Name: זיהוי של חיידקים פעילים מטבולית במעיים של Generalist Spodoptera littoralis באמצעות איזוטופ יציב DNA גשוש שימוש 13 C-גלוקוז (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-13T20:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 11 s
Description: חקור זיהוי חיידקים פעילים מטבולית במעיי Spodoptera littoralis באמצעות שיטת SIP עם גלוקוז מסומן ב-13C. השיטה מאפשרת קישור בין זהות מיקרוביאלית לפעילות מטבולית בחיי החרקים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לאנג&#39;ליקה ברג לסיוע מעבדה. עבודה זו נתמכה ומומנה על ידי אגודת מקס פלנק ובית הספר ליינה למיקרוביאלית תקשורת (JSMC).

<ol><li>Pais, R., Lohs, C., Wu, Y. N., Wang, J. W., Aksoy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+obligate+mutualist+Wigglesworthia+glossinidia+influences+reproduction%2C+digestion%2C+and+immunity+processes+of+its+host%2C+the+tsetse+fly%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The obligate mutualist Wigglesworthia glossinidia influences reproduction, digestion, and immunity processes of its host, the tsetse fly.</a> Appl. Environ. Microbiol. 74, 5965-5974 (2008).</li>
<li>Freitak, D., Heckel, D. G., Vogel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dietary-dependent+trans-generational+immune+priming+in+an+insect+herbivore%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Biol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Dietary-dependent trans-generational immune priming in an insect herbivore.</a> Proc. Biol. Sci. 276, 2617-2624 (2009).</li>
<li>Dillon, R. J., Vennard, C. T., Charnley, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Note%3A+Gut+bacteria+produce+components+of+a+locust+cohesion+pheromone%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A Note: Gut bacteria produce components of a locust cohesion pheromone.</a> J. Appl. Microbiol. 92, 759-763 (2002).</li>
<li>Douglas, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nutritional+interactions+in+insect-microbial+symbioses%3A+Aphids+and+their+symbiotic+bacteria+Buchnera%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Entomol%22%5BJournal%5D)">Nutritional interactions in insect-microbial symbioses: Aphids and their symbiotic bacteria Buchnera.</a> Annu. Rev. Entomol. 43, 17-37 (1998).</li>
<li>Reichardt, N., Barclay, A. R., Weaver, L. T., Morrison, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+stable+isotopes+to+measure+the+metabolic+activity+of+the+human+intestinal+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Use of stable isotopes to measure the metabolic activity of the human intestinal microbiota.</a> Appl. Environ. Microbiol. 77, 8009-8014 (2011).</li>
<li>Dumont, M. G., Murrell, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+isotope+probing+-+linking+microbial+identity+to+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Stable isotope probing - linking microbial identity to function.</a> Nat. Rev. Microbiol. 3, 499-504 (2005).</li>
<li>Gil, R., Latorre, A., Moya, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+endosymbionts+of+insects%3A+insights+from+comparative+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Bacterial endosymbionts of insects: insights from comparative genomics.</a> Environ. Microbiol. 6, 1109-1122 (2004).</li>
<li>Brune, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBrune%2C+A+%22Encyclopedia+of+Insects%22">Encyclopedia of Insects</a>. VH, R. esh, Cardé, R. T. , Elsevier. 1132(2005).</li>
<li>Breznak, J. A., Brune, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+microorganisms+in+the+digestion+of+lignocellulose+by+termites%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Entomol%22%5BJournal%5D)">Role of microorganisms in the digestion of lignocellulose by termites.</a> Annu. Rev. Entomol. 39, 453-487 (1994).</li>
<li>Broderick, N. A., Raffa, K. F., Goodman, R. M., Handelsman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Census+of+the+bacterial+community+of+the+gypsy+moth+larval+midgut+by+using+culturing+and+culture-independent+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Census of the bacterial community of the gypsy moth larval midgut by using culturing and culture-independent methods.</a> Appl. Environ. Microbiol. 70, 293-300 (2004).</li>
<li>Funke, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+hydrolysis+of+quorum-sensing+molecules+in+the+gut+of+lepidopteran+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Chembiochem%22%5BJournal%5D)">Rapid hydrolysis of quorum-sensing molecules in the gut of lepidopteran larvae.</a> Chembiochem. 9, 1953-1959 (2008).</li>
<li>Tang, X. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complexity+and+variability+of+gut+commensal+microbiota+in+polyphagous+lepidopteran+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Complexity and variability of gut commensal microbiota in polyphagous lepidopteran larvae.</a> PloS One. 7, (2012).</li>
<li>Amann, R. I., Ludwig, W., Schleifer, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phylogenetic+identification+and+in-situ+detection+of+individual+microbial-cells+without+cultivation%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Phylogenetic identification and in-situ detection of individual microbial-cells without cultivation.</a> Microbiol. Rev. 59, 143-169 (1995).</li>
<li>Olsen, G. J., Lane, D. J., Giovannoni, S. J., Pace, N. R., Stahl, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+ecology+and+evolution+-+a+ribosomal-rna+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Microbial ecology and evolution - a ribosomal-rna approach.</a> Annu. Rev. Microbiol. 40, 337-365 (1986).</li>
<li>Pilloni, G., von Netzer, F., Engel, M., Lueders, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+acceptor-dependent+identification+of+key+anaerobic+toluene+degraders+at+a+tar-oil-contaminated+aquifer+by+Pyro-SIP%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Ecol%22%5BJournal%5D)">Electron acceptor-dependent identification of key anaerobic toluene degraders at a tar-oil-contaminated aquifer by Pyro-SIP.</a> FEMS Microbiol. Ecol. 78, 165-175 (2011).</li>
<li>Lu, Y. H., Conrad, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+stable+isotope+probing+of+methanogenic+archaea+in+the+rice+rhizosphere%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">In situ stable isotope probing of methanogenic archaea in the rice rhizosphere.</a> Science. 309, 1088-1090 (2005).</li>
<li>Radajewski, S., Ineson, P., Parekh, N. R., Murrell, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable-isotope+probing+as+a+tool+in+microbial+ecology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Stable-isotope probing as a tool in microbial ecology.</a> Nature. 403, 646-649 (2000).</li>
<li>Lueders, T., Pommerenke, B., Friedrich, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable-isotope+probing+of+microorganisms+thriving+at+thermodynamic+limits%3A+Syntrophic+propionate+oxidation+in+flooded+soil%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Stable-isotope probing of microorganisms thriving at thermodynamic limits: Syntrophic propionate oxidation in flooded soil.</a> Appl. Environ. Microbiol. 70, 5778-5786 (2004).</li>
<li>Kunapuli, U., Lueders, T., Meckenstock, R. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+stable+isotope+probing+to+identify+key+iron-reducing+microorganisms+involved+in+anaerobic+benzene+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22ISME+J%22%5BJournal%5D)">The use of stable isotope probing to identify key iron-reducing microorganisms involved in anaerobic benzene degradation.</a> ISME J. 1, 643-653 (2007).</li>
<li>Fuhrer, T., Fischer, E., Sauer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+identification+and+quantification+of+glucose+metabolism+in+seven+bacterial+species%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Experimental identification and quantification of glucose metabolism in seven bacterial species.</a> J. Bacteriol. 187, 1581-1590 (2005).</li>
<li>Dunford, E. A., Neufeld, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+Stable-Isotope+Probing+%28DNA-SIP%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">DNA Stable-Isotope Probing (DNA-SIP).</a> J. Vis. Exp. (42), (2010).</li>
<li>Yamasaki, S., Nomura, N., Nakajima, T., Uchiyama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultivation-independent+identification+of+candidate+dehalorespiring+bacteria+in+tetrachloroethylene+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Sci.+Technol%22%5BJournal%5D)">Cultivation-independent identification of candidate dehalorespiring bacteria in tetrachloroethylene degradation.</a> Environ. Sci. Technol. 46, 7709-7716 (2012).</li>
<li>Lueders, T., Manefield, M., Friedrich, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+sensitivity+of+DNA-+and+rRNA-based+stable+isotope+probing+by+fractionation+and+quantitative+analysis+of+isopycnic+centrifugation+gradients%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Enhanced sensitivity of DNA- and rRNA-based stable isotope probing by fractionation and quantitative analysis of isopycnic centrifugation gradients.</a> Environ. Microbiol. 6, 73-78 (2004).</li>
<li>Ishak, H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+diversity+in+Solenopsis+invicta+and+Solenopsis+geminata+ant+colonies+characterized+by+16S+amplicon+454+pyrosequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Microb.+Ecol%22%5BJournal%5D)">Bacterial diversity in Solenopsis invicta and Solenopsis geminata ant colonies characterized by 16S amplicon 454 pyrosequencing.</a> Microb. Ecol. 61, 821-831 (2011).</li>
<li>Sun, Y., Wolcott, R. D., Dowd, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tag-encoded+FLX+amplicon+pyrosequencing+for+the+elucidation+of+microbial+and+functional+gene+diversity+in+any+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Tag-encoded FLX amplicon pyrosequencing for the elucidation of microbial and functional gene diversity in any environment.</a> Methods Mol. Biol. 733, 129-141 (2011).</li>
<li>Kuczynski, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+QIIME+to+Analyze+16S+rRNA+Gene+sequences+from+microbial+communities%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Using QIIME to Analyze 16S rRNA Gene sequences from microbial communities.</a> Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 1, Unit1E 5(2012).</li>
<li>Dillon, R. J., Dillon, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+gut+bacteria+of+insects%3A+nonpathogenic+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Entomol%22%5BJournal%5D)">The gut bacteria of insects: nonpathogenic interactions.</a> Annu. Rev. Entomol. 49, 71-92 (2004).</li>
<li>Neufeld, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+stable-isotope+probing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">DNA stable-isotope probing.</a> Nat. Protoc. 2, 860-866 (2007).</li>
<li>Dumont, M. G., Murrell, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+isotope+probing+-+linking+microbial+identity+to+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Stable isotope probing - linking microbial identity to function.</a> Nat. Rev. Microbiol. 3, 499-504 (2005).</li>
</ol>

יש לנו מה למסור.

