Name: מכלולים נגד סרטן מתכת: סינתזה וCytotoxicity הערכה על ידי assay MTT (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-10T21:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 14 s
Description: למד סינתזה של תרכובות אנטי-סרטן מבוססות טיטניום וונדיום ואת הערכת הרעילות התאית שלהן באמצעות מבחן MTT. שיטה זו מאפשרת לקבוע ערכי IC50 ולהעריך יעילות תרופות מתכתיות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מימון התקבל ממועצת המחקר האירופית במסגרת התכנית של הקהילה האירופית מסגרת השביעית (FP7/2007-2013) / הסכם גרנט ERC אין [239,603]

<ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת V (V) מורכב (איור 2); 18 התנהלות צעדים 1.1-1.4 בתא הכפפות, אם כפפת תיבה אינה זמינה, דלג לחלופת שלבים 2 (2.1-2.6). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים 0.42 מילימול של ligands H 2 L ב THF היבש ולהוסיף אותו לפתרון ערבוב של כמויות שווה ערך של VO (O i Pr) 3 בTHF. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את תערובת התגובה בטמפרטורת חדר במשך 15 דקות, ולהסיר את נדיפים תחת ואקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת הקסאן הקר ולהסיר אותו תחת ואקום. יש לקבל אבקה סגולה כהה בתשואה כמוני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוקל 8 מ&quot;ג של המתחם שהושג בבקבוקון Eppendorf. דלג לשלב 3. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן מורכב V (V) באמצעות קו Schlenk. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים 0.42 מילימול של L יגנד H 2 בTHF היבש בבקבוק Schlenk יבש עם כובע מחץ, לצרף קו Schlenk ולהחיל לסירוגין סביבות ואקום / גז אינרטי (N 2 או אר), מומלץ ליישם את שלושה sUCH סיבובים ולהמתין 2-5 דקות על שלבי הוואקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת THF היבש באמצעות מזרק דרך פקק מחצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף כמויות שווה ערך של VO (O i Pr) 3 בתמיסת THF, שהוכנה באופן דומה על ידי משדלת בקבוק Schlenk יבש נכון לשורה, החלת סביבת אינרטי והוספת חומרים כימיים באמצעות מזרק מהפתרון ונדיום לזה של ליגנד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את תערובת התגובה בטמפרטורת חדר במשך 15 דקות ולהסיר את נדיפים תחת ואקום, ואם יש חשש של מוצרים יציבים, לבצע זיקוק סוג Schlenk של נדיפים תחת אווירת אינרטי; להשתמש זרימת גז אינרטי לצרף הזכוכית הנדרשת שpredried . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת הקסאן הקר ולהסיר אותו תחת ואקום. יש לקבל אבקה סגולה כהה בתשואה כמוני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוקל 8 מ&quot;ג של המתחם שהושג בבקבוקון Eppendorf. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת Ti (IV) מורכב (איור 2); 28 </sעד&gt; התנהלות הצעדים 3.1-3.3 בתא הכפפות, אם כפפת תיבה אינה זמינה, להתאים את הצעדים חלופיים שנדונו לאנלוגי ונדיום (שלב 2) שמעסיקים קו Schlenk במקום. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים 0.35 מילימול של L יגנד H 2 בTHF היבש ולהוסיף אותו לפתרון ערבוב של כמויות שווה ערך של טי (O i Pr) 4 בTHF. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את תערובת התגובה בטמפרטורת חדר למשך 2 שעות. הסר את נדיפים תחת ואקום כדי לתת מוצר צהוב בתשואה כמוני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוקל 8 מ&quot;ג של המתחם שהושג בבקבוקון Eppendorf. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת HT-29 תאי צלחת 96 היטב <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות HT-29 תאים בבקבוק 2 75 סנטימטר עם מדיום RPMI-1640 המכיל פניצילין / אנטיביוטיקה 1% סטרפטומיצין, 1% L-גלוטמין, ו10% בסרום שור העובר (FBS), על 37 ° C עם 5% CO 2 . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המדיום כאשר HT-29 התאים מגיעים confluency המקסימאלי (90-100%, כל 3-4 ימים ללא תת). לשטוף עם 1 מיליליטרפתרון של טריפסין (0.25%) / EDTA (0.05%) ולהסיר אותו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מיליליטר של טריפסין (0.25%) פתרון / EDTA (0.05%) ו דגירה במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתק את HT-29 התאים מהבקבוק ולהוסיף 10 מיליליטר של המדיום כדי להשבית את פעילות טריפסין. להעביר 5 מיליליטר של תערובת התאים לצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש פיפטה להעביר כמה טיפות של תערובת התאים לתוך תא דלפק. קאמרי הדלפק כולל 5 x 5 ריבועים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת התאים ב5 ריבועי נציג באמצעות מיקרוסקופ: 4 ריבועים בפינות והאחד שהוא באמצע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את הסכום המשוער של תאים קיימים. סיכום התאים ב5 ריבועי הנציג ולחלק ידי 20. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחלקים 0.6 ידי התוצאה של צעד 4.7. המספר שקיבל הוא כמות תערובת תא הנדרשת לכל צלחת. חישוב זה מתייחס לצלחת המכילה 0.6 x 10 6 תאים (9,000 תאים לכל היטב). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש פיפטה להעביר את כמות התערובת הדרושה לכל תא p(200 μl לכל טוב × 66 בארות) באיחור (כפי שמחושב בסעיף 4.8) ולהוסיף 13.2 מיליליטר של המדיום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיף את התערובת לצלחת 96 היטב על ידי פיפטה 11 ערוצים (200 μl לכל טוב, 6 קווים, 66 בארות בסך הכל). גם אחד של כל שורה צריך להישאר ריקים לבקרה ריקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה את הצלחת ב 37 ° C עם 5% CO 2 למשך 24 שעות כדי לאפשר לתאים לצרף לצלחת. