Name: פרוטוקול מהיר לשילוב מערכים חוץ-כרומוזומליים עם קצב העברה גבוה לגנום C. elegans (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-09T20:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 33 s
Description: למד פרוטוקול מהיר לשילוב מערכים חוץ-כרומוזומליים בגנום Caenorhabditis elegans באמצעות קרינת UV. שיטה זו מייעלת העברת טרנסגנים בשיעור גבוה וחוסכת בחומרים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מבקשים להודות לקלייר לקרואזי וללורן סגלט על יצירת Pdyc-1::d yc-1::gfp; Pmyo-2::d sRed ו-Pmyo-3::gfp זנים טרנסגניים. אנו מודים לאנדי פייר על מתנת הפלסמיד האדום Pmyo-2::d s, ולפמלה הופה על מתנת הפלסמיד Pmyo-3::gfp. עבודה זו נוסדה על ידי המרכז הלאומי הצרפתי למחקר מדעי (CNRS) ואוניברסיטת קלוד ברנרד בליון.

1. תרבית נמטודות טרנסגניות לפני האינטגרציה
ניתן ליצור ניתן ליצור קווים טרנסגניים כמתוארב-1. קווים אלה מכילים בדרך כלל פלסמיד סמן הזרקה משותפת המוביל לביטוי של חלבון פלואורסצנטי או לפנוטיפ התנהגותי או מורפולוגי ספציפי בשלב התפתחות נתון1,3. ניתן ליישם פרוטוקול אינטגרציה זה על זנים המבטאים סמני הזרקה פלואורסצנטיים או לא פלואורסצנטיים. בדוגמה הבאה, נעשה שימוש בזן עם סמן הזרקה פלואורסצנטית.
<ol>
	<li>הכן צלחות תרבות:
		<ol>
			<li>הכינו כ -500 צלחות פטרי גדולות בגודל 60 מ"מ שנמזגו באופן אספטי עם 10 מ"ל כל אחת ממדיום גידול נמטודות (NGM)6,7.</li>
			<li>זרע כל צלחת עם 0.3 מ"ל תרבית Escherichia coli OP50 רוויה לפי הליך סטנדרטי6,7.</li>
		</ol>
	</li>
	<li>הערך את קצב ההעברה של הקו הטרנסגני שיש לשלב:
		<ol>
			<li>עבור כל קו טרנסגני, בחר עשרה בוגרים פלואורסצנטיים על עשר לוחות תרבית נפרדים תחת סטריאוסקופ פלואורסצנטי באמצעות קיסם תולעים כמתוארב-7.</li>
			<li>יש לגדל את בעלי החיים באינקובטור תולעים בטמפרטורה של 15-25 מעלות צלזיוס (תלוי ברקע הגנטי) כדי לאפשר לתולעים להתרבות.</li>
			<li>התבונן בצאצאים מדי יום כדי להעריך באיזה שלב התפתחותי מתבטא סמן ההזרקה המשותפת וניתן לצפות בו בצורה הטובה ביותר. הביטוי של רוב סמני ההזרקה המשותפת הנמצאים בשימוש כיום נצפה בשלב הזחל L4 או בבגרות.</li>
			<li>העריכו את קצב ההעברה של הצאצאים על ידי קביעת אחוז הצאצאים הפלואורסצנטיים על ידי תצפית תחת סטריאוסקופ פלואורסצנטי.</li>
		</ol>
	</li>
	<li>בחר קו טרנסגני לשילוב טרנסגנים:
		<ol>
			<li>בחר את הקו הטרנסגני עם שיעור ההדבקה הגבוה ביותר האפשרי (באופן אידיאלי ≥80%).</li>
		</ol>
	</li>
	<li>להשיג אוכלוסייה של בעלי חיים טרנסגניים המסונכרנים בשלב הזחל L4 לצורך אינטגרציה:
	<ol>
		<li>בחר 30 בוגרים פלואורסצנטיים על חמש צלחות תרבית (שש חיות בצלחת).</li>
		<li>תנו לתולעים להטיל ביצים במשך 3-4 שעות בחום של 15 מעלות צלזיוס.</li>
		<li>הסר את המבוגרים מהצלחות לאחר בדיקת נוכחות של לפחות 30 ביצים בצלחת.</li>
		<li>תרבו את בעלי החיים בחממת תולעים בטמפרטורה של 15-25 מעלות צלזיוס עד שהצאצאים מגיעים לשלב הזחל L4 (96 שעות ב-15 מעלות צלזיוס או 36 שעות ב-25 מעלות צלזיוס).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. קרינת UV והתאוששות של תולעים טרנסגניות
<ol>
	<li>הקרנת תולעים:
		<ol>
			<li>בחר 30-100 חיות L4 טרנסגניות פלואורסצנטיות על צלחות תרבית נפרדות (15-20 חיות בצלחת).</li>
			<li>מניחים את הצלחות, כשהמכסים מוסרים, בקישור צולב UV. מקרין את התולעים ב-0.012 J/cm2. שימו לב שזנים רגישים פחות או יותר ל-UV וכי התוצאות יכולות להיות משתנות בהתאם ל-UV המשמש. ניתן לבדוק טווח מינון בין 0.010-0.015 J/cm2.</li>
		</ol>
	</li>
	<li>התאוששות תולעים לאחר הקרנה:
	<ol>
		<li>הניחו צלחות עם תולעים מוקרנות למשך הלילה בטמפרטורה של 15 מעלות צלזיוס להתאוששות.</li>
