008).</li>
<li>Piskurewicz, U., Tureckova, V., Lacombe, E., Lopez-Molina, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Far-red+light+inhibits+germination+through+DELLA-dependent+stimulation+of+ABA+synthesis+and+ABI3+activity%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Far-red light inhibits germination through DELLA-dependent stimulation of ABA synthesis and ABI3 activity.</a> EMBO J. 28, 2259-2271 (2009).</li>
<li>Debeaujon, I., Koornneef, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gibberellin+requirement+for+Arabidopsis+seed+germination+is+determined+both+by+testa+characteristics+and+embryonic+abscisic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Gibberellin requirement for Arabidopsis seed germination is determined both by testa characteristics and embryonic abscisic acid.</a> Plant Physiol. 122, 415-424 (2000).</li>
<li>Sun, T. P., Kamiya, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Arabidopsis+GA1+locus+encodes+the+cyclase+ent-kaurene+synthetase+A+of+gibberellin+biosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">The Arabidopsis GA1 locus encodes the cyclase ent-kaurene synthetase A of gibberellin biosynthesis.</a> Plant Cell. 6, 1509-1518 (1994).</li>
<li>Alonso, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+insertional+mutagenesis+of+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-wide insertional mutagenesis of Arabidopsis thaliana.</a> Science. 301, 653-657 (2003).</li>
<li>Rook, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+sucrose-induction+mutants+reveal+the+modulation+of+sugar-induced+starch+biosynthetic+gene+expression+by+abscisic+acid+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Impaired sucrose-induction mutants reveal the modulation of sugar-induced starch biosynthetic gene expression by abscisic acid signalling.</a> Plant J. 26, 421-433 (2001).</li>
</ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

הליך assay מצעי מעיל הזרע (SCBA) שתואר כאן הוא בעיקרון חל על כל נסיבות שבי נביטת זרעי ארבידופסיס חסומה (או עיכוב) ושבו האנדוספרם חשד לביצוע המעצר הזה. יכול להיות שמעיד האחרון על ידי הסרת קליפת הזרע (Testa והאנדוספרם) והתבוננות שתמורת צמיחה עוברית מהר יותר ביחס לזה שנצפתה כאשר עוברים מוקפים בקליפת הזרע. נביטה עשויה להיחסם בתגובה לפרמטרים פיזיים סביבתיים מסוימים (לדוגמא: פוטנציאל מים או איכות אור) או ברקע גנטי ספציפי (למשל היעדר סינתזת GA כמו במוטציות ...

