זיהוי של חיידקים פעילים מטבולית במעיים של Generalist Spodoptera littoralis באמצעות איזוטופ יציב DNA גשוש שימוש ¹³ C-גלוקוז

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לפרט מתודולוגיה יעילה המשמשת לאפיון גנטי של החיידקים הפעילים מטבולית במעיים של חרק. זה מושג על ידי הזנת גלוקוז C 13 תחילה לחרק כדי להעשיר איזוטופי את ה-DNA של החיידקים הפעילים מטבולית במעיים שלהם. השלב הבא הוא לחלץ את הדנ"א של קהילת החיידקים הקיימת במעיים.

השלב השלישי הוא להפריד את ה-DNA של המינים הפעילים מטבולית, ששילבו את ה-C 13. לאחר מכן ה-DNA מזוהה ומכומת באופן פילוגנטי עבור המינים הקיימים על ידי ריצוף פירו. ובכך לזהות את מיני החיידקים הפעילים מטבולית המרכיבים את הקהילה הקיימת במעיים של החרקים.

אז המעיים של אורגניזם רב-תאי הם המצאה גאונית לניצול היכולות המטבוליות של מיקרואורגניזמים להמיס או להמיס חומר אורגני מורכב כך שיוכל סוף סוף לשמש כחומרים מזינים למארח החרקים. כדי להבין את המערכת, עלינו לנתח קודם כל מי נמצא שם בחוץ, ושנית למי יש איזו מהפעילויות המטבוליות. אם יש לנו את הנתונים האלה, נוכל לשחזר את שטף המטבוליטים ותוצרי הפירוק בין המיקרואורגניזמים המשפילים לבין מארח החרקים.

השיטה הזו יכולה לסייע לנו לענות על שאלות מפתח בתחום האקולוגיה המיקרוביאלית, במיוחד באופן שבו המיקרובים האלה מתקשרים עם המארח שלהם. במובן זה, אנו יכולים לדעת יותר ולהבהיר ולהגדיר מהן הפונקציות שהאורגניזמים האלה משרתים עבור המארח שלהם. אם כי שיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי חיידקי המעי הפעילים הכלליים.

על ידי מעקב אחר הגלוקוז של ucle, ניתן לבצע אותו גם למקור פחמן אחר, כגון תיוג הצלוז כדי לזהות חיידקים פעילים המעורבים בתהליך העיכול של חומר המזון האוקרנט. שמרו על ליטר, ביצים וצלחות פטרי הוסיפו טמפרטורת החדר עד שהם בוקעים. לאחר מכן העבירו את הזחלים שזה עתה בקעו לקופסת פלסטיק נקייה וגידלו אותם בתזונה מלאכותית בטמפרטורה של 23 עד 25 מעלות צלזיוס תחת משטר יום ארוך עם 16 שעות תאורה ושמונה שעות חושך לאחר מספר ימים העבירו תשעה עד 15 זחלי כוכב שני בריאים מקופסת הגידול לצלחות פטרי בודדות המכילות גלוקוז C 13 טרי.

תזונה מלאכותית קוצנית, לפחות שלושה שכפולים של שלושה זחלים כל אחד נדרשים לכל טיפול. השתמש בתזונה מלאכותית המספקת את אותה כמות של גלוקוז טבעי כמו מקור מזון טבעי כמו כותנה להאכלת קבוצת הביקורת. במהלך 24 השעות הבאות.

לחדש לעתים קרובות את הדיאטות המלאכותיות. התחל בהעברת הזחלים עם מלקחיים רכים לבריכת מים מזוקקים כדי להסיר פסולת גדולה. לאחר מכן מעבירים לכלי נקי חדש כדי להרדים ולהרוג את החרקים.

הניחו אותם על קרח ואז הורידו את הטמפרטורה למינוס חמש מעלות צלזיוס בצידנית. לאחר מכן יש לחטא את החרקים המתים באתנול 70% ולטבול אותם ב-PBS לצורך הדיסקציה. יש לנקות את הכלים גם עם 70% אתנול.

התחל עם חתכים בציפורן לאורך הצד הימני והשמאלי. התחל על הראש וסיים על פי הטבעת. הסר את כל השלד החיצוני, צינורות המאליאן וגוף השומן.

לאחר מכן החליפו את המאגר לפני פתיחת המעי במעי מבודד מהרקמות האחרות. עבדו את כל המעי או חלקים עבור המעיים, המעי האמצעי או המעי האחורי. תלוי בשאלה המדעית.

העבירו את רקמות המעי ללא PBS לצינור סטרילי קטן ואחסנו אותן במקפיא. לפני מיצוי ה-DNA, יבש את הדגימות ב-45 מעלות צלזיוס במכשיר ריכוז ואקום למשך 30 עד 90 דקות, תלוי בגודל הרקמה. לאחר מכן, מועכים את הרקמה המיובשת באמצעות פלה פלסטיק סטרילי כדי לחלץ את ה-DNA הגנומי באמצעות ערכה למיצוי DNA באדמה.

לאחר מכן קבע את ריכוז ה-DNA הסופי שהתחמק באמצעות ספקטרופוטומטר. ודא מיצוי מוצלח של ה-DNA המטגנומי המיקרוביאלי ממעי החרקים על ידי הכנת בדיקת PCR אבחנתית באמצעות פריימרים כלליים חיידקיים 27 F ו-1, 492 R.לאבחון. הפעל חמישה מיקרוליטר מכל מוצר PCR על ג'ל אגרוס של 1% ב-300 וולט ו-115 מיליאמפר למשך כ-20 דקות.