		<li>בדוק את מספר החיות שנותרו בחיים. אצלנו שיעור הישרדות של כ-80-90% מותאם לקרינה יעילה.</li>
		<li>גדל את בעלי החיים המוקרנים בטמפרטורה של 15-25 מעלות צלזיוס עד שהצאצאים הגיעו לשלב ההתפתחותי המאפשר התבוננות בביטוי סמן ההזרקה, כפי שנקבע בשלב 1.2.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. בידוד של קווים טרנסגניים משולבים
<ol>
	<li>מבחר בעלי חיים F1:
		<ol>
			<li>יחיד 150-200 בעלי חיים פלואורסצנטיים F1 על צלחות תרבית נפרדות. עבור קווים משדרים מאוד (≥80%), מספיקים 100 בעלי חיים F1.</li>
			<li>שמור את לוחות F1 אלה בטמפרטורה של 15-25 מעלות צלזיוס עד שהצאצאים יגיעו לשלב מתאים לתצפית על בעלי חיים F2 פלואורסצנטיים.</li>
			<li>השליכו את כל לוחות F1 המציגים 1) 1) ללא צאצאים, מה שמצביע על כך שהחיה F1 הייתה עקרה או מתה, או 2) לא או רק מעט חיות F2 פלואורסצנטיות, מה שמצביע על כך שחיית F1 לא העבירה את הטרנסגן בקצב הצפוי. שלב זה מהיר ומייצג יתרון אמיתי בהשוואה לפרוטוקול הסטנדרטי הדורש הערכה של אחוז תולעי F2 פלואורסצנטיות על מנת לבחור לוחות F1 המציגים ≥75% צאצאים פלואורסצנטיים (טבלה 1).</li>
		</ol>
	</li>
	<li>מבחר בעלי חיים F2:
		<ol>
			<li>יחיד ארבע חיות F2 טרנסגניות פלואורסצנטיות מכל צלחת F1 שנבחרה. בעת שימוש בטרנסגנים פלואורסצנטיים (למשל mCherry8, gfp9 או dsRed10), בחר תולעי F2 עם רמה גבוהה של פלואורסצנטיות מכיוון שהדבר יכול להצביע על כך שבעלי חיים אלה הם הומוזיגוטיים עבור המערך המשולב. שימו לב שכאשר קוטפים בעלי חיים F2 חשוב לא לשאת ביצים או זחלים, על מנת להימנע מתוצאות שליליות כוזבות בשלב הבא.</li>
			<li>גדל בעלי חיים F2 בטמפרטורה של 15-25 מעלות צלזיוס.</li>
		</ol>
	</li>
	<li>בידוד ואימות של זנים טרנסגניים משולבים:
		<ol>
			<li>צלחות מסך F2 עבור 100% תולעים טרנסגניות F3 פלואורסצנטיות. המסך מהיר למדי מכיוון שנוכחותה של תולעת אחת שאינה פלואורסצנטית מעידה על כך שיש לזרוק את הצלחת. בעל חיים F2 הומוזיגוטי עבור הטרנסגן המשולב ייתן 100% צאצאים פלואורסצנטיים הומוזיגוטיים.</li>
			<li>יחיד שמונה חיות F3 פלואורסצנטיות מלוחות נבחרים כדי לאשר את התורשה של 100% של הטרנסגן. בתיאוריה, בחירת חיה אחת מספיקה בשלב זה. עם זאת, בחירת שמונה בעלי חיים פלואורסצנטיים F3 עשויה להיות נחוצה כדי להימנע מבחירת בעלי חיים לא פוריים או לא בריאים מכיוון שהקרנה עלולה לגרום באופן אקראי למוטציות המשפיעות על גנים חשובים לפיזיולוגיה של תולעים.</li>
			<li>במידת האפשר שמור על מספר זנים טרנסגניים משולבים עצמאיים, כלומר זנים שהוחזרו מבעלי חיים שונים F1.</li>
		</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+stable+transgenic+C.+elegans+using+microinjection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Generation of stable transgenic C. elegans using microinjection.</a> J. Vis. Exp. (18), e833(2008).</li>
<li>Mello, C., Kramer, J. M., Stinchlomb, D., Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+transfer+in+C.elegans%3A+extrachromosomal+maintenance+and+integration+of+transforming+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences.</a> EMBO J. 10 (12), 3959-3970 (1991).</li>
<li>Transformation and microinjection. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22WormBook%22">WormBook</a>. Evans, T. C. , The C. elegans Research Community, WormBook. (2006).</li>
<li>Hobert, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PCR+Fusion-Based+Approach+to+Create+Reporter+Gene+Constructs+for+Expression+Analysis+in+Transgenic+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">PCR Fusion-Based Approach to Create Reporter Gene Constructs for Expression Analysis in Transgenic C. elegans.</a> BioTechniques. 32, 728-730 (2002).</li>