בזרעים בוגרים ארבידופסיס, מעיל הזרע מורכב מטסטה, שכבה חיצונית של רקמה מתה ממוצא אימהי, והאנדוספרם, שכבת תא בודדת של רקמה חי ישירות המקיפה את העובר 1. האנדוספרם והעובר נגזרים מאירועים נפרדים הפריה: האנדוספרם הוא רקמת triploid עם שתי אימהיים ואבהי גנום אחד ואילו העובר הוא רקמה דיפלואידי עם אימהי אחד והגנום אבהי אחד 2. הפונקציה העיקרית שהוקצתה באופן מסורתי להאנדוספרם היא זה של רקמה תזונתית. עם זאת, זה הופך ברור יותר ויותר שהאנדוספרם גם ממלא תפקיד מרכזי לשלוט נביטת זרעים. רעיון זה הפך ראשון נראית לעין במקרה של תרדמת, תכונה הוצגה על ידי זרעי הפיק חדש. זרעים רדומים מצליחים לנבוט למרות נוכחותם של תנאי נביטה חיוביים. זרעים מאבדים תרדמתם אחרי תקופת הבשלה והפכו nondormant, כלומר הם ינבטו כאשר הם נחשפים לתנאי נביטה חיוביים. במיני צמחים רבים, כוללים צמח מודל ארבידופסיס, מעיל הזרע דרוש לחלוטין כדי למנוע הנביטה של זרעים רדומים מאז הסרת מעיל זרע מעוררת צמיחה עוברית והורקת 3,4. בארבידופסיס, Bethke et al. ציין כי הנביטה נשארה מודחקת לאחר הסרת טסטה, תוך שמירה על האנדוספרם שמקיף את האנדוספרם 5. תצפיות אלו מצביעות על כך שמאוד האנדוספרם הוא הרקמה בתוך מעיל זרע הפעלת פעילות דיכוי בעובר. עם זאת, ניסויי הסרת מעיל זרע לא בהכרח יעזרו להבהיר את אופי פעילות דיכוי הנביטה הניתן על ידי מעיל הזרע ולא בזיהוי גנים הליישם אותה. לאחרונה הצגנו assay מצעי מעיל זרע (SCBA) שבו מעילי זרע ועוברים מופרדים פיזי אך המשיכו בקרבת proxiMity כך שפעילות דיכוי הנביטה הניתנת על ידי האנדוספרם נשמר 6. SCBA מאפשר השימוש קומבינטורית של מעיל זרע רדום, nondormant, ומהונדס גנטי וחומרים עובריים. כתוצאה מכך, יכולים להיות גזורים המסלולים הגנטיים השליטה נביטה ובמיוחד פועלים בהאנדוספרם והעובר. SCBA שימש בהקשר של תרדמת כדי להראות שהאנדוספרם משחרר חומצת phytohormone abscisic (ABA) לעובר להדחיק הצמיחה שלה 6. יתר על כן אנו יכולים להשתמש SCBA לזהות את מסלולי איתות הפועלים בהאנדוספרם ורקמות עובריים כדי לקדם תרדמת. התפקיד של האנדוספרם לשלוט נביטה התחזק עוד יותר על ידי בהתחשב המקרה של זרעי nondormant נחשפו לדופק של אור אדום רחוק (FR). מוקדם על שקי זרע דופק FR אור ידוע לעכב נביטה 7,8. כאשר מעילי זרע הוצאו מזרעי דופק של FR אורלא היה מסוגלת לעכב נביטה, חזק המצביע על כך האנדוספרם יכול גם לדכא את הנביטה של זרעי nondormant 9. למרבה הפלא, SCBA יכול לשמש גם כדי לסכם עיכוב FR תלוי של נביטה. זה אפשר להראות כי כי עיכוב FR תלוי של נביטת זרעים הוא גם תהליך כרוך שחרור ABA מהאנדוספרם 9. יתר על כן, SCBA אפשר זיהוי מסלולי אור איתות השונים הפועלים בהאנדוספרם והעובר לשלוט נביטת זרעי nondormant בתגובה לאותות אור 9,10. SCBA נראה אפוא להיות טכניקה אמינה לחקור את הפונקציה של האנדוספרם בהקשר של השליטה על נביטת זרעים. זהו גם כלי רב עוצמה על מנת להעריך במבחנה אם הגנים חשודים לשלוט נביטה לפעול בהאנדוספרם, העובר או שניהם הרקמות. כאן אנו פירוט הנדרש כדי להרכיב SCBA את השלבים השונים.

<table><tbody><tr><td>Thermomixer Comfort</td><td>Eppendorf AG</td><td>5355 000.011</td><td>Eppendorf AG, המבורג, גרמניה</td></tr><tr><td>Vacusafe Comfort</td><td>INTEGRA Biosciences AG</td><td>158 310</td><td>Integra Biosciences AG, Zizers, שוויץ</td></tr><tr><td>צלחת פטרי (100 מ"מ x 20 מ"מ)</td><td>Greiner Bio-One GmbH</td><td>664 102</td><td>Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, גרמניה</td></tr><tr><td>Murashige and Skoog</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5524</td><td>סיגמא-אולדריץ', סנט לואיס, מיזורי, ארה"ב</td></tr><tr><td>MES</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>M3671</td><td>סיגמא-אולדריץ', סנט לואיס, מיזורי, ארה"ב</td></tr><tr><td>אגר (אגר צמחים)</td> <td>Duchefa Biochemie B.V.</td><td>P1001</td><td>Duchefa Biochemie, הארלם, הולנד</td></tr><tr><td>מלקחיים Dumont #5</td><td>Fine Science Tools GmbH</td><td>11251-10</td><td>Fine Science Tools GmbH, היידלברג גרמניה</td></tr><tr><td>מחט מזרק</td><td>BD Micro-Fine</td><td>324827</td><td>BD, פרנקלין לייקס, ניו ג'רזי ארה"ב</td></tr><tr><td>רשת ניילון (SEFAR NYTEX)</td> <td>SEFAR AG</td><td>03-50/31</td><td>Sefar AG, היידן, שוויץ</td></tr><tr><td>תא גידול</td><td>CLF צמח אקלים</td><td>Percival I-30BLLX</td><td>CLF plant Climatics, Wertingen, גרמניה</td></tr><tr><td>Paclobutrazol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>46046</td><td>Sigma-Aldrich, סנט לואיס, מיזורי, ארה"ב</td></tr></tbody></table>