הבטן של רוב החרקים נמלי קהילת חיידקים עשירה ומורכבת, בדרך כלל 10 7 -10 9 תאים פרוקריוטים להגיש שם, מספרם עולים בתאים של המארח ברוב המקרים. לכן, תחושת הבטן של החרק היא &quot;נקודה חמה&quot; לפעילות של חיידקים מגוונים, המייצגים היבטים שונים של מערכות יחסים של חיידקים, מפתוגנזה לחייב הדדיות 27. למרות שמחקרים רבים תארו מגוון מדהים של קהילות חיידקי מעי חרק, אפיון של פעילות חילוף חומרים של חיידקים במעיים הוא נדיר. גישות איזוטופ חיטוט יציבים מציעות כעת אפ...

עמותות סימביוטיים חרקים בקטריאלי ידועים מספר רב של מיני חרקים 7. בעמותות סימביוטיים אלה, מיקרואורגניזמים ממלאים תפקידים חשובים בצמיחה וההתפתחות של חרקים. חיידקים הוכחו לתרום לרביית חרקים 1, פרומון ביוסינתזה 3, תזונה, כוללים הסינתזה של חומצות אמינו חיוניות 4, ועיכול של מזון שאינו נגיש למארח. למרות המגוון העצום של עמותות בטן בקטריאלי, הרבה פחות ידוע על התפקיד הפונקציונלי שהם משחקים לטובתו של החרק. רק במקרה של הטרמיטים, העיכול הסימביוטי של lignocellulose בוצע על ידי פרוקריוטים, פרוטוזואה, ופטריות, נחקר באופן נרחב 8,9. בניגוד לכך, מעט מאוד ידוע על הקשר הסימביוטי ההווה במעיים של חרקים generalist כלומר leafworm הכותנה, Spodoptera littoralis. יתר על כן, בשל השינוי התכוף שלהם של מארחים צמח, כלליהחרקים ist וקהילות הבטן הקשורות החיידקים שלהם באופן קבוע חשופים לאתגרים חדשים הקשורים להרגלי האכילה שלהם לצרוך צמחים עם שפע של פיטוכימיקלים. לצד זה, את סביבת המעי בlepidopterans, מייצגת כשלעצמה סביבה קשה לצמיחה של חיידקים בגלל החומציות במעיים הגבוהה 10. במיוחד במקרה של ס &#39; littoralis, זה נע בין 10.5 במעי הקדמי, CA. 9 בmidgut לPH כמעט 7 ב11 המעי האחורי. מצד השני, קהילת החיידקים הקשורים לבטנו של ס &#39; littoralis הוא פשוט. טאנג, Freitak, et al 12. דיווח מרבי של 36 phylotypes השייך לסך של 7 מיני חיידקים שונים כמו רק לחברי קהילת חיידקים הקשורים לחרק הזה. חוץ מזה, אין הליך גידול מסובך דרוש להתפתחות החרקים במעבדה. יתר על כן, זה ומחזור החיים הקצר של החרק להקל רב גרםמחקרי enerational, הופך מין זה למערכת מודל אידיאלית לחקר אינטראקציות בטן חיידק. עם כניסתו של טכנולוגיות רצף המבוססות על ה-PCR, מספר מחקרים העוסקים בהביוטה בטן של כמה אורגניזמים (בני אדם כלומר, חרקים, או יצורים ימיים) גדל. יתר על כן, התוצאות הן עצמאיות מבידוד והטיפוח של חיידקי המעיים טיפחו כמו בעבר. כמעט 99% מחיידקים אינם ראויים לעיבוד חקלאיים והסימולציה של התנאים הסביבתיים ששררו במעיים קשה 12. באמצעות PCR, שברי גן 16S rRNA (סמן בשימוש נרחב פילוגנטי גנים בין חיידקים) יכולים להיות מוגבר באופן סלקטיבי מתבנית ה-DNA מעורבת של קהילות חיידקי מעיים, רצף, ומשובט. בעזרת מידע זה, המשתמש יכול לזהות את מיני חיידקים לאחר אחזור מידע רצף ממאגרי מידע ציבורי 13,14. עם זאת, רצף מתקרב לתאר חיידקיםקהילות יישארו מספיק בשל חוסר המידע על תרומת חילוף חומרים הפנימית של המינים הבודדים בתוך הקהילה. היציב-איזוטופ חיטוט (SIP) הוא טכניקה נטולת תרבות מבטיחה. הוא משמש לעתים קרובות במיקרוביולוגיה סביבתית לנתח phylogenies חיידקים קשורים לפעילות חילוף חומרים מסוימת. זו מושגת על ידי מעקב אטומים ממצעים יציבים, איזוטופ שכותרתו לתוך סמנים ביולוגיים של חיידקים, כגון חומצות המופקים מפוספוליפידים שומן, DNA, RNA ו5. כאשר שוקלים חומצות גרעין, מתודולוגיה מבוססת על הפרדת 13 DNA שכותרת-C או RNA מ-DNA ללא תווית ידי ultracentrifugation צפיפות שיפוע 6. בשל קשר ישיר זה בין תווית ה-DNA ואת פעילות חילוף חומרים, ניתוח מולקולרי במורד הזרם של חומצות הגרעין מזהה את המינים ומספק מידע על פעילות המטבולית. יתר על כן, שילוב של ה-DNA-SIP וpyrosequencing כפי שיושם על ידיPilloni, פון נצר, et al. 15, מאפשר זיהוי פשוט ורגיש במיוחד של מיני חיידקים המצויים בחלק ה-DNA הכבד 13 כותרת C. עד עכשיו, בטכניקה זו יושמה כדי לתאר את קהילות חיידקים מעורבות בתהליכי biogeochemical בקרקע בתנאים אנאירוביים ואירוביים 16,17 18,19. חוץ מזה של השימוש במדעי הסביבה, הטכניקה יושמה במדעי רפואה כפי שדווחה על ידי רייכרט, et al. 5, שתיאר את הפעילות המטבולית של קבוצות פילוגנטי שונות של חיידקי מעיים האנושיים בתגובה לפחמימות nondigestible. כאן אנו משתמשים 13 C-גלוקוז ל&#39;תווית &#39;את ה-DNA של מיני חיידקים הפעילים מטבולית במעיים. גלוקוז הוא סוכר מנוצל על ידי רוב מיני חיידקים לאורך השביל הנרחב Entner-Doudoroff (ED), אם כי ידועים חריגים 20. זהמצדיק את השימוש ב13 C-גלוקוז כמו בדיקה חילוף חומרים אמינה המספקת קשר בין מטבוליטים של עניין ומקור פחמן לאורך מסלולים הוקמו. בהתאם לשאלה המדעית, מצעים אחרים, כלומר 13 C-מתאן, 13 CO 2, או צמחים שהועלו תחת אווירת 13 CO 2, ניתן להשתמש בם כדי לטפל בפעילות המטבולית. בשלב זה, אנו מציגים הפרוטוקול מיושם באפיון מטבולים של קהילת חיידקי המעיים של חרקים generalist, כלומר ס littoralis (פרפרים, Noctuidae). יתר על כן, הטכניקה הייתה מצמידים את pyrosequencing, אשר בתורו מאפשר זיהוי של קהילת חיידקי מעי חרק עם רזולוציה גבוהה ודיוק. כמצע העיקרי, 13 גלוקוז שכותרת-C נוצל במהלך הניסויים.

