מודל במבחנה לחקר התגובות החיסוניות של תאים חד-גרעיניים בדם היקפי אנושי לזיהום בנגיף סינציאלי נשימתי אנושי

המטרה הכוללת של הליך זה היא לחקור את התגובה של תאי חיסון אנושיים לנגיף סינציאלי נשימתי או זיהום RSV. זה מושג על ידי תרבית ראשונה של מלאי RSV זיהומי על תאי הלו. בשלב השני, מלאי ה-RSV המתורבת מטוהר על ידי אולטרה-צנטריפוגה.

לאחר מכן, תאי חיסון ראשוניים בדם אנושי מבודדים על ידי צנטריפוגה בצפיפות. בשלב האחרון, תאי החיסון המבודדים מגורים עם הנגיף. בסופו של דבר, ניתן להעריך את התגובה החיסונית התאית לזיהום RSV על ידי E iza QPCR או זרימה ציטומטרית.

טכניקה זו היא תוספת חשובה לחקר זיהומי נגיף סינתטי בדרכי הנשימה. RSV מסתגל מאוד לבני אדם. לכן, חשוב להשתמש בתאי חיסון אנושיים כדי לחקור את המסלולים הדלקתיים המעורבים בפתוגנזה של הנגיף.

למרות שהנגיף המשמש בסרטון זה הוא RSV, ניתן להתאים שיטה זו בקלות גם לחקר נגיפים אחרים כגון נגיף שפעת או רינו-וירוס. התחל בחימום בקבוקון של מלאי ישיבה אנושי RSV ואמבט מים של 37 מעלות צלזיוס. כאשר הנגיף הפשיר, יש לדלל את המלאי בארבעה מיליליטר של חומר זיהום לכל בקבוק.

שמירה על MOI על 0.1 ומטה, הוסף את הנגיף לתאי ההלי ונפח כולל נמוך ככל האפשר מבלי לגרום להתייבשות התאים. ואז דגרו על התרביות במשך שעתיים עד ארבע שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2, וסובבו את הבקבוק כל 15 דקות כדי לפזר מחדש את המדיום. לאחר מכן, הסר את החיסון ושטוף את התאים פעם אחת עם PBS.

לאחר מכן הוסיפו 15 מיליליטר של מדיום תרבות לצלוחיות ודגרו אותם במשך שלושה עד חמישה ימים באותם תנאי תרבות. התבונן בתאים פעם ביום בכל יום במיקרוסקופ שדה בהיר רגיל לשינויים ציטופתולוגיים הנגרמים על ידי הנגיף. כאשר השינויים הללו נצפים, מגרדים את התאים כדי לקצור את ה-RSV ואז אוספים את התרחיף בצינור סטרילי של 50 מיליליטר, קליפת המוח של התאים, ואז צנטריפוגה אותם למשך 10 דקות ב-1800 Gs ובטמפרטורת החדר כדי לגלול את פסולת התא.

RSV אינו מתגלגל במהירות זו, ולכן ניתן לאחסן את הסופרנטנט במינוס 80 מעלות צלזיוס כמלאי זריעה במיליליטר אחד. Aliquots לשימוש עתידי תמיד מקפיאים RSV וחנקן נוזלי כדי למנוע אובדן של חלקיקי נגיף זיהומיים. כדי לטהר RSV התחל בהנחת צינור צנטריפוגה סטרילי בכל דלי של אולטרה-צנטריפוגה.

לאחר מכן הוסף חמישה מיליליטר של תמיסת סוכרוז מעוקרת פילטר שהוכנה טרי לתחתית כל צינור. לאחר מכן, לאט מאוד, הוסף 30 מיליליטר מתמיסת ה-RSV על גבי תמיסת הסוכרוז, תוך הקפדה לא להפריע לתמיסת הסוכרוז ולשמור על השכבות נפרדות ואז בארון זרימה כדי לשמור על סטריליות, אזן בזהירות את ששת דליי האולטרה-צנטריפוגה עם PBS סטרילי לטווח של 0.1 גרם זה מזה, כולל המכסים. סובב את הנגיף למשך 1.5 שעות ב-20,000 RCF וארבע מעלות צלזיוס.

ואז בסיום הסיבוב, השתמש במלקחיים סטריליים כדי להסיר בזהירות את צינורות הצנטריפוגה מהדליים. חלקיקי הנגיף יעברו דרך שכבת הסוכרוז ליצירת גלולה. הטה את צינורות הצנטריפוגה לבקבוק פסולת ויראלית ותן לצינור להתנקז הפוך על משטח סטרילי.

אל תתנו לגלולה להתייבש לחלוטין. לאחר מכן, בזהירות, הניחו למיליליטר אחד של HPSS לעבור על הגלולה והטו שוב את צינור הצנטריפוגה כדי לנקז את ה-HPSS. לאחר מכן הפוך את הצינור שוב, והקפיד למנוע מהגלולה להתייבש.