<li>Stinchcomb, D. T., Shaw, J. E., Carr, S. H., Hirsh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extrachromosomal+DNA+transformation+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Extrachromosomal DNA transformation of Caenorhabditis elegans.</a> Mol. Cell. Biol. 5, 3484-3496 (1985).</li>
<li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77, 71-94 (1974).</li>
<li>Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Introduction+to+Worm+Lab%3A+from+Culturing+Worms+to+Mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">An Introduction to Worm Lab: from Culturing Worms to Mutagenesis.</a> J. Vis. Exp. (47), e2293(2011).</li>
<li>Merritt, C., Rasoloson, D., Gallo, C., Voronina, E., Ko, D., Seydoux, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modular+vector+kit+for+transgenesis+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22International+Worm+Meeting%22%5BJournal%5D)">A modular vector kit for transgenesis in C. elegans.</a> International Worm Meeting. , (2007).</li>
<li>Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W., Green Prasher, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+protein+as+a+marker+for+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Fluorescent protein as a marker for gene expression.</a> Science. 263, 802-805 (1994).</li>
<li>Fleenor, J., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discosoma+sp.+Red+Fluorescent+Protein+%28dsRED%29+as+a+reporter+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Worm+Breeder%27s+Gazette%22%5BJournal%5D)">Discosoma sp. Red Fluorescent Protein (dsRED) as a reporter in C. elegans.</a> Worm Breeder's Gazette. 16 (3), 16(2000).</li>
<li>Lecroisey, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ZYX-1%2C+the+unique+zyxin+protein+of+Caenorhabditis+elegans%2C+is+involved+in+dystrophin-dependent+muscle+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">ZYX-1, the unique zyxin protein of Caenorhabditis elegans, is involved in dystrophin-dependent muscle degeneration.</a> Mol. Biol. Cell. , (2013).</li>
<li>Praitis, V., Casey, E., Collar, D., Austin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creation+of+low-copy+integrated+transgenic+lines+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Creation of low-copy integrated transgenic lines in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 157 (3), 1217-1226 (2001).</li>
<li>Frøkjaer-Jensen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-copy+insertion+of+transgenes+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Single-copy insertion of transgenes in Caenorhabditis elegans.</a> Nat. Genet. 40 (11), 1375-1383 (2008).</li>
<li>Dickinson, D. J., Ward, J. D., Reiner, D. J., Goldstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+the+Caenorhabditis+elegans+genome+using+Cas9-triggered+homologous+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Engineering the Caenorhabditis elegans genome using Cas9-triggered homologous recombination.</a> Nat. Methods. 10 (10), 1028-1034 (2013).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין להם אינטרס כלכלי מתחרה.