<table><tbody><tr><td>Dumont #5 מלקחיים בגימור מראה</td> כלים <td>מדעיים עדינים</td><td>11251-23</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Vannas מספריים אביב</td><td>כלי מדע עדינים</td><td>15000-00</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>רכז ואקום מהיר 5301</td><td>אפנדורף גרמניה</td><td>5305 000.304</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>עלי פלסטיק</td><td>Carl Roth GmbH Co. גרמניה</td><td>P986.1</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>ספקטרופוטומטר NanoVue</td><td>GE HealthCare, בריטניה</td><td>28-9569-58</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Mastercycler pro/thermocycler</td><td>Eppendorf גרמניה</td><td>6321 000.515</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>תא אלקטרופורזה אופקי של אגאג'ל</td><td>ביומטרה</td>, <td>הופסק</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>אולטרה-צנטריפוגה (אופטימה L-90K)</td><td>בקמן</td><td>A20684</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>רוטור אולטרה-צנטריפוגה (NVT 90)</td><td>בקמן</td><td>362752</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>משאבת HPLC</td><td>Agilent</td><td>1100</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Quick-Seal, צינור פוליאלומר</td><td>בקמן</td><td>342412</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>טרנס-תאורה UVstar 15&nbsp;</td><td>ביומטרה</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr></tbody></table>

זיהוי של חיידקים פעילים מטבולית במעיים של generalist<em&gt; spodoptera littoralis</em&gt; באמצעות איזוטופ יציב dna גשוש שימוש<sup&gt; 13</sup&gt; c-גלוקוז

Identification of Metabolically Active Bacteria in the Gut of the Generalist Spodoptera littoralis via DNA Stable Isotope Probing Using 13C-Glucose

