פרוטוקול מהיר לשילוב מערכים חוץ-כרומוזומליים עם קצב העברה גבוה לגנום C. elegans

המטרה הכוללת של הליך זה היא לשלב מערכי כרומוזומים נוספים טרנסגניים בגנום serratus elegance באמצעות קרינה אולטרה סגולה. ראשית, בחר את הקו הטרנסגני עם קצב ההעברה הגבוה ביותר האפשרי, באופן אידיאלי גדול מ-80% ואז UV מקרין את ה-L הטרנסגני שנבחר ארבעה זחלים בודדים ארבעה משני בעלי החיים הטרנסגניים הפלואורסצנטיים מכל צלחת F1 שנבחרה. המסך הבא, ה-F שתי צלחות ל-100% פלואורסצנטי טרנסגני.

F שלוש תולעים. בסופו של דבר, בחירת בעל חיים פלואורסצנטי מדור F 3 יכולה להראות את התורשה של 100% של הטרנסגן. גישה ניסיונית זו מתאימה היטב לקווים טרנסגניים המעבירים מערכי כרומוזומים נוספים בקצב גבוה.

תדגים את ההליך סטפני בלמן, טכנאית מהמעבדה שלנו. התחל עם 500 צלחות פטרי גדולות המכילות גידול נמטודות. זרע בינוני כל צלחת עם 0.3 מיליליטר קולי איזיה רווי.

תרבות OP 50. הערך את קצב ההעברה של הקו הטרנסגני שישולב עבור כל קו טרנסגני. בחר 10 מבוגרים עם כבידה פלואורסצנטית על 10 לוחות תרבית נפרדים תחת תרבית סטריאוסקופ פלואורסצנטי.

בעלי החיים באינקובטור תולעים מוגדרים בטמפרטורה המאפשרת רבייה של הרקע הגנטי. עקוב אחר הצאצאים מדי יום כדי להעריך באיזה שלב התפתחותי מתבטא סמן ההזרקה המשותפת וניתן לצפות בו בצורה הטובה ביותר באמצעות אוסקופיה פלואורסצנטית. הערך את קצב ההעברה של הצאצאים על ידי קביעת אחוז הצאצאים הפלואורסצנטיים.

לאינטגרציה הטרנסגנית, בחר את הקו הטרנסגני עם קצב ההעברה הגבוה ביותר. השג אוכלוסייה של בעלי חיים טרנסגניים המסונכרנים בשלב הזחל L. לצורך אינטגרציה, בחר 30 מבוגרים GRA פלואורסצנטיים על חמש צלחות תרבית.

לאחר שהתולעים הטילו ביצים במשך שלוש עד ארבע שעות בטמפרטורה של 15 מעלות צלזיוס, בדקו אם יש לפחות 30 ביצים בצלחת ולאחר מכן הוציאו את הבוגרים מהצלחות מגדלים את בעלי החיים באינקובטור תולעים עד שהצאצאים מגיעים לשלב L 4 זחלים. הניחו כל צלחת המכילה 15 עד 20 פלואורסצנטיים טרנסגניים L ארבעה בעלי חיים בקישור UV כשהמכסים מוסרים, הקרינו את התולעים להחלמה. דגרו על התולעים המוקרנות למשך הלילה בטמפרטורה של 15 מעלות צלזיוס.

בדוק את מספר בעלי החיים שחיים בידינו. שיעור הישרדות של כ-80 עד 90% מותאם לקרינה יעילה. גדל את בעלי החיים המוקרנים בטמפרטורה של 15 עד 25 מעלות צלזיוס עד שהצאצאים הגיעו לשלב ההתפתחותי, מה שמאפשר התבוננות בביטוי סמן ההזרקה המשותפת.

העבירו בעלי חיים פלואורסצנטיים בודדים F1 ללוחות תרבית נפרדים. שמור על לוחות F1 אלה בטמפרטורה של 15 עד 25 מעלות צלזיוס עד שהצאצאים יגיעו לשלב מתאים לתצפית על שני בעלי חיים פלואורסצנטיים F בהתאם לסמן המשותף בו נעשה שימוש. במקרה הספציפי הזה, ראינו את התולעים כשבוגרים משליכים את כל לוחות F1 שמציגים צאצא אחד, ללא צאצאים, מה שמצביע על כך שהחיה F1 הייתה עקרה או מתה, או שניים לא, או רק כמה חיות F פלואורסצנטיות שמציבות לכך שהחיה F1 לא העבירה את הטרנסגן בקצב הצפוי.

בחר ארבע חיות F טרנסגניות פלואורסצנטיות מכל צלחת F1 שנבחרה. בעת שימוש בטרנסגנים פלואורסצנטיים, בחר F שתי תולעים עם רמה גבוהה של פלואורסצנטיות מכיוון שהדבר יכול להצביע על כך שבעלי חיים אלה הם הומוזיגוטיים עבור המערך המשולב. שימו לב שכאשר קוטפים F שני בעלי חיים, חשוב לא לשאת ביצים או זחלים על מנת למנוע שליליות כוזבות בשלב הבא.

לאחר גידול ה-F, שתי החיות מסננות את שתי הלוחות F עבור 100% פלואורסצנטי F שלוש תולעים טרנסגניות. המסך מהיר למדי מכיוון שנוכחותה של תולעת אחת שאינה פלואורסצנטית מצביעה על כך שיש לזרוק את הצלחת, להבחין בשמונה בעלי חיים פלואורסצנטיים F שלוש מלוחות נבחרים כדי לאשר את התורשה של 100% של הטרנסגן. במידת האפשר, שמור על מספר זנים טרנסגניים משולבים עצמאיים.

בוצעו אינטגרציות של טרנסגנים בשני קווים שונים, המשדרים מערכי כרומוזומים נוספים בערך באותה תדירות. באמצעות התקן והפרוטוקולים המשופרים, הזמן ומספר הלוחות הדרושים לכל קו משולב מותאמים בפרוטוקול המשופר. לאחר מכן, בדקנו את ההשערה שקצב העברת טרנסגנים גבוה יותר בקו לא משולב מקל על שילוב הטרנסגן בגנום.

טרנסגן מסוים אחד שולב בקווים המשדרים בקצבים שונים באמצעות הפרוטוקול המשופר לקו המשדר הגבוה ביותר. שלושה קווים משולבים נמצאו רק מ-90 בעלי חיים נבחרים F1 ואילו עבור הקו הטרנסגני המשדר ב-50 עד 60% נמצא קו משולב אחד מ-110 חיות F1 נבחרות. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות שונות על מנת לענות על שאלות נוספות כמו קביעת ביטוי גנים, דפוס וויסות, לוקליזציה של חלבונים וביטוי יתר של חלבונים, או התפתחות סמנים תת-תאיים.