הפרוטוקול המתואר כאן מספק שיטה יעילה לשילוב מערכים טרנסגניים חוץ-כרומוזומליים בגנום של C. elegans. באמצעות קווים לא משולבים שונים, שהעבירו את אותו טרנסגן Pdyc-1::d yc-1::gfp (pKG45) בשיעורים שונים (10-15%, 50-60% ו->80%), הראינו שמספר הזנים המשולבים שהתאוששו לאחר קרינת UV תלוי ברמת ההעברה הראשונית של הקו הלא משולב (טבלה 2). לכן, קל יותר לשלב טרנסגנים בקווים המציגים קצב העברה גבוה.
טרנסגנים משולבים מעניינים למגוון רחב של מטרות, כולל מחקרים הקשורים לוויסות גנים...

טרנסגנים נמצאים בשימוש נרחב ב-C. elegans למגוון רחב של יישומים. זנים טרנסגניים נוצרים בדרך כלל על ידי הזרקת DNA לתוך בלוטת המין ההרמפרודיטה הסינציאלית1,2. ה-DNA הנושא את הטרנסגן המעניין נטבע יחד עם פלסמידים המקודדים סמני הזרקה משותפת1,3,4. סמני הזרקה משותפת הם טרנסגנים מבוססים המובילים לביטוי של חלבון פלואורסצנטי או לפנוטיפ התנהגותי או מורפולוגי ספציפי. ה-DNA המוזרק מתארגן מחדש ליצירת מערכים חוץ-כרומוזומליים מרובי עותקים; לפיכך, הטרנסגן המעניין וסמן ההזרקה מועברים יחד5,4. קווים טרנסגניים נבחרים בדור F2 של בעלי חיים מוזרקים על ידי מעקב אחר הפנוטיפ המושרה על ידי ביטוי סמן ההזרקה (פלואורסצנטי או פנוטיפ ספציפי)1. קווים טרנסגניים מציגים שיעורי העברה חלקיים ומשתנים של המערכים החוץ-כרומוזומליים לדור הבא. בהתאם לזן, 10-100% (100% הוא אירוע נדיר) מבעלי החיים יורשים מערכים חוץ-כרומוזומליים. בנוסף, בעלי חיים טרנסגניים הם פסיפס ומבטאים את הטרנסגן במספר משתנה של תאים. סביר להניח שפסיפס זה קשור לקצב ההדבקה לדור הבא. ואכן, הן בקו הנבט והן בתאים סומטיים קצב ההעברה תלוי בהפרדה של המערכים החוץ-כרומוזומליים במהלך חלוקת התאים. אחת הדרכים להימנע מבעיה זו היא לשלב את הטרנסגן בגנום. באופן קלאסי, שילוב של טרנסגן בכרומוזום מסתמך על הקרנה (אולטרה סגולה או גמא) של תולעים טרנסגניות הנושאות מערכים חוץ-כרומוזומליים3. בקצרה, 50-100 בעלי חיים הרמפרודיטים מוקרנים בשלב הזחל L4. בדור F1 נבחרים 200-800 בעלי חיים טרנסגניים ומתורבתים בנפרד על צלחות. על פי ההפרדה המנדליאנית, בעלי חיים טרנסגניים F1 הנושאים אינטגרציה הטרוזיגוטית של הטרנסגן בגנום ייצרו 1/2 מצאצאים טרנסגניים שהם הטרוזיגוטיים עבור המערך המשולב, 1/4 מצאצאים טרנסגניים הם הומוזיגוטיים עבור המערך המשולב, ו-1/4 מצאצאים שלא שילבו את המערך (איור 1). לפיכך, צלחות המכילות את דור F2 מוקרנות ויזואלית עבור ≥75% בעלי חיים טרנסגניים כפי שנצפה על ידי ביטוי סמן ההזרקה. כ-1/3 מבעלי החיים F2 שנבחרו להיות מועמדים לאינטגרציה מניחים שהם הומוזיגוטיים עבור המערך המשולב ומייצרים 100% מחיות F3 הומוזיגוטיות. לפיכך, מכל צלחת שנבחרה, שלוש עד שמונה חיות F2 טרנסגניות מתורבות בנפרד ונבחרות צלחות עם 100% צאצאים טרנסגניים. לאחר מכן, שמונה בעלי חיים F3 מתורבתים בנפרד כדי לאשר את התורשה של 100% של הטרנסגן.