אומץ של רוב החרקים הם מיושבים על ידי קהילות מורכבות של חיידקי nonpathogenic סימביוטיים. בתוך קהילות של חיידקים כאלה ניתן לזהות מיני commensal או חיידקי mutualistic. אלה האחרונים, נצפו לשרת פונקציות רבות לחרקים, כלומר מסייעים ברבייה חרקים 1, לחיזוק התגובה החיסונית 2, ייצור פרומון 3, כמו גם תזונה, כוללים הסינתזה של חומצות אמינו חיוניות 4, בין יתר. בשל החשיבות של עמותות אלה, מאמצים רבים נעשו כדי לאפיין את הקהילות עד לחברים הבודדים. עם זאת, רוב המאמצים אלה היו מבוססים גם על שיטות גידול או הסתמך על הדור של שברי גני 16S rRNA שהיו רצף לזיהוי סופי. למרבה הצער, גישות אלה זוהו רק מיני חיידקים הנמצאים במעי ולא סיפקו informatיון על הפעילות המטבולית של מיקרואורגניזמים. כדי לאפיין את מיני חיידקים הפעילים מטבולית במעיים של חרקים, השתמשנו איזוטופ היציב חיטוט (SIP) in vivo העסקת 13 C-גלוקוז כמצע אוניברסלי. זוהי טכניקה נטולת תרבות מבטיחה המאפשרת ההצמדה של phylogenies חיידקים לפעילות המטבולית שלהם בפרט. זה אפשרי על ידי מעקב אטומים ממצעים יציבים, איזוטופ שכותרתו לתוך סמנים ביולוגיים של חיידקים, כגון DNA ו-RNA 5. שילוב של 13 C איזוטופים לתוך ה-DNA מגביר את הצפיפות של ה-DNA שכותרתו בהשוואה לללא תווית (12 C) אחד. בסופו של הדבר, ה-DNA שהכותרת-C 13 או RNA הוא מופרדת על ידי ultracentrifugation צפיפות שיפוע מאחד 6 דומים 12 C-ללא התווית. הניתוח מולקולרי הבא של isotopomers חומצות הגרעין המופרד מספק את הקשר בין פעילות וזהות המטבולית של המינים. כאן, אנו מציגים את הפרוטוקול המשמש כדי לאפיין את החיידקים הפעילים מטבולית במעיים של חרקים generalist (מערכת המודל שלנו), littoralis Spodoptera (פרפרים, Noctuidae). הניתוח פילוגנטי של ה-DNA נעשה באמצעות pyrosequencing, אשר אפשר ברזולוציה גבוהה ודיוק בזיהוי של קהילת חיידקי מעי חרק. כמצע עיקרי, 13 גלוקוז שכותרת-C שימש בניסויים. המצע היה נמאס לחרקים באמצעות תזונה מלאכותית.

כדי להשיג תיוג מספק של החיידקים הפעילים מטבולית הווה בבטן החרק, החרקים צריכים להיות חשופים למצע C עשיר ב13 לתקופה מותאמת בעבר מספיק כדי לאפשר את ההפרדה של חלק קטן יותר כבד שכותרתו בקלות מללא תווית בהירה אחד. במקרה שלנו, 13 C-גלוקוז נוספו בתזונה המלאכותית בריכוז סופי של 10 מ&quot;מ ליום 1 (איור 1 א). אותה הכמות של גלוקוז הנורמלי (איור 1 ב) סופקה בתזונה המלאכותית של החרקים השליטה. כפי שהוזכר קודם, הפרדה שברי ה-DNA (כבדה יותר מק...

קהילת החיידקים הפעילה הקשורים לבטן של littoralis Spodoptera, נקבעה על ידי יציב-חיטוט-איזוטופ (SIP) מצמידים את pyrosequencing. השימוש במתודולוגיה זו, זיהוי של מיני חיידקים הפעילים מטבולית בתוך הקהילה נעשה ברזולוציה גבוהה ודיוק.

זיהוי של חיידקים פעילים מטבולית במעיים של Generalist<em&gt; Spodoptera littoralis</em&gt; באמצעות איזוטופ יציב DNA גשוש שימוש<sup&gt; 13</sup&gt; C-גלוקוז

Guts of most insects are inhabited by complex communities of symbiotic nonpathogenic bacteria. Within such microbial communities it is possible to ...