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החדרת התרכובות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 200 μl (או כמות שונה בהתאם לטווח הריכוז הרצוי) של THF היבש עד 8 מ&quot;ג של כל מתחם שקל כפי שמתואר בשלב 1.4 (או 2.6) או 3.3. שוקל 8 מ&quot;ג L יגנד H 2, יותר מדי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל כל פתרון מתחם נוסף על ידי הוספת 60 μl של THF ב9 מבחנות אפנדורף שונות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר עם טפטפת 60 μl מהתערובת בסעיף 5.1 לבקבוקון אפנדורף הראשון, resuspend והעברת 60 μl לבקבוקון הבא, וכן הלאה עד 10 ריכוזים שונים הם obtained (כולל תערובת ההורה בסעיף 5.1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל 20 μl של כל ריכוז בTHF עם 180 μl של מדיום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון שליטה עם THF בלבד; 20 μl של THF עם 180 μl של מדיום בכל מדידה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 μl מהפתרון שהתקבל (כולל שליטת THF), לכל טוב שכבר מכיל 200 μl של הפתרון הנ&quot;ל של תאים במדיום לתת ריכוזים סופיים של המתחם של עד 200 מ&quot;ג / ליטר (יכול טווח הריכוז להיות שונה בהתאם לפעילות במתחם). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אתה יכול לראות כמה משקעים בריכוז הגבוה ביותר מיושם בהתאם למסיסות המתחם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על כל מדידה של 3x המתחם (3 קווים בצלחת של אותו מתחם); כל שורה מכילה: תאים שטופלו במתחם ב10 ריכוזים שונים, 1 תאים המכילים גם טופלו בממס רק לבקרה ול1 גם ללא תאים לריקים שליטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה את הצלחת העמוסה במשך 3 ימים על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2 אווירה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדידת cytotoxicity באמצעות assay MTT <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את פתרון MTT על ידי הוספת 1 גרם של אבקת MTT לפתרון 200 מיליליטר של מדיום RPMI-1640 ללא פנול אדום. פתרון המניות יכול להיות מחולק ל15 צינורות מיליליטר ומאוחסן -20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 20 μl של פתרון MTT לכל פיפטה 11 ערוצית באמצעות היטב (פרט לבארות שליטה הריקה ללא תאים מצעד 4.10), ו דגירה את הצלחת למשך 3 שעות נוספות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הפתרון הבינוני מכל טוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 200 μl של isopropanol היטב כל אחד לפזר formazan. מערבבים את הצלחת ל0.5 שעה עד שיגיע homogeneousness. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את הספיגה ב 550 ננומטר ל200 μl של הפתרון האמור על ידי ספקטרופוטומטר microplate קורא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על כל מדידה (הכולל 3 חזרות, ראה שלב 5.8) ב -3 ימים שונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב tהוא אחוז של כדאיות תא על ידי ניכוי הערך ספיגת שליטה הריקה מהערך הנמדד, חלוקת התוצאה על ידי הספיגה של ערך שליטת ממס THF והכפלה ב100%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב IC 50 ערכים באמצעות תוכנת GraphPad פריזמה (או שווה ערך). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> IC דיווח 50 הוא הממוצע של כל IC 50 הערכים שנאספו על לפחות שלושה ימים שונים, ואת ערך השגיאה הוא סטיית התקן. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Niles, A. L., Moravec, R. A., Riss, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Update+on+in+vitro+cytotoxicity+assays+for+drug+development%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+on+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Update on in vitro cytotoxicity assays for drug development.</a> Expert Opinion on Drug Discovery. 3, 655-669 (2008).</li>
<li>Hatok, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+assays+for+the+evaluation+of+drug+resistance+in+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">In vitro assays for the evaluation of drug resistance in tumor cells.</a> Clinical and Experimental Medicine. 9, 1-7 (2009).</li>
<li>Wang, D., Lippard, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+processing+of+platinum+anticancer+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Cellular processing of platinum anticancer drugs.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 4, 307-320 (2005).</li>
<li>Muggia, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platinum+compounds+30+years+after+the+introduction+of+cisplatin%3A+Implications+for+the+treatment+of+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Gynecologic+Oncology%22%5BJournal%5D)">Platinum compounds 30 years after the introduction of cisplatin: Implications for the treatment of ovarian cancer.</a> Gynecologic Oncology. 112, 275-281 (2009).</li>
<li>Bruijnincx, P. C., Sadler, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+trends+for+metal+complexes+with+anticancer+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">New trends for metal complexes with anticancer activity.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 12, 197-206 (2008).</li>