החסרונות העיקריים של שיטה זו הם
<ol type="i">
	<li>זה דורש מסך ויזואלי של כמה מאות לוחות F1 עבור ≥75% צאצאי F2 טרנסגניים, דבר שגוזל זמן בשל אחוז ההעברה המשתנה והבלתי צפוי של מערכים חוץ-כרומוזומליים לא משולבים. לחלופין, כדי להימנע מהקרנה של לוחות F1 ניתן לבצע מספר שלבי הרעבה לאחר הקרנה של בעלי חיים P0; ואחריו בחירת 100 בעלי חיים טרנסגניים וסינון ל-100% צאצאים טרנסגניים3.</li>
	<li>הוא אינו מותאם לזנים המציגים אחוז העברת מערך חוץ-כרומוזומלי גבוה מ-60% מכיוון שקשה להבחין באחוז זה מ-75%.</li>
	<li>מכיוון שניתן להשתמש רק בזנים עם קצב העברה נמוך יחסית, יש צורך במספר גבוה של בעלי חיים טרנסגניים P0 מוקרנים, כמו גם תצפית על בעלי חיים רבים F1 ו-F2, מה שגוזל זמן רב ודורש מספר לא מבוטל של צלחות.</li>
</ol>
הקרנת תולעים גורמת ככל הנראה לשברים דו-גדיליים ב-DNA ושילוב של מערכים חוץ-כרומוזומליים בכרומוזומים מתרחש במהלך תיקון ה-DNA. לפיכך, סביר להניח שהסיכויים להשיג אינטגרציה מוצלחת בתיווך הקרנה עומדים ביחס ישר למספר תאי קו הנבט הנושאים מערך חוץ-כרומוזומלי. זנים עם קצב העברה גבוה עשויים להכיל יותר מערכי DNA טרנסגניים מאשר זנים עם קצב העברה נמוך כפי שהוצעב-2, ולהציג מספר גבוה יותר של תאי קו נבט הנושאים מערכים חוץ-כרומוזומליים. לפיכך, הגענו למסקנה שבקווים בעלי שידור גבוה, טרנסגנים עשויים להיות קלים יותר לשילוב מאשר בקווים עם קצב העברה נמוך. עם זאת, הפרוטוקול הסטנדרטי אינו כולל את האפשרות לשלב טרנסגנים עם תדר העברה גבוה מכיוון שבקושי ניתן להבחין בין אחוז בעלי החיים הטרנסגניים עם מערך חוץ-כרומוזומלי לא משולב לבין זה של צאצאים של בעל חיים F1 הנושא אינטגרציה הטרוזיגוטית של הטרנסגן בגנום (איור 1).
כאן אנו מראים כי עבור טרנסגן מסוים, מספר הקווים המשולבים שהוחזרו לאחר הקרנה באור אולטרה סגול (UV) תלוי באחוז השידור ההתחלתי של המערך הלא משולב. אנו מציגים פרוטוקול משופר לאינטגרציה טרנסגנית בתיווך קרינת UV הרלוונטי במיוחד לקווים המציגים קצב גבוה של העברת מערך טרנסגנים.

