מכלולים נגד סרטן מתכת: סינתזה וCytotoxicity הערכה על ידי assay MTT

המטרה הכוללת של הליך זה היא להכין תרופות מטאלו אנטי סרטניות ולהעריך את הציטוטוקסיות שלהן על ידי בדיקת MTT. זה מושג על ידי סינתזה ראשונה של תרכובות אנטי-סרטניות מבוססות מתכת. השלב השני הוא הכנת 96 צלחות באר של תאים סרטניים.

לאחר מכן, התרכובות האנטי-סרטניות מבוססות המתכת מוחדרות לתאי הסרטן. השלב האחרון הוא למדוד את כדאיות התא על ידי בדיקת MTT, כאשר הפחתת MTT על ידי אנזימים מיטוכונדריאלים וציטוזוליים ליצירת זן נמדדת בסופו של דבר הפעילות האנטי-סרטנית וריכוז המעכב המקסימלי במחצית. או שאני רואה 50 ערכים של התרכובות נקבעים.

בדרך כלל אנשים חדשים בשיטה זו עשויים להיאבק מכיוון שמדובר בהליך רב-שלבי הדורש את מלוא תשומת הלב של עובד המעבדה ומוצב על ציר זמן קפדני. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית מכיוון שהכנת לוחית התא אינה פשוטה מכיוון שעבודה עם תאים ברי קיימא דורשת הקפדה על הנחיות מסוימות. בעבודה בתא כפפות, הכינו את קומפלקס הונדיום חמש על ידי המסה של 0.42 מילימול של מבשר הליגנד ב-THF יבש.

לאחר מכן הוסף אותו לתמיסת ערבוב של כמויות שוות ערך של ונדיום או טריס איזופ אוקסיד ב-THF. מערבבים את תערובת התגובה בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות לפני הסרת החומרים הנדיפים בוואקום. לאחר מכן, הוסף הקסאן קר והסר אותו בוואקום.

יש להשיג אבקה סגולה כהה בתשואה כמותית. שוקלים שמונה מיליגרם מהתרכובת המתקבלת בבקבוקון אפי אורף. להכנת קומפלקס הטיטניום ארבע ממיסים 0.35 מילימול של מבשר הליגנד ב-THF יבש, ומוסיפים אותו לתמיסת ערבוב השווה לכמויות של טיטניום טטרה איזופ אוקסיד ב-THF.

מערבבים את תערובת התגובה בטמפרטורת החדר למשך שעתיים. לאחר מכן הסר את הנדיפים בוואקום כדי לתת מוצר צהוב בתשואה כמותית. שקלו שמונה מיליגרם מהתרכובת המתקבלת בבקבוקון eph להכנת תאי HT 29 בתרבית ראשונה של 96 בארות.

התאים בבקבוק של 75 סנטימטר רבוע כמתואר בפרוטוקול הטקסט, מסירים את המדיום כאשר תאי HT 29 מגיעים לשטף פעולה מקסימלי. לאחר שטיפת התאים במיליליטר אחד של תמיסת טריפסין EDTA, הוסיפו מיליליטר אחד מאותה תמיסה ודגרו למשך חמש דקות. נתק את תאי HT 29 מהבקבוק והוסף 10 מיליליטר מהמדיום כדי להשבית את פעילות הטריפסין.

העבירו חמישה מיליליטר מתערובת התאים לצינור. השתמש בפיפטה כדי להעביר כמה טיפות מתערובת התאים לתא דלפק. תא הדלפק כולל שני חלקים של חמישה על חמישה ריבועים.

ספרו את התאים בחמישה ריבועים מייצגים של כל חלק באמצעות מיקרוסקופ. ארבעה ריבועים בפינות וריבוע אחד באמצע. חשב את כמות התאים המשוערת הקיימת.

סכם את התאים בחמשת הריבועים המייצגים של כל חלק. חשב את הסכום הממוצע של שני החלקים וחלקו ב- 20. לאחר מכן, חלקו 0.6 במנה.

המספר שהתקבל הוא כמות תערובת התאים הנדרשת לצלחת. חישוב זה מתייחס לצלחת המכילה 9,000 תאים לבאר. בעזרת פיפטה, שלבו את כמות תערובת התאים הנדרשת לצלחת עם 13.2 מיליליטר מהמדיום.

מוסיפים את התערובת לצלחת של 96 באר. שימוש בפיפטה של 11 תעלות ב-200 מיקרוליטר לבאר על פני שישה קווים המכילים 66 בארות בסך הכל. מאגר אחד מכל שורה אמור להישאר ריק עבור הפקד הריק.

דגרו את הצלחת ב-37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני למשך 24 שעות כדי לאפשר לתאים להיצמד לצלחת כדי להכניס את התרכובות תחילה, הוסיפו 200 מיקרוליטר של THF יבש לשמונה מיליגרם של תרכובת המשקל. לדלל עוד יותר את תמיסת התרכובת על ידי הוספת 60 מיקרוליטר THF בתשעה קבצי עינור שונים. עבור כל תמיסה, השתמש בפיפטה כדי להעביר 60 מיקרוליטר מתמיסת התרכובת לקובץ העינור הראשון.