<li>Ott, I., Gust, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non+platinum+metal+complexes+as+anti-cancer+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Archiv+der+Pharmazie+%28Weinheim%22%5BJournal%5D)">Non platinum metal complexes as anti-cancer drugs.</a> Archiv der Pharmazie (Weinheim. 340, 117-126 (2007).</li>
<li>Desoize, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metals+and+metal+compounds+in+cancer+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Anticancer+Research%22%5BJournal%5D)">Metals and metal compounds in cancer treatment.</a> Anticancer Research. 24, 1529-1544 (2004).</li>
<li>Jakupec, M. A., Galanski, M., Arion, V. B., Hartinger, C. G., Keppler, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antitumour+metal+compounds%3A+more+than+theme+and+variations%5BTitle%5D)+AND+%22Dalton+Transactions%22%5BJournal%5D)">Antitumour metal compounds: more than theme and variations.</a> Dalton Transactions. , 183-194 (2008).</li>
<li>Meléndez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Titanium+complexes+in+cancer+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Oncology%2FHematology%22%5BJournal%5D)">Titanium complexes in cancer treatment.</a> Critical Reviews in Oncology/Hematology. 42, 309-315 (2002).</li>
<li>Evangelou, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vanadium+in+cancer+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Oncology%2FHematology%22%5BJournal%5D)">Vanadium in cancer treatment.</a> Critical Reviews in Oncology/Hematology. 42, 249-265 (2002).</li>
<li>Djordjevic, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antitumor+activity+of+vanadium+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Metal+ions+in+biological+systems%22%5BJournal%5D)">Antitumor activity of vanadium compounds.</a> Metal ions in biological systems. 31, 595-616 (1995).</li>
<li>Caruso, F., Rossi, M., Pettinari, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anticancer+titanium+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+on+Therapeutic+Patents%22%5BJournal%5D)">Anticancer titanium agents.</a> Expert Opinion on Therapeutic Patents. 11, 969-979 (2001).</li>
<li>Caruso, F., Rossi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antitumor+titanium+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Mini-Review+in+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Antitumor titanium compounds.</a> Mini-Review in Medicinal Chemistry. 4, 49-60 (2004).</li>
<li>Kostova, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Titanium+and+vanadium+complexes+as+anticancer+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Anti-Cancer+Agents+in+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Titanium and vanadium complexes as anticancer agents.</a> Anti-Cancer Agents in Medicinal Chemistry. 9, 827-842 (2009).</li>
<li>Tshuva, E. Y., Ashenhurst, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytotoxic+Titanium%28IV%29+Complexes%3A+Renaissance%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Inorganic+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Cytotoxic Titanium(IV) Complexes: Renaissance.</a> European Journal of Inorganic Chemistry. , 2203-2218 (2009).</li>
<li>Buettner, K. M., Valentine, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioinorganic+Chemistry+of+Titanium%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Bioinorganic Chemistry of Titanium.</a> Chemical Reviews. 112, 1863-1881 (2012).</li>
<li>Meker, S., Margulis-Goshen, K., Weiss, E., Magdassi, S., Tshuva, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+antitumor+activity+of+highly+resistant+salan-titanium%28IV%29+complexes+in+nanoparticles%3A+an+identified+active+species%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition+in+English%22%5BJournal%5D)">High antitumor activity of highly resistant salan-titanium(IV) complexes in nanoparticles: an identified active species.</a> Angewandte Chemie International Edition in English. 51, 10515-10517 (2012).</li>
<li>Reytman, L., Braitbard, O., Tshuva, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+cytotoxic+vanadium%28V%29+complexes+of+salan+ligands%3B+insights+on+the+role+of+hydrolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Dalton+Transactions%22%5BJournal%5D)">Highly cytotoxic vanadium(V) complexes of salan ligands; insights on the role of hydrolysis.</a> Dalton Transactions. 41, 5241-5247 (2012).</li>
<li>Tzubery, A., Tshuva, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytotoxicity+and+Hydrolysis+of+trans-Ti%28IV%29+Complexes+of+Salen+Ligands%3A+Structure-Activity+Relationship+Studies%5BTitle%5D)+AND+%22Inorganic+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Cytotoxicity and Hydrolysis of trans-Ti(IV) Complexes of Salen Ligands: Structure-Activity Relationship Studies.</a> Inorganic Chemistry. 51, 1796-1804 (2012).</li>