<table><tbody><tr><td>Agar</td><td>Prolabo</td><td>20768.292</td><td>להכנת NGM (מדיום גידול נמטודות) (6,7)</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Chimie-Plus</td><td>40045</td><td>להכנת NGM</td></tr><tr><td>Bacto-peptone</td><td>BD</td><td>211820</td><td>להכנת NGM</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Roth</td><td>3904-1</td><td>להכנת NGM</td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Prolabo</td><td>26930.293</td><td>להכנת NGM</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Roth</td><td>P027.2</td><td>להכנת NGM</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Prolabo</td><td>22317.297</td><td>להכנת NGM</td></tr><tr><td>כולסטרול</td><td>Rectapur</td><td></td><td>להכנת NGM</td></tr><tr><td>מרק LB</td><td>Sigma</td><td>L3022</td><td>לתרבית של OP50 חיידקים</td></tr><tr><td>ציוד</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>UV צולב קישור</td><td>פישר מדעי</td><td></td><td>אורך גל 254 ננומטר</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ SteREO Discovery V8</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>צלחות פטרי, 60 מ"מ</td><td>CML</td><td>BPS55E6</td><td></td></tr><tr><td>חוט פלטיניום 0.25 מ"מ</td><td>אלפא אסר</td><td>7440-06-4</td><td>לבחירה לתולעים (7)</td></tr></tbody></table>

פרוטוקול מהיר לשילוב מערכים חוץ-כרומוזומליים עם קצב העברה גבוה לגנום c. elegans

A Rapid Protocol for Integrating Extrachromosomal Arrays With High Transmission Rate into the C. elegans Genome

מיקרו-הזרקת DNA לציטופלזמה של בלוטת המין הסינציאלית של Caenorhabditis elegans היא הטכניקה העיקרית המשמשת להקמת קווים טרנסגניים המציגים שיעורי העברה חלקיים ומשתנים של מערכים חוץ-כרומוזומליים לדור הבא. בנוסף, בעלי חיים טרנסגניים הם פסיפס ומבטאים את הטרנסגן במספר משתנה של תאים. ניתן לשלב מערכים חוץ-כרומוזומליים בגנום C. elegans באמצעות קרינת UV כדי ליצור זנים טרנסגניים שאינם פסיפס עם שיעור העברה של 100% של הטרנסגן. במידה זו, צאצאי F1 של בעלי חיים טרנסגניים מוקרני UV נבדקים עבור בעלי חיים הנושאים אינטגרציה הטרוזיגוטית של הטרנסגן, מה שמוביל לשיעור העברה מנדליאני של 75% לצאצאי F2. אחד האתגרים של שיטה זו הוא להבחין בין אחוז ההעברה הטרנסגנית באוכלוסייה לפני (X% בעלי חיים טרנסגניים) ואחרי האינטגרציה (≥75% בעלי חיים טרנסגניים F2). לפיכך, שיטה זו מחייבת בחירת קו טרנסגני לא משולב עם אחוז של בעלי חיים טרנסגניים הנמוך משמעותית מההפרדה המנדלית של 75%. כתוצאה מכך, קווים טרנסגניים לא משולבים עם קצב העברת מערך חוץ-כרומוזומלי לדור הבא ≤60% מועדפים בדרך כלל לאינטגרציה, ושילוב טרנסגנים בזנים מעבירים מאוד קשה. כאן אנו מראים כי היעילות של שילוב מערכים חוץ-כרומוזומליים בגנום מוגברת בעת שימוש בקווים טרנסגניים בעלי העברה גבוהה (≥80%). הפרוטוקול המתואר מאפשר בחירה קלה של מספר קווים עצמאיים עם שילוב טרנסגנים הומוזיגוטיים בגנום לאחר הקרנת UV של תולעים טרנסגניות המציגות שיעור גבוה של העברת מערך חוץ-כרומוזומלי. יתר על כן, שיטה זו היא די מהירה וצורכת חומר נמוך. האפשרות ליצור במהירות קווים שונים המבטאים טרנסגן משולב מסוים מעוררת עניין רב למחקרים המתמקדים בדפוס ביטוי ובקרה של גנים, לוקליזציה של חלבונים וביטוי יתר, כמו גם לפיתוח סמנים תת-תאיים.