לאחר מכן יש להחיות ולהעביר 60 מיקרוליטר לבקבוקון הבא וכן הלאה עד לקבלת 10 ריכוזים שונים. המשך לדלל 20 מיקרוליטר מכל ריכוז ב- THF עם 180 מיקרוליטר מדיום. כמו כן, הכינו תמיסת בקרה של ממס בלבד על ידי הוספת 20 מיקרוליטר THF ל-180 מיקרוליטר מדיום.

לאחר מכן, הוסף 10 מיקרוליטר מכל תמיסה המתקבלת לכל באר. זה כבר מכיל 200 מיקרוליטר מתמיסת התאים הנ"ל במדיום כדי לתת ריכוזים סופיים של התרכובת של עד 200 מיליגרם לליטר. כל קו מכיל תאים שטופלו בתרכובת ב-10 ריכוזים שונים.

אחד, באר בקרה המכילה תאים שטופלו בממס בלבד ובאר אחת ללא תאים עבור הבקרה הריקה, הגדר את הקווים כדי לחזור על כל מדידה של התרכובת שלוש פעמים. דגרו את הצלחת העמוסה למשך שלושה ימים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באטמוספירה של 5% פחמן דו חמצני. הכן את פתרון ה-MTT כמתואר בפרוטוקול הטקסט באמצעות פיפטה של 11 ערוצים.

הוסף 20 מיקרוליטר של תמיסת MTT לכל באר למעט בארות הבקרה הריקות. דגרו את הצלחת למשך שלוש שעות נוספות לאחר הדגירה. מוציאים את התמיסה הבינונית מכל באר ומוסיפים 200 מיקרוליטר איזופרופנול לכל באר.

כדי להמיס את הפורמין, מערבבים את הצלחת למשך 30 דקות עד לקבלת תערובת אחידה. מדוד את הספיגה ב-550 ננומטר עבור 200 מיקרוליטר של התמיסה ההומוגנית על ידי קורא מיקרו-פלטות, ספקטרופוטומטר חוזר על כל מדידה בשלושה ימים שונים. לאחר מכן, חשב את אחוז כדאיות התא על ידי ניכוי ערך ספיגת הבקרה הריק מהערך הנמדד, חלוקת התוצאה בספיגת ערך בקרת הממס THF והכפלה ב-100%חשב את ערכי הריכוז המעכב החצי מקסימלי באמצעות תוכנת גרפים.

ה-IC 50 המדווח הוא הממוצע של כל ערכי ה-IC 50 שנאספו בשלושה ימים שונים לפחות, וערך השגיאה הוא סטיית התקן. הנתונים המתקבלים מבדיקת MTT מנותחים כדי להעריך את הציטוטוקסיות של התרכובת. המדידות צריכות להתבצע על טווח ריכוזים שיפיק גרף המציג התפלגות נקודה אחידה לפחות שלוש נקודות בכל רמה ושלוש נקודות להגדרת השיפוע.

מדידות לא מספקות בריכוזים גבוהים או בריכוזים נמוכים יפגעו בהתאמת הרגרסיה הלא ליניארית של העקומה הנדרשת לקביעת ערכי IC 50, וכתוצאה מכך יפחיתו את הדיוק שלהם. ערכי IC 50 יחסיים כפי שנקבעו על ידי התאמת הרגרסיה הלא ליניארית תואמים לריכוזים המובילים ל-50% מעיכוב צמיחת התא האפשרי על ידי התרכובת שנבדקה. זה מחושב כנקודת האמצע בין כדאיות התא המקסימלית והמינימלית שנמדדה, שאינן בהכרח 100% ו-0% בהתאמה.

בעת בדיקת תוצאות הניסויים המתוארים בפרוטוקול. ברור שציספלטין כמו גם קומפלקסי הטיטניום והונדיום פעילים מאוד. כמו כן, ניתן להבחין שככל שערך העיכוב המקסימלי של תרכובת נתונה קרוב יותר ל-100%, כך ערך ה-IC 50 היחסי קרוב יותר לזה המוחלט כאשר משווים את ערכי ה-IC 50 בין התרכובות השונות.

קומפלקס הטיטניום ארבע הוא בעל הציטוטוקסיות הגבוהה ביותר וערכי ה-IC 50 שלו נמוכים מאלה של ציספלטין וקומפלקס ונדיום חמש. עם זאת, הליגנד החופשי מפגין פעילות מופחתת באופן ניכר מאז הוספת הליגנד בריכוזים שונים. כדאיות התא אינה יורדת באופן משמעותי כפי שהיא יורדת עבור הקומפלקסים שלו.

זה מבטיח שהפעילות האנטי סרטנית הגבוהה של הקומפלקסים מסתמכת על מרכזי המתכת בזמן ניסיון הליך זה. חשוב לשמור על תנאים סטריליים בכל עת. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להעריך את הציטוטוקסיות של התרכובות האנטי-סרטניות שלך על ידי M-T-T-S-A.