פלישת חיידקי enteric של תאי אפיתל במעי

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא להשתמש במודל תא הדיפוזיה האנכי (vertical diffusion chamber או VDC) כדי לחקור אינטראקציות חיידקיות עם פלישה של תאי אפיתל של המעי. דבר זה מושג תחילה על ידי שימוש במסנן מיוחד שבו מושכב שכבה אחת (monolayer) מקוטבת של תאי אפיתל של המעי מסוג Caco-2, כדי ליצור תאים (compartments) אפקליים ובזאלי-לטרליים נפרדים ב-VDC. בשלב השני, מוסיפים לתא האפקלי את האינוקולום החיידקי הנחקר.

תחת תנאי מיקרו-אירוביים ובתרבית תאים, מוסיפים מצע לתא הבסולטרלי תחת תנאים אירוביים, ולאחר מכן, בנקודות זמן רצויות במהלך התרבית המשולבת, מסירים את המסנן וסופרים את מספר החיידקים האינטראקטיביים או התוך-תאיים. בסופו של דבר, ניתן להבחין בעלייה במספר החיידקים האינטראקטיביים והתוך-תאיים בשימוש במודל VDC בהשוואה לתנאי תרבית אירוביים סטנדרטיים. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון בדיקות הדבקה ופלישה סטנדרטיות בתרביות רקמה, הוא שבעזרת טכניקה זו, התרבית המשולבת של חיידקים ותאי אפיתל של המעי מבוצעת תחת תנאי in vitro המדמים באופן הדוק יותר את תנאי ה-in vivo של מעי האדם.

את הפרוצדורה ידגימו N Vida nas, סטודנטית לדוקטורט מהמעבדה שלי, ו-Dominic Mills, פוסט-דוקטור שפיתח את מודל תא הדיפוזיה האנכי כחלק מהדוקטורט שלו במעבדתי. התחילו בזריעה של 4×10⁵ תאי Caco-2 (תאי אפיתל של המעי) לכל פילטר של 0.4 µm במצע תרבית, לאחר מכן גדלו את התאים עד להגעה לפולריזציה במשך 21 ימים, תוך החלפת המצע מדי יומיים עד שלושה ימים, כדי לאשר את מצב הפולריזציה של השכבה החד-שכבתית (monolayer). השתמשו במד התנגדות (volt ohm resistance meter) למדידת ההתנגדות החשמלית התא-אפיתלית (TEER).

24 שעות לפני תחילת בדיקת השיתוף-תרבית (co-culture) ב-VDC, דגרו jejuni על צלחת אגר דם טרייה בתנאים מיקרו-אווירוביים בתוך אינקובטור בעל אטמוספירה משתנה. במקביל, בצעו דגירה מקדימה של 30 milliliters של ציר ברוס (Bruce broth) תחת אותם תנאים. ביום הניסוי, טבלו את חצאי התאים של ה-VDC, כמו גם את טבעות ה-O והפקקים, בתמיסת סטריליזציה. לאחר מכן, השתמשו במזרק סטרילי של 20 milliliter כדי לשטוף את התמיסה דרך פתחי הגז בשני חצאי התאים. לאחר שעה, שטפו את רכיבי ה-VDC במים סטריליים טריים באמצעות מזרק סטרילי נוסף של 20 milliliter לשטיפת פתחי הגז.

לאחר מכן, קצרו מחצית מהתרבית של ה-CJ jui מלוח אגר דם לתוך מיליליטר אחד של מרק barella שעבר דגירה מוקדמת, כדי להניב כ-10¹⁰ CFU למיליליטר. מדדו את הצפיפות האופטית של תרחיף החיידקים ב-600 ננומטר כדי לכמת באופן חלקי את מספר יחידות יוצרות המושבות (CFUs), ולאחר מכן התאימו את תרחיף החיידקים לרמת האינוקולום הרצויה בנפח כולל של ארבעה מיליליטר של מרק Bruce שעבר דגירה מוקדמת. בצעו דילול סדרתי מתוך תרחיף חיידקים סופי זה, לאחר מכן זרעו את הדילול המתאים על לוחות אגר דם בשלוש חזרות, ודגרו את הלוחות באינקובטור לאטמוספירה משתנה למשך 48 שעות.

כעת, הניחו את החלק התחתון של תא ה-VDC בצורה שטוחה על השולחן והתקינו עליו טבעת אטם (O-ring). לאחר מכן, הוציאו מהנשא מסנן אחד הנושא את תאי אפיתל המעי ושטפו אותו שלוש פעמים עם 400 µL של PBS סטרילי. הניחו את המסנן על החלק התחתון של התא, תוך וידוא שטבעת האטם נשארת במקומה, ולאחר מכן הורידו בעדינות את החלק העליון של התא למקומו.

לאחר הרכבת שני חצאי התאים, הדק אותם יחד באמצעות טבעות ההידוק והנח את ה-VDC בצורה אופקית על משטח העבודה כאשר שני הפתחים פונים כלפי מעלה. הוסף את האינוקולום הבקטריאלי לחצי התא האפיקלי (apical half chamber) ולאחר מכן הוסף ארבעה milliliters של מצע תרבית תאים לחצי התא הבזאלי-לטרלי (basal lateral half chamber). הכנס את רכיבי הסגירה לפתחים בשני חצאי התאים, ולאחר מכן הנח את ה-VDC בתוך אינקובטור בעל אטמוספירה משתנה.