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לפרט מתודולוגיה יעילה המשמשת לאפיון פילוגנטי של חיידקים פעילים מטבולית במעי של חרק. מטרה זו מושגת תחילה על ידי האכלת החרק בגלוקוז מסומן ב-C 13, כדי להעשיר איזוטופית את ה-DNA של החיידקים הפעילים מטבולית במעיו. השלב הבא הוא מיצוי ה-DNA של קהילת החיידקים הנוכחת במעי.השלב השלישי הוא הפרדת ה-DNA של המינים הפעילים מטבולית, אשר הקליטו את ה-C 13. לאחר מכן, ה-DNA מזוהה פילוגנטית ומכומת עבור המינים הנוכחים באמצעות pyro sequencing. בכך מזוהים המינים הבקטריאליים הפעילים מטבולית המרכיבים את הקהילה הנוכחת במעי החרק.מערכת העיכול של אורגניזם רב-תאי היא המצאה מבריקה המנצלת את היכולות המטבוליות של מיקרואורגניזמים להמיס או להפוך למסיבים חומרים אורגניים מורכבים, כך שיוכלו בסופו של דבר לשמש כחומרי הזנה עבור החרק המארח. כדי להבין את המערכת, עלינו לנתח תחילה מי נמצא שם, ושנית, למי יש אילו פעילויות מטבוליות. אם יהיו בידינו נתונים אלו, נוכל לשחזר את זרימת המטבוליטים ותוצרי הפירוק בין המיקרואורגניזמים המפרקים לבין החרק המארח.שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום האקולוגיה המיקרוביאלית, ובמיוחד באופן שבו מיקרובים אלו מקיימים אינטראקציה עם המארח שלהם. במובן זה, נוכל ללמוד יותר ולהבהיר ולהגדיר מהם התפקידים שארגוניזמים אלו ממלאים עבור המארח. יתרה מכך, שיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי חיידקי המעי הפעילים באופן כללי.על ידי מעקב אחר הגלוקוז המסומן, ניתן לבצע את הפעולה גם עבור מקור פחמן אחר, כגון סימון תאית (cellulose) כדי לזהות חיידקים פעילים המעורבים בתהליך העיכול של רכיב תזונתי מסוים. יש לשמור על המכלים, הביצים וצלחות הפטרי בטמפרטורת החדר עד לבקיעתם. לאחר מכן, העבירו את הלרוואות שבקעו זה עתה לקופסה פלסטית נקייה וגדלו אותן על תזונה מלאכותית בטמפרטורה של 23 עד 25 °C תחת משטר של יום ארוך הכולל 16 שעות של תאורה ושמונה שעות של חשיכה. לאחר מספר ימים, העבירו 9 עד 15 לרוואות בריאות בשלב ה-second instar מקופסת הגידול לצלחות פטרי אינדיבידואליות המכילות C 13 glucose טרי.תזונה מלאכותית מועשרת, נדרשים לפחות שלושה חזרות של שלושה זחלים לכל טיפול. השתמשו בתזונה מלאכותית המספקת את אותה כמות של גלוקוז טבעי כמו מקור מזון טבעי, כגון כותנה, להאכלת קבוצת הביקורת. במהלך 24 השעות הבאות.יש לחדש את התזונה המלאכותית בתדירות גבוהה. התחילו בהעברת הזחלים באמצעות פינצטה רכה אל תוך מאגר של מים מזוקקים כדי להסיר פסולת גסה. לאחר מכן, העבירו אותם לכלי נקי חדש להרדמה ולהריגה של החרקים.הנח אותם על קרח ולאחר מכן הורד את הטמפרטורה ל-negative five degrees Celsius בתוך קירור. לאחר מכן, חטא את החרקים המתים עם 70%ethanol והטבל אותם ב-PBS לצורך הניתוח. יש לנקות גם את הכלים באמצעות 70%ethanol.התחילו בביצוע חתכים בקוטיקולה לאורך הצד הימני והשמאלי. התחילו בראש וסיימו באנוס. הסירו את כל השלד החיצוני, את השפופרות המלטיות ואת גוף השומן.לאחר מכן, החליפו את התמיכה לפני פתיחת המעי במעי שבודד מרקמות אחרות. עיבדו את המעי כולו או חלקים ממנו עבור המעי האמצעי או המעי האחורי, בהתאם לשאלה המדעית.העבירו את רקמות המעי ללא PBS למבחנה סטרילית קטנה ואחסנו אותן במקפיא. לפני מיצוי ה-DNA, ייבשו את הדגימות בטמפרטורה של 45 °C במכשיר ריכוז בוואקום למשך 30 עד 90 דקות, בהתאם לגודל הרקמה. לאחר מכן, רסקו את הרקמה המיובשת באמצעות Pele פלסטיק סטרילי כדי למצות את ה-DNA הגנומי באמצעות ערכה למיצוי DNA מאדמה.לאחר מכן, קבעו את ריכוז ה-DNA הסופי שאלואה באמצעות ספקטרופוטומטר. ודאו כי חילוץ ה-DNA המטגנומי המיקרוביאלי ממעי החרק הצליח על ידי הכנת בדיקת PCR אבחנתית באמצעות הפריימרים הבקטריאליים הכלליים 27 F ו-1, 492 R. לצורך האבחנה, הריצו חמישה מיקרוליטרים מכל תוצר PCR על ג'ל אגרוז 1% במתח של 300 וולט וזרם של 115 מיליאמפר למשך כ-20 דקות.