שילובים של טרנסגנים בשני קווים שונים המעבירים מערכים חוץ-כרומוזומליים בתדירות דומה בערך (50-60%) בוצעו באמצעות הפרוטוקול הסטנדרטי והפרוטוקול המשופר (Table 1). הפרוטוקול הסטנדרטי אפשר את השגתו של שלושה קווים משולבים עצמאיים לאחר הקרנת UV של 91 בעלי חיים טרנסגניים בשלב L4, בעוד שהפרוטוקול המשופר אפשר את השגתו של קו משולב אחד לאחר הקרנת UV של 30 בעלי חיים טרנסגניים בשלב L4. הדבר מרמז כי יעילות השילוב דומה עבור שני הפרוטוקולים (קו משולב אחד לכל 30 בעלי חיים בשלב L4 שהוקרנו). עם זאת, לא ניתן לשלול את האפשרות ...

פרוטוקול זה מתאר הליך מהיר וצריכת חומר נמוך לשילוב של מערכים חוץ-כרומוזומליים טרנסגניים בגנום Caenorhabditis elegans באמצעות קרינה אולטרה סגולה (UV). יתר על כן, פרוטוקול זה מתאים במיוחד לקווים טרנסגניים המשדרים מערכים חוץ-כרומוזומליים בקצב גבוה.

פרוטוקול מהיר לשילוב מערכים חוץ-כרומוזומליים עם קצב העברה גבוה לגנום C. elegans

Microinjecting DNA into the cytoplasm of the syncytial gonad of Caenorhabditis elegans is the main technique used to establish transgenic lines that ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להטמיע מערכים טרנסגניים חוץ-כרומזומליים לתוך הגנום של serratus elegance באמצעות הקרנת על-סגול (UV). ראשית, בחרו את השורה הטרנסגנית עם שיעור ההעברה הגבוה ביותר האפשרי, באופן אידיאלי מעל 80%. לאחר מכן, הקרינו ב-UV את הזחלי L4 הטרנסגניים שנבחרו, והפרידו ארבעה בעלי חיים טרנסגניים פלואורסצנטיים מדור F2 מכל צלחת F1 שנבחרה. לאחר מכן, סרקו את צלחות ה-F2 לאיתור טרנסגניים פלואורסצנטיים בשיעור של 100%.דור F3 של תולעים. בחירה סופית של בעלי חיים פלואורסצנטיים מדור F3 יכולה להראות הורשה של 100% של הגן המעובּר. גישה ניסונית זו מתאימה היטב לקווים טרנסגניים המעבירים מערכי כרומוזומים נוספים בשיעור גבוה.את הפרוצדורה תדגים סטפני בלמן, טכנאית מהמעבדה שלנו. התחילו עם 500 צלחות פטרי גדולות המכילות מצע גידול לנמטודות. זרעו בכל צלחת 0.3 milliliters של isia coli רווי.תרבית OP 50. העריכו את קצב ההעברה של השורה הטרנסגנית המיועדת לשילוב עבור כל שורה טרנסגנית. העבירו 10 מבוגרים פלואורסצנטיים ל-10 צלחות תרבית נפרדות תחת סטריאוסקופ פלואורסצנטי.יש להניח את בעלי החיים באינקובטור לתולעים בטמפרטורה המאפשרת רבייה עבור הרקע הגנטי. יש לעקוב אחר הצאצאים מדי יום כדי להעריך באיזה שלב התפתחותי בא לידי ביטוי הסמן של ההזרקה המשותפת (co-injection marker) ומתי ניתן להשריו בצורה המיטבית באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. יש להעריך את שיעור ההעברה של הצאצאים על ידי קביעת אחוז הצאצאים הפלואורסצנטיים.עבור אינטגרציה של הגן התחליפי, בחרו את השבט הטרנסגני עם שיעור ההעברה הגבוה ביותר. השגו אוכלוסייה של בעלי חיים טרנסגניים מסונכרנת בשלב הזחל L4. לצורך האינטגרציה, העבירו 30 בוגרי GRA פלואורסצנטיים לחמש צלחות תרבית.