בסמיכות לסועד הגז, פתח את ווסת אספקת הגז המחובר לסועד הגז. חבר את הצינור מהסועד אל כניסת הגז בתא החצי הצדי התחתון של ה-VDC, ולאחר מכן חבר את צינור יציאת הגז המוביל אל מחוץ לאינקובטור בעל האטמוספירה המשתנה לאחת היציאות בפיסת הקצה של תא החצי הצדי התחתון. סגור את היציאה השנייה בפיסת הקצה של תא החצי הצדי התחתון.

לאחר מכן, פתחו את זרימת הגז בסבון הגז (gas manifold) באיטיות רבה כדי למנוע לחץ גז עודף ולהשיג זרימת גז של בועה אחת כל שתי עד חמש שניות לאחר תקופת השיתוף-תרבות (co-culture) המתאימה. סגרו את ווסת אספקת הגז המחובר לסבון הגז. לאחר מכן, פתחו את זרימת הגז אל ה-VDC בסבון הגז ונתקו את כניסת הגז, יציאת הגז ואת הפקק מה-VDC.

בשלב הבא, הוצא את ה-VDC מהאינקובטור בעל האטמוספירה המשתנה. לאחר מכן, הוצא את העלונות (supernatants) מהחלקים האפיקליים והבזאליים ושמור אותן בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס לצורך אנליזה עתידית. הסר את תפסני הטבעת פרק בעדינות את ה-VDC.

הסיר את המסנן מחצי התא והעבר אותו לכלי תרבית תאים סטרילי בעל שש בארות. לאחר מכן, שטוף את ה-VDC במים סטריליים ושמור אותו לסבב הניסויים הבא לצורך ספירת המספר הכולל של החיידקים המקיימים אינטראקציה. שטוף את תאי אפיתל המעי שלוש פעמים ב-400 µL של PBS סטרילי, ולאחר מכן בצע ליסיס לתאים ב-400 µL של PBS סטרילי המכיל Triton X 100 למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. בצע דילול סדרתי מליסאט התאים, ולאחריו זריעה של הדילולים המתאימים על מצעי אגר דם בשלישייה.

לאחר מכן, דגרו את הצלחות בטמפרטורה של 37 °C באינקובטור בעל אטמוספירה משתנה למשך 48 שעות לצורך ספירה של המספר הכולל של החיידקים הפולשים. דגרו את תאי אפיתל המעי עם 400 µL של מצע תרבית תאים המכיל 150 µg/mL של Gentamycin למשך שעתיים באינקובטור סטנדרטי לתרבית רקמות כדי להרוג את החיידקים החוץ-תאיים. לאחר מכן, כמתו, את יחידות יוצרי המושבות (colony forming units) לאחר ליזיס של התאים, דילול סדרתי ותרבית, כפי שהודגם כעת.

הנתונים הבאים מדגימים השוואה בין מספר תאי CJ jui המקיימים אינטראקציה עם תאי Caco 2 או פולשים אליהם לאחר שלוש, שש או 24 שעות של תרבית משותפת (co-culture) תחת תנאי בדיקה סטנדרטיים של תרבית תאים, לעומת שימוש במודל ה-VDC. לאחר 24 שעות של תרבית משותפת, לדוגמה, ניתן להבחין בפחות מ-10⁷ CFU של CJ jui המקיימים אינטראקציה עם תאי Caco 2 תחת תנאי תרבית תאים סטנדרטיים. עם זאת, לאחר 24 שעות של תרבית משותפת במודל ה-VDC, ניתן להבחין בכ-10⁸ CFU של CJ jui המקיימים אינטראקציה עם תאי Caco 2, מה שמהווה עלייה של כמעט פי עשרה באינטראקציות של CJ jui עם תאי IEC.

בעת השוואת מספר ה-CJ jui הפולשים בתנאי תרבית סטנדרטיים לעומת תנאי VDC, ניתן לבודד כ-10⁵ CFUs תוך-תאיים של CGE jui מתאי CACO two לאחר 24 שעות בתנאי תרבית תאים סטנדרטיים. לעומת זאת, לאחר 24 שעות של תרבית משותפת (co-culture) במודל ה-VDC, ניתן לבודד כ-10⁷ CFUs תוך-תאיים מתאי CACO two, המהווה עלייה של כמעט פי 100 בכמות ה-CGE התוך-תאי. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לנטר את זרימת הגז בתא הבזאלי-לטרלי לאחר פיתוחו.

טכניקה זו סללה את הדרך עבור חוקרים בתחום הפתוגנזה של abuc לחקור הן את הבסיס הגנטי של האינטראקציה החיידקית עם תאי אפיתל של המעי, והן את תגובת המערכת החיסונית המולדת של המאכסן לזיהום חיידקי. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי אופן השימוש במודל תא הדיפוזיה האנכי כדי לחקור אינטראקציות של חיידקים אנטריים אחרים עם תאי אפיתל של המעי, ותנאים המייצגים באופן מדויק יותר את התנאים במעי האנושי.