כעת דרג את הגלולה פי 30 במיליליטר נוסף של HBSS תוך הקפדה על מניעת היווצרות בועות מכיוון שהדבר יכול להרוס את הנגיף. לאחר מכן הקפיא את כמות הנגיף בחנקן נוזלי. אחסן את הנגיף בטמפרטורה שלילית של 80 מעלות צלזיוס עד לכימות ושימוש נוסף לאחר קבלת דם בצינורות EDTA של 10 מיליליטר ממתנדבים בריאים, יש לדלל את הדם ב-PBS בטמפרטורת החדר עד פעמיים עד למקסימום של 35 מיליליטר של דם מדולל בשפופרת של 50 מיליליטר.

לאחר מכן, חבר מחט נעילת פיתוי סטרילית למזרק סטרילי של 50 מיליליטר ולאחר מכן שאב מדיה שיפוע צפיפות לתוך המזרק. הנח את המחט בתחתית צינור הדם המדולל ופיפטה בזהירות 15 מיליליטר של שיפוע צפיפות מתחת לדם, תוך שמירה על תיחום נקי בין שיפוע הצפיפות לדם. כעת הפרד את התאים למשך 20 דקות ב 800 GS בטמפרטורת החדר בתאוצה המקסימלית עם הניתוק לאחר ההפרדה, האריתרוציטים נמצאים בגלולה בתחתית הצינור עם שכבה כסופה של נויטרופילים מעל.

השכבה השקופה מעל הגלולה מכילה את מדיית שיפוע הצפיפות והשכבה הדקה בין מדיית שיפוע הצפיפות לשכבת פלזמת הדם למעלה מכילה את ה-pbmc. השתמש בפיפטה דביקה יותר כדי לאסוף בזהירות את ה-pbmc, ואז העביר את התאים לצינור חדש של 50 מיליליטר על קרח. הוסף PBS קר כקרח לנפח של 50 מיליליטר וגלול את התאים בסיום הסיבוב.

שאפו את הסופרנטנט ושטפו את הגלולה ב-50 מיליליטר PBS קר כקרח פעמיים לאחר הכביסה השנייה, הוסיפו מיליליטר אחד של מדיום קר כקרח לגלולה, ספרו את התאים והתאימו את ריכוז התאים לחמש פעמים 10 לשישה pbmc למיליליטר. כדי לעורר את ה-pbmc עם RSV חי תחילה, הוסף 100 מיקרוליטר של pbmc לכל באר של צלחת תחתונה עגולה של 96 בארות. לאחר מכן הוסיפו 50 מיקרוליטר של שני גירויים מדוללים טריים לכל אחד.

ובכן דגרו את הצלחת למשך 24 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2, ולאחר מכן צנטריפוגה את הצלחת, אספו את הסופרנטנט לניתוח מאוחר יותר על ידי אלייזה. ניתן לנתח את ה-pbmc המגורה בגלולה על ידי QPCR או לצבוע עבור ציטומטריית זרימה. בעת ביצוע ניסוי גירוי A-P-B-M-C, מוצעת שיטת שבר הגירויים בשיטה זו.

התנאים מחולקים לתנאי גירוי סטנדרטיים כגון RPMI או RSV אנושי ותנאי שבר בדיקה כגון mial, dipeptide או LPS. חשוב לציין, בקרה שלילית כגון RPMI בלבד ובקרה חיובית כגון LPS תמיד נכללות בכל ניסוי לאחר 24 שעות של גירוי עם RSV אוכלוסיות PBMC שונות מציגות שיעור זיהום תלוי מינון והבדל ביעילות זיהום RSV לאחר 24 שעות של גירוי עם וירוס qPCR R ניתוח של P BMCs לביטוי TNF אלפא או אינטרפרון גמא מדגים כי RSV גורם לוויסות חזק של שעתוק של שני הציטוקינים הדלקתיים הללו. לעומת זאת, גירוי עם miam dipeptide או LPS גורם רק לביטוי mRNA חלש.

כאשר מגורים BMCs P עם דיפפטיד RSV ו-MIAL יחד, נצפית ויסות סינרגטי חזק. pbmc מגורה נותחו גם לייצורם של TNF אלפא או אינטרפרון גמא על ידי אלייזה. בניגוד לתצפיות ברמת השעתוק, RSV הוא גורם גרוע להפרשת חלבון גמא TNF אלפא ואינטרפרון על ידי גירוי p BMCs עם דיפפטיד miam מביא לייצור כמויות נמוכות של TNF אלפא וללא אינטרפרון גמא.

בדומה לניתוחי השעתוק, גם TNF אלפא וגם אינטרפרון גמא מציגים ויסות סינרגטי כאשר הם מגורים יחד עם RSV ו-MIAM דיפפטיד כבקרה כדי לראות אם השראת ציטוקינים תלויה בשכפול RSV. P BMCs היו מגורים עם RSV חי או בטא פרופל, מושבת לקטון כפי שמוצג בגרפים הן RSV חי והן מושבת המושרה על ידי ייצור ציטוקינים דלקתיים PRO. אל תשכח שניסויים עם RSV חייבים להתבצע בארון בטיחות ביולוגי במעבדה כפולה ברמת בטיחות ביולוגית.

יתר על כן, בעוד שניסיון שיטה זו הוא חיוני לזכור להשתמש בריאגנטים וחומרים נטולי אנדוטוקסין לאורך כל ההליך, לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להיות בעל הבנה טובה כיצד לעורר pbmc אנושי עם RSV ושל מספר בדיקות שניתן להשתמש בהן כדי לנתח את התגובה החיסונית.