מעיל זרע מצעים Assay לחקור גנטי

המטרה הכללית של הליך זה היא להקים מערך בדיקה של מצע קליפת זרע כדי לבחון כיצד האנדוספרם שולט בניבּוּת הזרעים ב-rabbit opsis בתגובה לתנאים סביבתיים שונים, הן ברמה הגנטית והן ברמה ה-in vitro. הדבר מושג תחילה על ידי שימוש במחט של מזרק ובפינצטה קטועה כדי להוציא בזהירות את קליפת הזרע והעובר מזרעי Arab Opsis. בשלב השני, קליפות הזרעים שהופרדו מועברות בעדינות אל תוך מצע ניבּוּת.

בשלב הבא, מעלירי הגרעין מקובצים לשכבה מעגלית אחת. בשלב הסופי, העוברי מסודרים במרכז מצע מעלירי הגרעין שרוקח, גם הם כשכבה מעגלית אחת.

האנדוספרמה ממלאת תפקיד חיוני בבקרה על הנבטת זרעים בזרעי Arabidopsis. בדיקת כיפוף מעטפת הזרע היא הליך של מערכת גנטית in vitro לזיהוי הרכיבים הגנטיים המולקולריים של מסלולי השליח הפועלים באנדוספרמה לשם בקרה על הנבטת הזרעים. באופן כללי, מי שאינם מנוסים בשיטה זו נתקלים בקשיים, שכן קשה להוציא אתו את העובר במהירות ובלי לגרום לו לנזק.

חשוב להתחשב גם בגיל של חומר הדגימה, מכיוון שעם הזמן הם עלולים לאבד את היכולת לשלוט על קביעת תאיהם. התחילו במזיגת 50 עד 60 µL של זרעי Arab opsis בוגים ויבשים לתוך מבחנה למיקרו-צנטריפוגה בנפח 1.5 mL. לאחר מכן, הוסיפו למבחנה 1 mL של 70% ethanol וערבבו את הזרעים בטמפרטורת החדר באמצעות וורטקס המכוון ל-1200 RPM. לאחר 10 דקות, צנטריפגו את המבחנה למשך שלוש שניות ב-4,000 Gs כדי לרכז את הזרעים בתחתית המבחנה.

לאחר מכן, השתמשו בקצה של שאיבה בוואקום כדי לשאוב בזהירות את האתנול, והשאירו את הגרעינים בתחתית הפרונטה. כעת הוסיפו מילליטר אחד של מים מזוקקים סטריליים לגרעינים, ולאחר מכן נערו את הגרעינים למשך 10 דקות נוספות. לאחר סבב צנטריפוגה נוסף להסמכת הגרעינים, שאובו את הנוזל והוסיפו למבחנה מילליטר נוסף של מים מזוקקים סטריליים, תוך הבטחה שזרימת המים תיתלה את הגרעינים בצורה הומוגנית לאורך כל המבחנה.

לאחר מכן, הניחו את המבחנה במעמד כדי לאפשר לזרעים לשקוע לתחתית המבחנה. לאחר כ-30 שניות, שאבו בזהירות את המים לצורך זריעת הזרעים. ראשית, שפכו 30 milliliters של מצע הנבטה בטמפרטורה של 50 degrees Celsius שהוכר מוטב, לתוך צלחת פטרי של 100 millimeter. השעיקו מחדש את הזרעים ב-200 microliters של מים מזוקקים סטריליים, ולאחר מכן השתמשו בקצה של מיקרו-פיפט של one milliliter כדי להעביר אותם אל פני השטח של מצע ההנבטה.

שאבו את המים המקיפים את הזרעים, ולאחר מכן השאירו את צלחת הפטרי והזרעים ללא כיסוי במכבה הזרימה הלמינרית לייבוש נוסף. לאחר שעתיים, סגרו את צלחת הפטרי והשאירו את הזרעים בתוך המכבה למשך 90 דקות נוספות. כעת, הניחו מיקרוסקופ סטריאו בתוך המכבה.

שפכו 30 milliliters של מצע הנבטה לתוך צלחת פטרי נוספת בקוטר 100 millimeter, ולאחר מכן הניחו שני דפי watman במידה של 3 millimeter מרובעים ועקרים באוטוקלאב זה לצד זה על פני השטח של המצע. השלב הקשה ביותר בהליך זה הוא הדיסקציה, מכיוון שהזרע דק מאוד, ולכן יש לנקוט זהירות רבה כדי להימנע מפגיעה בעוברים בעת חיתוך הזרע התפוס באמצעות פינצטה סטרילית בעלת קצה קהה מסוג dumont, מספר 5.