הגודל הנכון של המגמפליקונים הוא 1.5 קילו-בסיסים. משוך את ה-DNA שחולץ המתאים לכל שכפול ניסיוני יחד. שמירה על הפרדה בין אלה עם ובלי גלוקוז C 13.

נרמל את ריכוזי ה-DNA כדי להבטיח שכל דגימה תורמת באופן שווה למאגר שלה. ריכוז סופי של 500 עד 5,000 ננוגרם של DNA מתאים לתהליך האולטרה-צנטריפוגה. בדוק שוב את הריכוז הצפוי עם הספקטרופוטומטר בצינור מכסה בורג סטרילי של 15 מיליליטר.

הגדר את מדיום השיפוע. שלב את ה-DNA הכמותי עם 4.8 מיליליטר של תמיסת צזיום כלוריד. לאחר מכן מלא את עוצמת הקול בשישה מיליליטר של מאגר שיפוע.

העבירו בזהירות את התערובות לצינורות אולטרה-צנטריפוגה של 5.1 מיליליטר. בעזרת מזרק ומחט מלאו את הצינורות עד לבסיס צווארם והימנעו משאיבה או היווצרות בועות אוויר. כלול לפחות שיפוע ריק אחד ללא DNA בכל ריצה.

כדי לשמש כמדרג ייחוס, בחר זוגות צינורות ואזן אותם לטווח של 10 מיליגרם. מרחו כיסוי צינור על כל צינור וודאו שהם נקיים מדליפה על ידי היפוך הצינור והפעלת לחץ מתון ביד. השתמש ברוטור כמעט אנכי עם שמונה בארות.

אטום בזהירות את בארות הרוטור וטען את הרוטור לתוך האולטרה-צנטריפוגה בהתאם להוראות היצרן. סובב את ה-DNA ב-50,000 סל"ד ב-20 מעלות צלזיוס תחת ואקום למשך 40 שעות. בחר תאוצה מקסימלית ואת ההאטה ללא בלימה.

יומיים לאחר מכן, הסר בזהירות את הצינורות מרוטור הצנטריפוגה בעזרת מלקחיים. הניחו אותם במתלה מבלי להפריע לשיפועים שנוצרו ועבדו את הצינורות מיד. ראשית יש לאזן HPLC באמצעות קצב זרימה של 850 מיקרוליטר לדקה.

לאחר מכן חבר את צינור האולטרה-צנטריפוגה למעמד מהדק ונקב את תחתית הצינור בעזרת מחט בגודל 23 אינץ' המחוברת למזרק. אז חודרים בזהירות את החלק העליון של הצינור עם כורה בקרה כדי למנוע הפרעה לצורה, לשיפוע ולתרגול מראש כדי להבטיח תנועת PSA מוצלחת. לאחר מכן, הכנס את המחט המחוברת לצינור המשאבה לחלק העליון של הצינור שבו אין נוזל ואסוף טיפות מלמטה ישירות לצינורות מיקרו פוגה סטריליים של 1.5 מיליליטר אוספים שבר כל 30 שניות עבור 425 מיקרוליטר לשבריר.

בדוגמה זו, 12 שברים נאספים מכל שיפוע. לאחר מכן, מדוד את הצפיפות של כל שבר מופרד באיזון אנליטי. המשך בשחזור DNA וריצוף פירו על ידי התייעצות עם פרוטוקול הטקסט למשך 24 שעות.

10 מילי-מולרי C 13 גלוקוז הוספו לתזונה של ליטר ssop. זחל. אותה כמות של גלוקוז נורמלי נוספה למזון של חרקי הביקורת. לאחר מכן, ה-DNA הופק מקהילת החיידקים של מעי החרקים.

על ג'ל אלקטרופורזה, פס חזק של DNA גנומי בחלק העליון אישר מיצוי DNA מוצלח, PCR אבחנתי. שימוש בפריימרים אוניברסליים של חיידקים הראה נוכחות של DNA חיידקי ריצוף פירו כמותי בוצע ישירות על שיפועי SIP המייצגים כדי לחשוף את שושלת המינים ואת השפע היחסי שלהם. בסך הכל נוצרו 120,045 קריאות באיכות גבוהה באורך ממוצע של 404 OTs.

פרופיל ריצוף הפיירו הראה שפע מוגבר של מינים מסוימים, כולל אנטרוקוקוס ופנטו בדגימה המסומנת בהשוואה לזה בקבוצת הביקורת. לכן, חיידקים אלה נחשבים לפעילים מבחינה מטבולית וראויים למחקר נוסף. לכן בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לערב בקרה נכונה בניתוח CYP.

אז מה שיפחית את השפעת הרקע, הזיהום בהבזק השיער ויבטיח שמגוון החיידקים והשפע המופיעים או נעלמים אינם תוצר של המסה עצמה. בעקבות הליך זה או מתודולוגיות כמו הכלאה פלואורסצנטית באתרה ניתן להשתמש ולבצע על מנת לענות על שאלות נוספות. במקרה כזה ידאג למיקום וסידור החיידקים בתוך המעיים של החרק.