הגודל הנכון של האמפליקונים הוא 1.5 kilobases. רכזו את ה-DNA שחולץ עבור כל שכפול ניסויי. שמרו על הפרדה בין הדגימות עם C 13 glucose לבין הדגימות ללא C 13 glucose.נרמלו את ריכוזי ה-DNA כדי להבטיח שכל דגימה תתרום באופן שווה למאגר שלה. ריכוז סופי של 500 עד 5,000 nanograms של DNA מתאים לתהליך האולטרה-צנטריפוגציה. בדקו שוב את הריכוז הצפוי באמצעות ספקטרופוטומטר בתוך מבחנה סטרילית עם מכסה הברגה בנפח 15 milliliter.הכינו את מצע המדרג. ערבבו את ה-DNA שסכוּם כמותו עם 4.8 milliliters של תמיסת צזיום כלוריד. לאחר מכן, השלימו את הנפח עם שישה milliliters של בופר מדרג.העבירו בזהירות את התערובות למבחנות אולטרה-צנטריפוגה של 5.1 milliliter. מלאו את המבחנות עד לבסיס הצוואר שלהן באמצעות מזרק ומחט, והימנעו משאיבה או מיצירת בועות אוויר. כלל לפחות גרדיאנט ביקורת (blank) ללא DNA בכל הרצה.כדי שישמשו כגרדיאנט ייחוס, בחרו זוגות של מבחנות ואזנו אותם עד להפרש של 10 milligrams. הרכיבו פקק אטימה (tube topper) על כל מבחנה וודאו שהן אטומות לנזילות על ידי היפוך המבחנה והפעלת לחץ מתון ביד. השתמשו ברוטור כמעט אנכי עם שמונה בארות.אטמו בזהירות את בארי הרוטור והכניסו את הרוטור לאולטרה-צנטריפוגה בהתאם להוראות היצרן. צנטריפוגו את ה-DNA במהירות של 50,000 RPM בטמפרטורה של 20 °C תחת ואקום למשך 40 שעות. בחרו בהאצה מקסימלית ובהאטה ללא בלימה.יומיים לאחר מכן, הוצאו בזהירות את המבחנות מרותם הצנטריפוגה באמצעות פינצטה. הניחו אותן במעמד מבלי להפר את הגרדיאנטים שנוצרו ועבדו עם המבחנות באופן מיידי. ראשית, בצעו שיווי משקל (equilibrate) למערכת ה-HPLC באמצעות קצב זרימה של 850 µL לדקה.לאחר מכן, הצמידו את מבחנת האולטרסנטריפוגה למעמד עם תפיסה ונקבו את תחתית המבחנה באמצעות מחט במידה 23 וגודל של אינץ' אחד המחוברת למזרק. נקבו בזהירות את חלקו העליון של המבחנה עם מחט בקרה כדי למנוע הפרעה למבנה הגרדיאנט, ותרגלו את הפעולה מראש כדי להבטיח הוצאה מוצלחת של ה-PSA. לאחר מכן, הכניסו את המחט המחוברת לפמפת השאיבה לחלק העליון של המבחנה, באזור שאינו מכיל נוזל, ואספו טיפות מהתחתית ישירות למבחנות Microfuge סטריליות בנפח 1.5 millilitre. אספו פרקציה אחת בכל 30 שניות, בנפח של 425 microliters לפרקציה.בדוגמה זו, נאספים 12 פראקציות מכל מדרג (gradient). לאחר מכן, יש למדוד את הצפיפות של כל פראקציה מופרדת באמצעות מאזניים אנליטיים. המשיכו לשחזור ה-DNA ולביצוע pyro sequencing בהתאם לפרוטוקול הכתוב למשך 24 שעות.10 millimolar C 13 glucose הוספו לתזונה של זחלי ssop liters. כמות זהה של גלוקוז רגיל הוספה למזונם של חרקי הביקורת. לאחר מכן, DNA הופק מהקהילת החיידקית של מעי החרק.בג'ל אלקטרופורזה, פס רחב של DNA גנומי בחלק העליון אישש את הצלחתו של מיצוי ה-DNA, וביצוע PCR אבחנתי באמצעות פריימרים בקטריאליים אוניברסליים העידו על נוכחות של DNA בקטריאלי. ריצוף pyro כמותי בוצע ישירות על מדרגי ה-SIP המייצגים כדי לחשוף את השושלות של המינים ואת השפעיות היחסיות שלהם. בסך הכל הופקו 120,045 קריאות באיכות גבוהה עם אורך ממוצע של 404 OTs.פרופיל ה-pyro sequencing הראה שפע מוגברת של מינים מסוימים, ביניהם enterococcus ו-panto, בדגימה המסומנת בהשוואה לקבוצת הביקורת. לפיכך, חיידקים אלה נחשבים לפעילים מטבוליים ומצדיקים מחקר מעמיק יותר. לכן, בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור לכלול ביקורת מתאימה בניתוח ה-CYP.כך ניתן יהיה להפחית את השפעת הרקע והזיהום בתוך דגימת השערה, ולהבטיח כי המגוון והשפע של החיידקים המופיעים או נעלמים אינם תוצר של המסה עצמה. לאחר ביצוע הליך זה, ניתן להשתמש במתודולוגיות כגון היברידיזציה נגדית באתר (fluorescence in situ hybridization) ולבצען כדי לענות על שאלות נוספות. במקרה כזה, נבחן את המיקום והסידור של החיידקים בתוך מעי החרק.