העבירו את הגרעינים אל הדפים, ולאחר מכן סגרו את הפינצטה. לחצו בעדינות גרעין בודד אל תוך הנייר. כעת, השתמשו בקצה מחט של מזרק אינסולין בכילוי 29 כדי לחתוך את מעטפת הגרעין לאורך הציר החציוני הראשי הארוך ביותר, קרוב ככל האפשר למקום שבו ה-co lead-ins מחוברים ל-radical.

לאחר מכן, השתמשו בפינצטה כדי להצמיד את הזרע אל הנייר. שוב, הפילו לחץ בקצה ה-Cains הקרוב ביותר לקצה השורשון (radical) כדי לשחרר את העובר ממעטפת הזרע לצורך הרכבת מערך בדיקה למצע מעטפת זרע. ראשית, הניחו פיסת רשת ניילון סטרילית בגודל 3.5 על 5 סנטימטרים בתוך צלחת 100 מילימטר נוספת שסביבה נשפך טרי של מצע הנבטה.

לאחר מכן, השתמש במזרק כדי לדחוף בעדינות את העוברים ואת מעטפות הזרעים אל הקצוות המתכתיים של הפינצטה והעבר את רקמי הצמחים אל רשת הניילון. השתמש בפינצטה ובמזרק כדי להרכיב שכבה מעגלית אחת של מעטפות הזרעים, תוך הקפדה שהמעטפות יהיו קרובות זו לזו ככל האפשר, ושהפתחים במעטפות הזרעים פונים כלפי מעלה. לאחר מכן, הנח את העוברים בשכבה מעגלית אחת במרכז מצע מעטפות הזרעים, תוך הבטחה שגם העוברים יהיו קרובים זה לזה ככל האפשר.

לבסוף, דגרו את בדיקות מצע הזרעים תחת תאורה רציפה בטמפרטורה של 20 עד 21 מעלות צלזיוס, בהתאם לתוצאות קודמות. זרעים של מוטנט rabbit opsys שאינם מסוגלים לסנתז gier illin או מוטנטים deficient GA אינם יכולים להנביט 80 שעות לאחר עיכוב הנבטה. בניגוד לכך, ובהתאם לתוצאות קודמות, הסרת קליפת הזרע מעוררת את צמיחתו שלו שלו שלו של עובר המוטנט deficient GA, אלא אם כן קיים בתווך OB CIC acid או BA, מה שמרמז כי האנדוספרם של מוטנטים deficient GA משחרר BA לעבר העובר כדי לחסום את הנבטתו.

בתמונה זו, 80 שעות לאחר עיכוב הנבטה, מוצג ניסוי של מצע קליפות זרעים עם עוברים מוטנטיים חסרי GA על מצע של 80 קליפות זרעים של מוטנטים חסרי GA. בהתאם להשערתנו, קליפות זרעים של מוטנטים חסרי GA חוסמות את צמיחתם של עוברים מוטנטיים חסרי GA. כאן מוצג ניסוי של מצע קליפות זרעים עם עוברים מוטנטיים חסרי GA שגודלו על מצע של קליפות זרעים של מוטנטים חסרי GA שחסרה להם גם היכולת לסנתז A BA 80 שעות לאחר עיכוב הנבטה; כצפוי, קליפות הזרעים המוטנטיות אינן מסוגלות לחסום את צמיחתם של עוברים מוטנטיים חסרי GA.

באופן דומה, עוברים מוטנטיים חסרי GA שגודלו על מצע של קליפות זרעים של מוטנטים חסרי GA שחסר בהם הגורם RGL two, לא הצליחו גם הם לחסום את הצמיחה של עוברים מוטנטיים חסרי GA לאחר ביצוע הליך זה. ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון ניתוח ביטוי גנים מקליפת הזרע ומהעובר שחולץ מהזרע, כדי לחקור את האינטראקציה הגנטית באמצעות טבילת קליפת הזרע. לכן, ברגע שהטכניקה תשלט, היא תאפשר לחוקרים בתחום נבט הזרעים לבחון כיצד קליפת הזרע שולטת בצמיחת העובר בתגובה לרמזים סביבתיים.