מעיל זרע מצעים assay לחקור גנטי<em&gt; במבחנה</em&gt; כיצד נביטת זרעי בקרת האנדוספרם ב<em&gt; thaliana ארבידופסיס</em

A Seed Coat Bedding Assay to Genetically Explore In Vitro How the Endosperm Controls Seed Germination in Arabidopsis thaliana

האנדוספרם ארבידופסיס מורכב משכבה תא בודדת המקיפה את העובר הבוגר ומשחקת תפקיד חיוני כדי למנוע הנביטה של זרעים רדומים או שזרעי nondormant מוקרנים על ידי אדום רחוק (FR) דופק את אור. על מנת לקבל תובנות לגבי המנגנונים גנטיים המולקולריים שבבסיס פעילות דיכוי הנביטה המופעל על ידי האנדוספרם נוסף, assay &quot;מצעי מעיל זרע&quot; (SCBA) תוכנן. SCBA הוא הליך נתיחת מפרידה פיזית בין מעילי זרע ועוברים מן הזרעים, המאפשר ניטור הצמיחה של עוברים בשכבה בסיסית של מעילי זרע. למרבה הפלא, SCBA reconstitutes פעילות דיכוי הנביטה של ​​מעיל הזרע בהקשר של תרדמת זרעים ובקרת FR תלויה של נביטת זרעים. מאז SCBA מאפשר השימוש קומבינטורית של מעיל רדום, nondormant וזרעים מהונדסים גנטי וחומרים עובריים, המסלולים הגנטיים שליטה נביטה ובמיוחד אופעל דוושה בהאנדוספרם והעובר יכולה להיות גזור. כאן אנו מפרט את ההליך כדי להרכיב SCBA.

העבודות קודמות הראו כי זרעים שעברו מוטציה מסוגל לסנתז GA לא היו מסוגלים לנבוט כתוצאה מהצטברות הגבוהה ABA בזרעי 11,12. עם זאת, חוסר היכולת לנבוט דורשת מעיל הזרע מאז הסרתו מעוררת 13 צמיחה עוברית. זה מאוד הצביע על כך שהאנדוספרם של זרעים מסוגלים לסנתז GA מפרסם ABA לחסום צמיחה עוברית. לכן אנו מצפים מעילי זרעים מסוגלים לסנתז GA כדי לחסום את הצמיחה של עוברים בSCBA ניגוד מעילי זרע מסוגלים לסנתז GA וABA. כאן אנו משתמשים ga1-21 (קו הוספת סאלק Salk_109115) זרעי...

אנו מציגים את ההליך כדי להרכיב assay זרע מצעי מעיל (SCBA) מזרעי thaliana ארבידופסיס. SCBA הוצג להיות כלי רב עוצמה כדי לחקור מבחינה גנטית ובמבחנה כיצד נביטת זרעי פקדי האנדוספרם בזרעים רדומים ובתגובה לאותות אור. SCBA הוא בעיקרון ישים בכל מצב שבו האנדוספרם חשוד להשפיע על צמיחה עוברית.