identification-metabolically-active-bacteria-gut-generalist

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

DNA-איזוטופ יציב חיטוט היא שיטת טיפוח עצמאית לזהות ולאפיין הקהילות פעיל של מיקרואורגניזמים המסוגלים ניצול מצעים ספציפיים. הטמעת מצע מועשר באיזוטופ הכבד מוביל התאגדות של אטומים שכותרתו לתוך ביומסה של חיידקים. שיפוע ultracentrifugation צפיפות מאחזר DNA שכותרתו עבור ניתוחים מולקולריים במורד הזרם.

DNA-איזוטופ יציב גשוש (ה-DNA SIP)

פרופיל איזוטופים יציבים ידי ניתוח כרומטוגרפיה מסת הגז spectrometric של השטף מטבולית מתווך מתואר...

פרופיל איזוטופים יציבים של שטף מטבולית מתווך בשלב פיתוח למבוגרים Caenorhabditis elegans</em

13 C-איזוטופ תיוג היא טכניקה יעילה לקביעת מטבוליזם התא מרכזי בסוגים שונים של מיקרואורגניזמים. אחרי תאים בתרבית כבר עם מצע שכותרתו ספציפיים, GC-MS המדידה יכול לחשוף מסלולים מטבוליים פונקציונלי המבוסס על דפוסי תיוג ייחודי חומצות אמינו proteinogenic.