<li>Tshuva, E. Y., Peri, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modern+cytotoxic+titanium%28IV%29+complexes%3B+Insights+on+the+enigmatic+involvement+of+hydrolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Coordination+Chemistry+Reviews%22%5BJournal%5D)">Modern cytotoxic titanium(IV) complexes; Insights on the enigmatic involvement of hydrolysis.</a> Coordination Chemistry Reviews. 253, 2098-2115 (2009).</li>
<li>Shavit, M., Peri, D., Manna, C. M., Alexander, J. S., Tshuva, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+cytotoxic+reagents+based+on+non-metallocene+non-diketonato+well-defined+C-2-symmetrical+titanium+complexes+of+tetradentate+bis%28phenolato%29+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Active cytotoxic reagents based on non-metallocene non-diketonato well-defined C-2-symmetrical titanium complexes of tetradentate bis(phenolato) ligands.</a> Journal of the American Chemical Society. 129, 12098-12099 (2007).</li>
<li>Mosmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Colorimetric+Assay+for+Cellular+Growth+and+Survival+-+Application+to+Proliferation+and+Cyto-Toxicity+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid Colorimetric Assay for Cellular Growth and Survival - Application to Proliferation and Cyto-Toxicity Assays.</a> Journal of Immunological Methods. 65 (83), 55-63 (1983).</li>
<li>Ahmadian, S., Barar, J., Saei, A. A., Fakhree, M. A. A., Omidi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+Toxicity+of+Nanogenomedicine+in+MCF-7+Cell+Line%3A+MTT+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Cellular Toxicity of Nanogenomedicine in MCF-7 Cell Line: MTT assay.</a> Journal of Visualized Experiments. (26), e1191(2009).</li>
<li>Gonzalez, R. J., Tarloff, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+hepatic+subcellular+fractions+for+Alamar+blue+and+MTT+reductase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+in+Vitro%22%5BJournal%5D)">Evaluation of hepatic subcellular fractions for Alamar blue and MTT reductase activity.</a> Toxicology in Vitro. 15, 257-259 (2001).</li>
<li>Denizot, F., Lang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Colorimetric+Assay+for+Cell-Growth+and+Survival+-+Modifications+to+the+Tetrazolium+Dye+Procedure+Giving+Improved+Sensitivity+and+Reliability%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid Colorimetric Assay for Cell-Growth and Survival - Modifications to the Tetrazolium Dye Procedure Giving Improved Sensitivity and Reliability.</a> Journal of Immunological Methods. 89, 271-277 (1986).</li>
<li>Alley, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feasibility+of+drug+screening+with+panels+of+human+tumor+cell+lines+using+a+microculture+tetrazolium+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Feasibility of drug screening with panels of human tumor cell lines using a microculture tetrazolium assay.</a> Cancer Research. 48, 589-601 (1988).</li>
<li>Weyermann, J., Lochmann, D., Zimmer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+note+on+the+use+of+cytotoxicity+assays%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">A practical note on the use of cytotoxicity assays.</a> International Journal of Pharmaceutics. 288, 369-376 (2005).</li>
<li>Chmura, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Group+4+complexes+with+aminebisphenolate+ligands+and+their+application+for+the+ring+opening+polymerization+of+cyclic+esters%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Group 4 complexes with aminebisphenolate ligands and their application for the ring opening polymerization of cyclic esters.</a> Macromolecules. 39, 7250-7257 (2006).</li>
<li>Sebaugh, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+accurate+EC50%2FIC50+estimation%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutical+Statistics%22%5BJournal%5D)">Guidelines for accurate EC50/IC50 estimation.</a> Pharmaceutical Statistics. 10, 128-134 (2011).</li>
<li>Yung, W. K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+Chemosensitivity+Testing+and+its+Clinical-Application+in+Human+Gliomas%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosurgical+Review%22%5BJournal%5D)">In vitro Chemosensitivity Testing and its Clinical-Application in Human Gliomas.</a> Neurosurgical Review. 12, 197-203 (1989).</li>
<li>McCarthy, N. J., Evan, G. I. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMcCarthy%2C+NJ+%22Current+Topics+in+Developmental+Biology%22">Current Topics in Developmental Biology</a>. 36, 259-278 (1997).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

