מודל במבחנה לחקר התגובות החיסוניות של תאים חד-גרעיניים בדם היקפי אנושי לזיהום בנגיף סינציאלי נשימתי אנושי

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לחקור את תגובתם של תאי מערכת החיסון האנושית לזיהום בנגיף הסנציטיום הנשמי (respiratory syncytial virus) או RSV. דבר זה מושג תחילה על ידי גידול של מלאי RSV זיהומי על תאי helo. בשלב השני, מלאי ה-RSV שגודל עובר טיהור באמצעות an ultracentrifugation.

בשלב הבא, תאי מערכת החיסון הראשוניים מדם אנושי מבודלים באמצעות סבוב צנטריפוגה לפי צפיפות. בשלב הסופי, תאי מערכת החיסון המבודלים מעוררים באמצעות הנגיף. לבסוף, ניתן להעריך את התגובה החיסונית התאית לזיהום ב-RSV באמצעות ELISA, qPCR או ציטומטריית זרימה.

טכניקה זו מהווה תוספת בעלת ערך לחקר זיהומים של נגיף הסנציטיום הנשימתי (RSV). נגיף ה-RSV הוא בעל יכולת הסתגלות גבוהה לבני אדם. לכן, חשוב להשתמש בתאי מערכת חיסון אנושיים כדי לחקור את נתיבי הדלקת המעורבים בפתוגנזה של הנגיף.

למרות שהנגיף המשמש בסרטון זה הוא RSV, ניתן להתאים שיטה זו בקלות גם לחקר נגיפים אחרים, כגון נגיף השפעת או רינווירוס. התחילו בחימום של מבחנה המכילה מאגר RSV אנושי בבמבחנה (seating stock) באמבט מים בטמפרטורה של 37 °C. לאחר הפשרת הנגיף, דללו את המאגר במנות של 4 mL של מצע הדבקה לכל בקבוק.

תוך שמירה על MOI של 0.1 ומטה, הוסיפו את הווירוס לתאי ה-heli בנפח כולל נמוך ככל האפשר מבלי לגרום לייבוש התאים. לאחר מכן, דגרו את התרביות במשך שעתיים עד ארבע שעות בטמפרטורה של 37 °C ו-5%CO2, תוך סיבוב של הבקבוק בכל 15 דקות כדי לפזר מחדש את המצע. לאחר מכן, הסירו את האינוקולום ושטפו את התאים פעם אחת עם PBS.

לאחר מכן, הוסיפו 15 milliliters של מצע גידול לבקבוקונים והדגירו אותם למשך שלושה עד חמישה ימים תחת אותם תנאי תרבית. בצעו תצפית בתאים פעם ביום, מדי יום, תחת מיקרוסקופ שדה בהיר רגיל כדי לזהות שינויים ציטופתולוגיים המושרים על ידי נגיף. כאשר שינויים אלו נצפים, גרדו את התאים כדי לאסוף את ה-RSV, ואז אספו את התרחיף לשפופרת סטרילית של 50 milliliter, בצעו וורטקס לתאים, ולאחר מכן סבבבבם בצנטריפוגה למשך 10 דקות ב-1800 Gs ובטמפרטורת החדר כדי לשקיע את שיירי התאים.

RSV אינו שוקע במהירות זו, ולכן ניתן לאחסן את הנוזל העליון בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס כמלאי זריעה בנפח של 1 mL. יש להקפיא במהירות (snap freeze) מנות (aliquots) לשימוש עתידי של RSV בחנקן נוזלי כדי למנוע אובדן של חלקיקי נגיף זיהומיים. כדי לטהר RSV, התחילו בהנחת מבחנה צנטריפוגית סטרילית בכל סל של אולטרצנטריפוגה.

לאחר מכן, הוסיפו חמישה מיליליטר של תמיסת סוכרוז סטרילית שעברה סינון והוכנה טרי, לתחתית של כל מבחנה. בשלב הבא, הוסיפו באיטיות רבה 30 מיליליטר של תמיסת RSV מעל תמיסת הסוכרוז, תוך הקפדה לא להפר את תמיסת הסוכרוז ולשמור על הפרדה ברורה בין השכבות. לאחר מכן, בתוך תא עבודה סטרילי (flow cabinet) לשמירה על סטריליות, איזנו בזהירות את ששת דליי האולטרה-צנטריפוגה באמצעות PBS סטרילי, עד להפרש של 0.1 גרם לכל היותר בין דלי לדלי, כולל הפקקים. סובבו את הווירוס במשך 1.5 שעות במהירות של 20,000 RCF ובטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס.

לאחר השלמת הסבוב, השתמשו בפינצטה סטרילית כדי להוציא בזהירות את מבחנות הצנטריפוגה מהסלים. חלקיקי הנגיף יעברו דרך שכבת הסוכרוז וייצרו משקע (pellet). השפכו את מבחנות הצנטריפוגה לתוך בקבוק פסולת נגיפית והניחו למבחנה להתרוקן כשהיא הפוכה על משטח סטרילי.

אין לאפשר למשקע להתייבש לחלוטין. בשלב הבא, העבירו בזהירות מיליליטר אחד של HPSS על פני המשקע והטו שוב את מבחנת הצנטריפוגה כדי לנקז את ה-HPSS. לאחר מכן, הפכו את המבחנה שוב, תוך הקפדה שהמשקע לא יתייבש.