מעיל זרע מצעים Assay לחקור גנטי<em&gt; במבחנה</em&gt; כיצד נביטת זרעי בקרת האנדוספרם ב<em&gt; Thaliana ארבידופסיס</em

The Arabidopsis endosperm consists of a single cell layer surrounding the mature embryo and playing an essential role to prevent the germination of ...

המטרה הכללית של הליך זה היא להקים מערך בדיקה של מצע קליפת זרע כדי לבחון כיצד האנדוספרם שולט בניבּוּת הזרעים ב-rabbit opsis בתגובה לתנאים סביבתיים שונים, הן ברמה הגנטית והן ברמה ה-in vitro. הדבר מושג תחילה על ידי שימוש במחט של מזרק ובפינצטה קטועה כדי להוציא בזהירות את קליפת הזרע והעובר מזרעי Arab Opsis. בשלב השני, קליפות הזרעים שהופרדו מועברות בעדינות אל תוך מצע ניבּוּת.בשלב הבא, מעלירי הגרעין מקובצים לשכבה מעגלית אחת. בשלב הסופי, העוברי מסודרים במרכז מצע מעלירי הגרעין שרוקח, גם הם כשכבה מעגלית אחת.האנדוספרמה ממלאת תפקיד חיוני בבקרה על הנבטת זרעים בזרעי Arabidopsis. בדיקת כיפוף מעטפת הזרע היא הליך של מערכת גנטית in vitro לזיהוי הרכיבים הגנטיים המולקולריים של מסלולי השליח הפועלים באנדוספרמה לשם בקרה על הנבטת הזרעים. באופן כללי, מי שאינם מנוסים בשיטה זו נתקלים בקשיים, שכן קשה להוציא אתו את העובר במהירות ובלי לגרום לו לנזק.חשוב להתחשב גם בגיל של חומר הדגימה, מכיוון שעם הזמן הם עלולים לאבד את היכולת לשלוט על קביעת תאיהם. התחילו במזיגת 50 עד 60 µL של זרעי Arab opsis בוגים ויבשים לתוך מבחנה למיקרו-צנטריפוגה בנפח 1.5 mL. לאחר מכן, הוסיפו למבחנה 1 mL של 70% ethanol וערבבו את הזרעים בטמפרטורת החדר באמצעות וורטקס המכוון ל-1200 RPM. לאחר 10 דקות, צנטריפגו את המבחנה למשך שלוש שניות ב-4,000 Gs כ

a-seed-coat-bedding-assay-to-genetically-explore-vitro-how-endosperm

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

אנו מתארים פרוטוקול באמצעות שקופיות קאמריות ותקשורת כדי לשתק פסיגי צמחים עבור הדמית confocal של האפידרמיס על פני כמה ימים של פיתוח, המתעד את בידול הפיוניות. חלבוני fluorophore מתויג-ניתן לעקוב באופן דינמי על ידי ביטוי ולוקליזציה subcellular, להגביר את ההבנה של התפקידים האפשריים שלהם במהלך חלוקת תאים והתמיינות תאים מסוג.

לטווח ארוך הדמיה, ברזולוציה גבוהה Confocal זמן פקיעה של<em&gt; טבורית ארבידופסיס</em&gt; אפידרמיס במהלך הנביטה

סרטון זה מדגים את בדיקת עיכוב צמיחת השתיל בצמח Arabidopsis thaliana . ההשפעה של ריכוז מוגבר של פפטיד חיסוני מעורר על צמיחת שתילים נקבעת.

מדידת עיכוב של צמיחת שתילים על ידי מערכת החיסון

אנו מדווחים שיטה יעילה ופשוטה לבודד את העוברים בשלבים מוקדמים של פיתוח...

בידוד יעיל ומהיר של עוברים משלבים מוקדמים<em&gt; Thaliana ארבידופסיס</em&gt; זרעים

מאמר זה מתאר את השיטות לסינון גני השליטה חדירה plasmodesmal ומכאן שיפוע אוקסין במהלך התגובה טרופית. זה כולל מדידת מידת התגובה הטרופית ב hypocotyl   של ארבידופסיס thaliana ובדיקת חדירות plasmodesmal ידי טעינת חומצה 8-hydroxypyrene-1,3,6-trisulfonic (HPTS) ולבסוף הערכת רמת callose.