השיטה המתוארת בכתב היד הזה משלבת סינתזה כימית עם assay כדאיות תא ביולוגי. כמו בכל שיטות ביולוגיות הנוגעות לתאי קיימא, הוא חיוני לעבודה בברדס למינרית, ולשמור על תנאים סטריליים, כוללים השימוש בממסים אורגניים סטרילי. כמו כן, הכנה ואחסון של תרופות על בסיס לא יציבה hydrolytically מתכת צריכה להתבצע בתנאי אינרטי, שעבורו צריכה להיות מנוצלים טכניקות תא הכפפות או קו Schlenk. הבחירה של הטכניקה לעבוד תחת סביבת אינרטי היא בעי...

כימותרפיה היא עדיין אחד הקורסים העיקריים של טיפולים המועסקים במרפאת למחלות סרטן שונות, ובכך כמות עצומה של מחקר שנערכה ברחבי העולם במטרה לפתח תרופות נגד סרטן חדשים ומשופרות. מחקרים כאלה בעיקר להתחיל ברמה הכימית, עם העיצוב והכנה של תרכובות, ואחריו הערכה ביולוגית של התכונות ציטוטוקסיות במבחנה. כדאיות תא עשויות להיות מוערכות על ידי מבחני שונים המספקים מידע על פעילות תאית 1-2. ציספלטין הוא דוגמא מורכבת פלטינה כי נעשה שימוש נרחב כתרופה כימותרפית, הנחשבת לטיפול יעיל בעיקר לסרטן אשכים ושחל 3-4. עם זאת, הטווח שלה צר פעילות ותופעות לוואי חמור לעורר מחקרים של קומפלקסי מתכות מעבר חזק אחרים 5-8. בין יתר, טיטניום (IV) ונדיום מתחמים (V) הראו תוצאות מבטיחות של פעילות גבוהה והקטינורעילות 9-16. טי (IV) מתחמים היו הראשונים להיכנס לניסויים קליניים לאחר ציספלטין בשל מאפיינים אלה, עם זאת, הם נכשלו בניסויים בשל קשיי ניסוח וחוסר יציבות hydrolytic. יש אפוא צורך הנוכחי לפתח נגזרים משופרים של מתחמי מתכת אלה שעשויים לשלב פעילות אנטי סרטנית גבוהה עם עמידות למים 15,17-21. אתגר בהכנה של טי (IV) ו-V (V) מתחמים מתייחס לחוסר יציבות hydrolytic של ריאגנטים המבשר, ולכן, יש לשמור אווירת אינרטי. ההכנה של טי (IV) ו-V (V) תרכובות מתבצעת בתנאי N 2 או אר בתא הכפפות או תוך שימוש בטכניקות שורת Schlenk. שיטה נפוצה אחת לצורך ההערכה של הפעילות אנטי סרטנית מבוססת על MTT (3 - (4,5-dimethylthiazolyl) רומיד -2,5-diphenyltetrazolium) assay. assay זה assay כדאיות colorimetric שהוצג ב1983 על ידי Mosmann22. הוא מאוד נחקר היטב ומאופיין, והיא נחשבת יעילה ביותר כאשר אנו מעריכים את האפקטיביות של תרכובות ציטוטוקסיות חדשות בשל הדיוק שלו, מהירות, ויכולתה להיות מיושמת במגוון רחב של שורות תאים. assay כדאיות זה מבוסס על שינוי הצבע של מולקולת MTT כאשר הוא נחשף לתאי קיימא. מדידה של הספיגה, שהוא פרופורציונאלי למספר תאי קיימא, והשוואה לקבוצת ביקורת שלא טופלה, מאפשרת הערכה של יכולות עיכוב צמיחת תאים של המתחם שנבדק. Assay colorimetric MTT מתנהל במתכונת צלחת 96 היטב 23. התאים עשויים לדרוש preincubation בבארות לפני התוספת של התרופה הנבדקת. הפעמים preincubation עשויות להשתנות 0-24 שעה בהתאם למאפייני הקו הסלולרי. תאים בדרך כלל נחשפו לתרופה ל24-96 שעות בהתאם לפעילות התרופה. פתרון MTT הוא הוסיף אז לתאים שטופלו, שבו לצעוקow MTT מצטמצם formazan הסגול על ידי מגוון של אנזימים של המיטוכונדריה וcytosolic כי הם מבצעיים בתאי קיימא (איור 1) 24. מולקולת MTT לא מצטמצמת על ידי תאים מתים או תאי דם אדומים (מטבולית תאים לא פעילים), תאי טחול (תאי מנוחה) ולימפוציטים מגורה concanavalin (תאים הופעלו) 22. אחרי 3-4 שעות של דגירה עם MTT משקעים formazan. היווצרות formazan מתחילה אחרי 0.5 שעות של דגירה, אבל עבור תוצאות אופטימליות עדיף לחשוף את התאים לMTT לפחות 3 שעות 22. כתוצאה מכך, הגידול הבינוני מוסר וformazan הוא מומס בממס אורגני, רצוי isopropanol 25, למרות DMSO יכול לשמש גם 26. חיסולו של המדיום הוא חיוני להשגת תוצאות מדויקות מאז פנול אדום, שהוא נפוץ באופן נרחב במדיום גידול, והאצת חלבונים יכולים להפריע למדידת ספיגת 25. כאשר הפורםפתרון זאן מגיע הומוגנית, הספיגה של הפתרון נמדדת באמצעות ספקטרופוטומטר microplate קורא. הספיגה ב 550 ננומטר עומד ביחס ישר למספר התאים בטווח של 200-50,000 תאים לכל טוב, ולכן ניתן לאתרם כמויות קטנות מאוד של תאים 22. הספיגה מציינת את כמות תאי קיימא שנותרה לאחר טיפול בתרופה, והוא לעומת הספיגה של תאי בקרה שלא נחשפו לתרופה. ניתוח התוצאות על ידי תוכנה מתאימה מספק (ריכוז עיכוב; 50%) IC 50 ערכים והשגיאות הסטטיסטיות שלהם מבוססים על מספר חזרות של המדידה. Assay MTT הוא נפוץ באופן נרחב במחקרי cytotoxicity להקרנת תרכובות אנטי סרטניות חדשות, בשל דיוקה ופשטות יחסית. עם זאת, בעת שימוש assay MTT, אשר היה תלוי בתגובה האנזימטית, יש לקחת בחשבון כי מעכבי אנזים שונים יכולים להשפיע על ההפחתה של MTTd להוביל לתוצאות שגויות 27. בנוסף, assay MTT אינו מספק כל מידע על המנגנון המולקולרי של הפעילות ציטוטוקסית של התרופה 2.