מסלול אישור דיסקברי מטבולית ודרך 13 C-תיוג של חומצות אמינו Proteinogenic

הנפוץ ביותר ניתוח תוכן הבטן של macroinvertebrates הם חזותיים. הדורשים ידע אינטנסיבי ונעשית מורפולוגי של אורגניזמים טרף, הם מתגעגעים טרף גוף רך, בשל comminution חזקה של טרף, הם כמעט בלתי אפשרית עבור אורגניזמים מסוימים, כולל amphipods. אנו מספקים נתונים היסטוריים, רומן גישות גנטיות עבור macroinvertebrate טרף זיהוי בתזונה של amphipods.

פרוטוקול המעבדה הגנטית ניתוחים תוכן הבטן של הימית Macroinvertebrates באמצעות קבוצה ספציפית rDNA תחל

חומצת שומן מרקר עם מחלות הגישה, קרי, ההטמעה של חומצות שומן כמו כל מולקולה והעברת לתוך רקמות לצרכן ללא או משנית השינוי, היא הקשו על ידי פערי ידע חומצת שומן חילוף החומרים של אדמה קטנים חסרי חוליות. איזוטופולוג פרופיל מסופק כלי חשוב כדי disentangle אינטראקציות עם מחלות.

חומצת שומן 13C איזוטופולוג פרופיל מספק תובנה מטבולי של הגעה צרכנים והעברת פחמן עם מחלות

הנייר הזה מדווח הפרוטוקול עבור וזמינותו זיהוי מהיר של כנימת עש הטבק מבוסס על טכנולוגיית בתיווך לופ הגברה איזותרמי (מנורה). הפרוטוקול דורש הכשרה מינימלית מעבדה, לכן, ניתן ליישם באתר בנקודות של ערך היבוא צמח כגון הקנתה ושדות תעופה.

בתיווך לולאה Assay איזותרמי הגברה (מנורה), עבור זיהוי מהיר של כנימת עש הטבק

הפרוטוקולים מתארים שיטות כרומטוגרפיה נוזלית בעלות ביצועים גבוהים בשילוב עם אינדקס שבירה או זיהוי ספקטרומטרי מסה לחקר תגובות מטבוליות במערכות מורכבות המבוססות על ליסאט ללא תאים.

כרומטוגרפיה נוזלית בשילוב לאינדקס שבירה או זיהוי ספקטרומטרי מסה ליצירת פרופיל מטבוליט במערכות ללא תאים מבוססות ליסאט

אנו מציגים את תהליך הבידוד, ההתרבות והאפיון של חיידקים מפרקים פחמימנים מבתי גידול מימיים. הפרוטוקול מתאר בידוד חיידקים, זיהוי בשיטת 16S rRNA, ובדיקת פוטנציאל פירוק הפחמימנים שלהם. מאמר זה יסייע לחוקרים לאפיין מגוון ביולוגי מיקרוביאלי בדגימות סביבתיות, ובמיוחד לסנן מיקרובים בעלי פוטנציאל לריפוי ביולוגי.

בידוד, ריבוי וזיהוי של מיני חיידקים בעלי תכונות מטבוליזם פחמימני מבתי גידול מימיים

כדי להשיג חרק אקסני, משטח הביצה שלו מעוקר, והזחל הבוקע גדל לאחר מכן באמצעות עלים אקסניים. שיטה זו מספקת דרך יעילה להכנת חרקים אקסניים מבלי לתת אנטיביוטיקה או לפתח תזונה מלאכותית, אשר ניתן ליישם גם על חרקים אוכלי עלים אחרים.

הכנה וגידול של חרקים אקסניים עם שתילים מתרבית רקמה למחקרי אינטראקציה של מיקרוביוטה של המעי המארח של חיפושית העלים

Caenorhabditis elegans הוא מודל רב-עוצמה לבחינת הדטרמיננטים המולקולריים המניעים אינטראקציות בין המארח למיקרוביום. אנו מציגים צינור בתפוקה גבוהה המתאר את רמות ההתיישבות של מיקרוביום המעי בבעלי חיים בודדים יחד עם היבטים מרכזיים של הפיזיולוגיה של C. elegans.

יישום של ורמימטריית זרימה לכימות וניתוח של מיקרוביום המעי Caenorhabditis elegans

כאן, אנו מציגים פרוטוקול המשתמש בהכלאה פוטותרמית פוטותרמית-פלואורסצנטית באתרו (OPTIR-FISH), הידועה גם בשם MID-INFRARED PHOTOTHERMAL-FISH (MIP-FISH), כדי לזהות תאים בודדים ולהבין את חילוף החומרים שלהם. מתודולוגיה זו יכולה להיות מיושמת באופן נרחב עבור יישומים מגוונים, כולל מיפוי מטבוליזם תאי עם רזולוציה של תא יחיד.

הכלאה פוטותרמית אופטית אינפרא אדום-פלואורסצנטי באתרו (OPTIR-FISH)

חקור זיהוי חיידקים פעילים מטבולית במעיי Spodoptera littoralis באמצעות שיטת SIP עם גלוקוז מסומן ב-13C. השיטה מאפשרת קישור בין זהות מיקרוביאלית לפעילות מטבולית בחיי החרקים.

זיהוי של חיידקים פעילים מטבולית במעיים של Generalist

גלה סרטונים נוספים