כעת, ערבבו בעדינות את המשקע 40 פעמים במיליליטר נוסף של HBSS, תוך הקפדה להימנע מיצירת בועות שעלולות להרוס את הנגיף. לאחר מכן, בצעו הקפאה מהירה (snap freeze) של מנות מהנגיף בחנקן נוזלי. אחסנו את הנגיף בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס עד לשלב הכימות והשימוש העתידי. לאחר קבלת דם בשפופרות EDTA של 10 מיליליטר ממתנדבים בריאים, דללו את הדם באמצעות PBS בטמפרטורת החדר עד פי שניים, למקסימום של 35 מיליליטר דם מדולל בשפופרת של 50 מיליליטר.

בשלב הבא, חברו מחט לולייט-לוק (lure lock) סטרילית למזרק סטרילי של 50 מיליליטר, ולאחר מכן שאבו למזרק מדיום למעבר בצפיפות (density gradient media). מקמו את המחט בתחתית המבחנה המכילה דם מהול וטפטפו בזהירות 15 מיליליטר של מדיום למעבר בצפיפות מתחת לדם, תוך שמירה על הפרדה ברורה בין המדיום לדם. כעת, הפרדו את התאים במשך 20 דקות ב-800 GS בטמפרטורת החדר בתאוצה מרבית עם בלימה (break). לאחר ההפרדה, תאי הדם האדומים יימצאו במשקע בתחתית המבחנה, כשמעליהם שכבה כסופה של נויטרופילים.

השכבה השקופה שמעל המשקע מכילה את מדיום מפלס הצפיפות, והשכבה הדקה שבין מדיום מפלס הצפיפות לבין שכבת פלזמת הדם למעלה מכילה את ה-pbmc. השתמשו בפיפט רב-ערוצי כדי לאסוף בזהירות את ה-pbmc, ולאחר מכן העבירו את התאים למבחנה חדשה של 50 milliliter על קרח. הוסיפו PBS קר מאוד עד לנפח של 50 milliliters והשקיעו את התאים עם סיום הסבוב.

שאבו את הנוזל העליון ושטפו את המשקע ב-50 milliliters של PBS קר בקרח פעמיים. לאחר השטיפה השנייה, הוסיפו למשקע one milliliter של מצע קר בקרח, ספרו את התאים והתאימו את ריכוז התאים ל-5×10⁶ pbmc ל-milliliter. כדי לעורר את ה-pbmc באמצעות RSV חי, הוסיפו תחילה 100 microliters של pbmc לכל באער של פלטה בעלת תחתית עגולה של 96 באערים. לאחר מכן, הוסיפו לכל באער 50 microliters משני גירויים שדוללו acabado.

דגרו את הפלטה למשך 24 שעות ב-37 °C ו-5% CO2, ולאחר מכן סובבו את הפלטה בצנטריפוגה ואספו את העלייה (supernatant) לצורך אנליזה מאוחרת באמצעות ELISA. ניתן לנתח את ה-pbmc המעוררים במשקע באמצעות QPCR או לצבוע אותם עבור ציטומטריית זרימה. בעת ביצוע ניסוי של גירוי pbmc, מומלץ להשתמש בשיטת הפרדת המעוררים (stimuli fraction method) יחד עם שיטה זו.

התנאים מחולקים לתנאי גירויים סטנדרטיים כגון RPMI או RSV אנושי, ולתנאי פראקציות לבדיקה כגון mial, דיפפטיד או LPS. חשוב לציין כי בכל ניסוי נכללים תמיד ביקורת שלילית, כגון RPMI לבדו, וביקורת חיובית, כגון LPS. לאחר 24 שעות של גירוי באמצעות RSV, אוכלוסיות שונות של PBMC מראות קצב הדבקה תלוי-מינון והבדל ביעילות ההדבקה של RSV. לאחר 24 שעות של גירוי בנגיף, ניתוח qPCR של ה-PBMCS לבדיקת הביטוי של TNF alpha או interferon gamma מדגים כי RSV גורם לעלייה חזקה בטרנסקריפציה של שני ציטוקינים דלקתיים אלו. לעומת זאת, גירוי באמצעות miam, דיפפטיד או LPS גורם לביטוי mRNA חלש בלבד.

כאשר מעבבים תאי PBMC עם RSV ועם הדיפפטיד MIAL יחד, נצפית עלייה סינרגית חזקה בביטוי. תאי ה-PBMC המעובבים נותחו גם לגבי ייצורם של TNF Alpha או Interferon gamma באמצעות ELISA. בניגוד לתצפיות ברמת השעתוק, RSV הוא מעודד חלש של הפרשת חלבוני TNF alpha ו-interferon gamma על ידי תאי PBMC; עיבוד עם הדיפפטיד MIAL מוביל לייצור של כמויות נמוכות של TNF alpha וללא ייצור של interferon gamma.

בדומה לאנליזות התעתוק, הן TNF alpha והן interferon gamma מראים ויסות חיובי (upregulation) סינרגי כאשר הם מעוררים במקביל עם RSV ודיפפטיד MIAM, כביקורת לבדיקה האם השראת הציטוקינים תלויה בשכפול ה-RSV. תאי BMC של עכברים עוררו עם RSV חי או RSV שהושבת באמצעות beta propal lactone; כפי שמוצג בגרפים, הן RSV חי והן RSV מושבת השרו ייצור של ציטוקינים פרו-דלקתיים. זכרו כי ניסויים עם RSV חייבים להתבצע בתוך קבלית בטיחות ביולוגית במעבדה ברמת בטיחות ביולוגית 2 (BSL-2).

יתרה מכך, בעת ניסיונו של שיטה זו, חיוני לזכור להשתמש בריאגנטים וחומרים נקיים מאנדוטוקסינים לאורך כל הפרוצדורה. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו מעוררים PBMC אנושיים באמצעות RSV, וכן לגבי מספר בדיקות שניתן להשתמש בהן כדי לנתח את התגובה החיסונית.