<table><tbody><tr><td colspan="4" ><חזק>ריאגנט/חומר</חזק></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי (FBS)</td><td>תעשיות ביולוגיות</td><td>04-007-1A</td><td></td></tr><tr><td>הקסאן AR</td><td>גדות</td><td>830122313</td><td>מיובש באמצעות מערכת ייבוש ממס</td></tr><tr><td>HT-29 קו תאים</td><td>ATCC</td><td>HTB-38</td><td></td></tr><tr><td>איזופרופנול AR</td><td>גדות</td><td>830111370</td><td></td></tr><tr><td>L-גלוטמין</td><td>תעשיות ביולוגיות</td><td>03-020-1B</td><td></td></tr><tr><td>MTT</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>M5655-1G</td><td></td></tr><tr><td>אנטיביוטיקה פניצילין/סטרפטומיצין</td><td>תעשיות ביולוגיות</td><td>03-031-1B</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 עם פנול אדום עם L-גלוטמין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>R8758</td><td></td></tr><tr><td>RPMI ללא פנול אדום</td><td>תעשיות ביולוגיות</td><td>01-103-1A</td><td></td></tr><tr><td>Tetrahydrofuran (THF) AR</td><td>Gadot</td><td>830156391</td><td>מיובש באמצעות מערכת ייבוש ממס</td></tr><tr><td>Ti(OiPr)4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>205273-500ML</td><td>רגיש ללחות</td></tr><tr><td>Trypsin/EDTA</td><td>Biological Industries</td><td>03-052-1B</td><td></td></tr><tr><td>VO(OiPr)3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>404926-10G</td><td>לחות רגיש<</td></tr><tr>td colspan="4" ><חזק>ציוד</חזק></td></tr><tr><td>פיפטה 12 ערוצים 30-300 &mu; l</td><td>פיפטה תרמו סיינטיפיק</td><td></td><td></td></tr><tr><td>12 ערוצים 5-50 &mu; l</td><td>Finnpipette</td><td></td><td></td></tr><tr><td>75 ס"מ2 בקבוק</td><td>NUNC</td><td>156472</td><td></td></tr><tr><td>צלחת 96 בארות עם מכסה (תחתית שטוחה)</td> <td>NUNC</td><td>167008</td><td></td></tr><tr><td>CO2 קלסר חממה</td><td></td><td>APT.line C150</td><td></td></tr><tr><td>תא דלפק</td><td>Marienfeld-Superior</td><td>650030</td><td></td></tr><tr><td>בקבוקון אפנדורף</td><td>KARTELL</td><td></td><td></td></tr><tr><td>תא כפפות</td><td>M. Braun</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מכסה מנוע זרימה למינארי</td><td>ADS LAMINAIRE</td><td>OPTIMALE 12</td><td></td></tr><tr><td>ספקטרופוטומטר קורא מיקרופלייט</td><td>Bio-Tek</td><td>El-800</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ</td><td>Nikon</td><td>Eclipse TS100</td><td></td></tr><tr><td>פיפטה 20-200 &mu; l</td><td>פיפטה פיפטה</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5-50 &mu; l</td><td>פינפיפטה</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