אסטרטגיה כדי לאמת את התפקיד של Gating Plasmodesmal בתיווך Callose במענה חוג

כאן אנו מציגים פרוטוקול להערכת שאירים זרע, נביטה תרדמת בתנאי שדה באמצעות קבור, רצועות זרע שכותרתו כלוריד tetrazolium בדיקות כדאיות (ט"ז).

דרך אמין להערכת זרע נביטה, תרדמת, ותמותה בתנאי שדה

פרוטוקול זה מתאר שיטת התבוננות מופרה ב תודרנית באמצעות סיווג ביצית ואחריו את הבדיקה של היווצרות תבנית העובר תחת מיקרוסקופ.

שיטת אפיון מופרה ב תודרנית

מטרת המחקר הייתה לקבוע את ההשפעות של אקונומיקה, כלור גז עיקור על נביטת הזרעים של אחרים טווח של תודרנית גדל על מדיה סטרילי. עיקור ממוטבת פרוטוקולים פותחו כדי למנוע את התפתחותם של חיידקים מזהמים תוך מתן זרע משביע רצון הישרדות.

שיטה סטנדרטית עבור תפוקה גבוהה עיקור של תודרנית זרעים

מכונת העמסה עדינה של כוח מגע בנויה ממברשות שיער אנושיות, זרועות רובוטיות ובקר. מברשות השיער מונעים על ידי זרועות רובוטיות המותקנות במחשב ולנוע מעת לעת כדי להחיל כוח מגע על צמחים. החוזק של נגיעות שיער מונחה מכונה דומה לזה של נגיעות שהוחלו ידנית.

שמירת עבודה והמשך המגע הכוח איתות פרוטוקול המסך מוטציה למחקר של Thigmomorphogenesis של צמח המודל Arabidopsis thaliana

מאמר זה מתאר שתי שיטות פנוטיפ ללא שימוש בקליפות אפידרמיס כדי לאפיין את הגנים השולטים בהתפתחות הסטומטלית. השיטה הראשונה מדגימה כיצד לנתח פנוטיפ סטומטלי באמצעות אפידרמיס צמחי מוכתם O כחול טולוידין. השיטה השנייה מתארת כיצד לזהות ליגנדות סטומטיות ולנטר את פעילותן הביולוגית.

זיהוי הגנים המעורבים בהתפתחות סטומאטלית באמצעות ניקוד פנוטיפ אפידרמלי

במאמר זה אנו מתארים כלי מתקדם המיועד לניטור ביוסינתזה של כלורופיל בשלבים המוקדמים של דה-אטיולציה של שתילי ארבידופסיס . המתודולוגיה החדשנית מספקת דימות פלואורסצנטי כלורופיל לא פולשני בזמן אמת ברזולוציה מרחבית וטמפורלית גבוהה.

בדיקה לא פולשנית לביוסינתזה של כלורופיל קביעת קינטיקה בשלבים מוקדמים של דה-אטיולציה של ארבידופסיס

פרוטוקול זה מתאר הכנת דגימות שלמות של שכבת תאי האנדוספרם בזרעי Arabidopsis thaliana . השיטה דורשת רק ציוד מעבדה נפוץ, כגון מחט הזרקה ומלקחיים מדויקים, ומאפשרת הדמיה של תאים חיים פלואורסצנטיים ברזולוציה גבוהה של תאי אנדוספרם בזרעים מתפתחים ובוגרים כאחד.

הכנת רקמה שלמה לאנליזה מיקרוסקופית של שכבת תאי האנדוספרם בזרעי ארבידופסיס מתפתחים ובוגרים

חקור את השפעת האנדוספרם על נביטת זרעים ב-Arabidopsis thaliana באמצעות מעיל זרע מצעים Assay. שיטה זו מאפשרת ניתוח גנטי מבוקר של תהליכי נביטה בתנאי מעבדה.

מעיל זרע מצעים Assay לחקור גנטי

גלה סרטונים נוספים