מכלולים נגד סרטן מתכת: סינתזה וcytotoxicity הערכה על ידי assay mtt

Anticancer Metal Complexes: Synthesis and Cytotoxicity Evaluation by the MTT Assay

מתחמי טיטניום (IV) ונדיום (V) הם סוכנים אנטי סרטני חזקים מאוד. אתגר בסינתזה שלהם מתייחס לחוסר יציבות hydrolytic, ולכן ההכנה שלהם צריכה להתנהל תחת אווירת אינרטי. הערכה של הפעילות אנטי סרטנית של מתחמים אלה יכול להיות מושגת על ידי assay MTT. Assay MTT הוא assay כדאיות colorimetric מבוסס על הפחתה האנזימטית של מולקולת MTT לformazan כאשר הוא נחשף לתאי קיימא. התוצאה של הירידה היא שינוי צבע של מולקולת MTT. מדידות ספיגת יחסית לשליטה לקבוע את אחוז שנותר תאים סרטניים קיימא לאחר הטיפול שלהם בריכוזים שונים של מתחם שנבדק, אשר תורגם לפעילות אנטי סרטנית המתחם וIC 50 ערכיה. Assay MTT הוא נפוץ באופן נרחב במחקרי cytotoxicity בשל הדיוק שלו, מהירות ופשטות היחסית. במסמך זה אנו מראשנשלח פרוטוקול מפורט לסינתזה של תרופות המבוססות על אוויר מתכת רגישה ומדידות כדאיות תא, כולל הכנה של צלחות התא, דגירה של התרכובות עם התאים, מדידות כדאיות באמצעות assay MTT, והנחישות של IC 50 ערכים.

מתחמים הוכנו על בסיס נהלים שנקבעו 18,28 וטוהר שלהם עשוי להיות מוערך על ידי ניתוח NMR ויסודות. הנתונים שהתקבלו מassay MTT מנותח להעריך cytotoxicity של המתחם 18,21. ראשית, חיסור של הערך ספיגת שליטה הריקה מכל הערכים האחרים מתבצע. שנית, ערך שליטת ממס THF מוגדר כדאיות 100%, כפי שאין צמיחת עיכוב מתחם נוספת. כל הערכים האחרים הופכים אחוז הכדאיות בהתאם לשליטה. הריכוזים שיושמו ואחוז הכדאיות היחסי מחוש...

שיטה לסינתזה של סוכני טיטניום ונדיום נגד סרטן אוויר רגיש מתוארת, יחד עם ההערכה של הפעילות ציטוטוקסיות כלפי שורת תאי הסרטן אנושית על ידי assay MTT.

מכלולים נגד סרטן מתכת: סינתזה וCytotoxicity הערכה על ידי assay MTT

Titanium (IV) and vanadium (V) complexes are highly potent anticancer agents. A challenge in their synthesis refers to their hydrolytic instability; ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להכין תרופות מתכתיות נגד סרטן ולהעריך את הרעילות התאית שלהן באמצעות בדיקת MTT. דבר זה מושג תחילה על ידי סינתזה של תרכובות נגד סרטן מבוססות מתכת. השלב השני הוא הכנת פלטות של 96 בארות עם תאי סרטן.בשלב הבא, התרכובות נוגדות הסרטן מבוססות המתכת מוחדרות לתאי הסרטן. השלב הסופי הוא מדידת חיוניות התאים באמצעות בדיקת MTT, שבה נמדדת רדוקציה של MTT על ידי אנזימים מיטוכונדריאליים וציטוזוליים ליצירת פורמזאן, כדי לקבוע בסופו של דבר את הפעילות נוגדת הסרטן ואת ערכי ה-IC50 (ריכוז העכבה החציוני המקסימלי) של התרכובות.בדרך כלל, אנשים שאינם מכירים את השיטה עשויים להתקשות בביצועה, כיוון שמדובר בהליך רב-שלבי הדורש את מלוא תשומת לבו של עובד המעבדה ומתבצע על פי לוחות זמנים קשיחים. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, שכן הכנת לוחית התאים אינה פשוטה, מכיוון שעבודה עם תאים חיוניים דורשת מעקב אחר הנחיות ספציפיות. בתוך תא כפפות (glove box), הכין את קומפלקס הוונדיום חמיס על ידי המסה של 0.42 millimole של חומר המוצא של הליגנד ב-THF יבש.לאחר מכן, הוסף זאת לתמיסה תחת ערבוב של כמויות שוות של vanadium oxytris(isopropoxide) ב-THF. ערבב את תערובת התגובה בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות לפני הסרת הרכיבים הנדיפים תחת ואקום. לאחר מכן, הוסף הקסאן קר והסרו אותו תחת ואקום.יש לקבל אבקה סגולה כהה בתהלי

anticancer-metal-complexes-synthesis-cytotoxicity-evaluation-mtt

Research

JoVE Journal

Chemistry

כימיה

Assay MTT היא assay colorimetric קל לשעתקו להערכת כדאיות התא המבוסס על הפחתה של MTT צהוב וייצור של formazan מסיס במים סגול. כאן, לקיומה של MCF-7 תאים על הטיפול nanogenomedicine הוערך.

רעילות נייד של Nanogenomedicine בקו MCF-7 נייד: assay MTT

סרטון זה מתאר את הבדיקה הקולרימטרית, בדיקת מתיל תיאזול טטרזוליום (MTT), כדי למדוד ציטוטוקסיות הנגרמת על ידי תרופות בתאים סרטניים ולקבוע את הפעילות המטבולית שלהם. בדיקה זו מבוססת על המרה מטבולית של מלחי טטרזוליום למוצרים צבעוניים, המשקפים את הפעילות המיטוכונדריאלית של תאים.

מתיל תיאזוליל טטרזוליום או בדיקת MTT: בדיקה קולורימטרית למדידת עמידות לתרופות באמצעות קביעת פעילות מטבולית בתאים סרטניים

כאן, ניטור בזמן אמת של חילוף החומרים של תאי הגידול, בשילוב עם מודל ממברנה כוריו-אלנטואית של עובר עוף (CAM) של גרורות, משמשים להערכת מטרות/סוכנים אנטי-סרטניים חדשים על יכולתם לעורר רגישות לתאי גידול לכימותרפיה הפוגעת ב-DNA.

הערכת היעילות של תרופות למלחמה בסרטן רגישות<em&gt; במבחנה</em&gt; ו<em&gt; In vivo</em

פרוטוקול זה מתאר כיצד להעריך הסינרגטיות בין נוגדן נגד סרטן תרופות antineoplastic במודלים פרה באמצעות המשוואה אינדקס שילוב של צ'או, Talalay.

Potentiation של נוגדנים נגד סרטן יעילות על-ידי סמים Antineoplastic: זיהוי של נוגדן תרופתיים הסינרגטיות באמצעות המשוואה אינדקס שילוב

הפרוטוקול מתאר תפוקה מהירה, גבוהה, אמינה, זולה, ובלתי משוחדת, לקביעת יעילות של הכדאיות הסלולרית. תסה זו שימושית במיוחד כאשר המיטוכונדריה של התאים נפגעה, מה שמפריע לאסות אחרות. ההסתה משתמשת בספירה אוטומטית של תאים המוכתמים בשני צבעים גרעיניים – Hoechst 33342 ו-propidium iodide.

תסיסה אוטומטית של כתמים גרעיניים דיפרנציאליים לקביעה מדויקת של ציטוקוקסיות מיטוקאן

מתודולוגיה זו שואפת להעריך ציטוטוקסיות של חומרים ביולוגיים באמצעות הכנת תמציות מסיסות, תוך שימוש במבחני כדאיות וניתוח פנוטיפי, כולל ציטומטריית זרימה, RT-PCR, אימונוציטוכימיה וטכניקות ביולוגיה תאית ומולקולרית אחרות.

גישה לציטוטוקסיות ולתגובת התא לביו-חומרים

כאן אנו מתארים בדיקה ביולוגית באמצעות 3-(4′,5′-דימתילתיאזול-2′-yl)-2,5- דיפנילטטרזוליום ברומיד (MTT) כדי לבחון אוקסימים ספירוציקליים שסונתזו בעבר.

סינתזה הטרוציקלית ספירוציקלית פונקציונלית ובדיקת ציטוטוקסיות

פרוטוקול זה מציג טכניקה אוטומטית, מבוססת תמונה, בעלת תפוקה גבוהה לזיהוי תרכובות המווסתות הרג תאי סרטן שד בתיווך תאי הרג טבעיים בנוכחות נוגדן אנטי-HER-2 טיפולי.

בדיקת סינון תוכן גבוהה לזיהוי תרכובות ציטוטוקסיות תאיות תלויות נוגדנים

המיקוד הפרמקולוגי של תעלות יונים הוא גישה מבטיחה לטיפול בגידולים מוצקים. פרוטוקולים מפורטים ניתנים לאפיון תפקוד תעלות היונים בתאים סרטניים ולהערכת ההשפעות של אפנון תעלות יונים על כדאיות הסרטן.

בדיקת תעלות יונים בתאים סרטניים

במאמר זה אנו מציגים שיטה לזיהוי תרכובות המווסתות את מנגנון ADCC, מנגנון חשוב להרג תאים סרטניים של נוגדנים אנטי-סרטניים. ההשפעה ציטוטוקסית של תאי NK נמדדת בספרואידים של תאי סרטן השד בנוכחות Trastuzumab. ניתוח תמונה מזהה רוצחים חיים ומתים ותאי מטרה בספרואידים.

כימות ציטוטוקסיות תאית תלוית נוגדנים במודל ספרואידי גידול: יישום לגילוי תרופות

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבדיקת ציטוטוקסיות תלויה בנוגדנים, בתיווך תאים (ADCC) באמצעות ערכת בדיקה ביולוגית של ADCC. שיטה זו מציעה כלי רב ערך להבהרת מנגנון ה-ADCC ולהערכת הפוטנציאל הטיפולי של נוגדנים באימונותרפיה של סרטן.

הערכת ציטוטוקסיות תלויה בנוגדנים, בתיווך תאים בתאי סרטן באמצעות מבחן ביולוגי של מדווח ציטוטוקסיות בתיווך תאים תלויי נוגדנים

למד סינתזה של תרכובות אנטי-סרטן מבוססות טיטניום וונדיום ואת הערכת הרעילות התאית שלהן באמצעות מבחן MTT. שיטה זו מאפשרת לקבוע ערכי IC50 ולהעריך יעילות תרופות מתכתיות.

מכלולים נגד סרטן מתכת: סינתזה וCytotoxicity הערכה על ידי assay MTT

גלה סרטונים נוספים