לאחר שהתולעים הטילו ביצים במשך שלוש עד ארבע שעות בטמפרטורה של 15 degrees Celsius, יש לוודא נוכחות של לפחות 30 ביצים לכל צלחת, ולאחר מכן להסיר את הבוגרים מהצלחות. דגרו את בעלי החיים באינקובטור לתולעים עד שהצאצאים יגיעו לשלב הזחל L4. הניחו כל צלחת המכילה 15 עד 20 בעלי חיים טרנסגניים פלורסצנטיים בשלב L4 בתוך UV crosslinker ללא מכסים, והקרינו את התולעים לצורך התאוששות. דגרו את התולעים שהוקרנו למשך לילה בטמפרטורה של 15 degrees Celsius.בדקו את מספר בעלי החיים ששרדו. שיעור הישרדות של כ-80 עד 90% הוא המדד להקרנה יעילה. גדלו את בעלי החיים שהוקרנו בטמפרטורה של 15 עד 25 °C עד שהצאצאים יגיעו לשלב התפתחותי המאפשר תצפית בביטוי של סמן ההזרקה המשותפת (co injection marker).העבירו בעלי חיים בודדים פלורסצנטיים מדור F1 לצלחות תרבית נפרדות. שמרו את צלחות F1 אלו בטמפרטורה של 15 עד 25 מעלות צלזיוס עד שהצאצאים יגיעו לשלב מתאים לצפייה בבעלי חיים פלורסצנטיים מדור F2, בהתאם לסימן המשותף (co marker) שנעשה בו שימוש. במקרה זה, צפינו בתולעים בשלב הבגרות והשלכנו את כל צלחות F1 שהראו: אחת, היעדר צאצאים, מה שמעיד על כך שבעל החיים מדור F1 היה עקר או מת; או שתיים, היעדר או מספר מועט מאוד של בעלי חיים פלורסצנטיים מדור F2, מה שמעיד על כך שבעל החיים מדור F1 לא העביר את התראנסגן בשיעור הצפוי.בסו מבחר של ארבעה בעלי חיים פלורסצנטיים טרנסגניים מדור F2 מכל צלחת F1 שנבחרה. בעת שימוש בטרנסגנים פלורסצנטיים, יש לבחור תולעי F2 עם רמה גבוהה של פלורסצנציה, שכן הדבר עשוי להעיד על כך שבעלי חיים אלו הם הומוזיגוטים למערך האינטגרטיבי. שימו לב שבעת בחירת בעלי חיים מדור F2, קריטי שלא להעביר עמם ביצים או לרוות, וזאת כדי למנוע תוצאות שליליות שגויות בשלב הבא.לאחר גידול בעלי דור ה-F2, סרקו את פלטות ה-F2 לאיתור תולעי F3 טרנסגניות פלואורסצנטיות בשיעור של 100%. הסריקה מהירה למדי, שכן נוכחותו של תולע אחד שאינו פלואורסצנטי מעידה על כך שיש להשליך את הפלטה. בחרו שמונה בעלי חיים פלואורסצנטיים מדור ה-F3 מפלטות נבחרות כדי לאשר הורשה של 100% של הטרנסגן. במידת האפשר, שמרו מספר זני טרנסגנים אינטגרטיביים בלתי תלויים.בוצעו אינטגרציות של טרנס-גנים בשני קווים שונים, שהעבירו מערכים אקסטרה-כרומוזומליים בתדירות דומה בקירוב. תוך שימוש בפרוטוקול הסטנדרטי ובפרוטוקול המשופר, אופטימיזציה של הזמן ומספר הצלחות הנדרשות לכל קו אינטגרציה הושגה בפרוטוקול המשופר. לאחר מכן, בחנו את ההשערה ששיעור העברה גבוה יותר של הטרנס-גן בקו שאינו אינטגרטי מקל על שילוב הטרנס-גן בתוך הגנום.טרנסגן מסוים שולב בקוים בעלי שיעורי העברה שונים, תוך שימוש בפרוטוקול המשופר עבור הקו בעל שיעור ההעברה הגבוה ביותר. שלושה קווים משולבים התקבלו מתוך 90 בעלי חיים בלבד מדור F1 שנבחרו, בעוד שעבור הקו הטרנסגני עם שיעור העברה של 50% עד 60%, התקבל קו משולב אחד מתוך 110 בעלי חיים נבחרים מדור F1. לאחר הליך זה, ניתן לבצע שיטות שונות כדי להשיב על שאלות נוספות, כגון קביעת ביטוי גנים, דפוסים ובקרה, לוקליזציה של חלבונים וביטוי יתר של חלבונים, או פיתוח של סמנים תת-תאיים.

a-rapid-protocol-for-integrating-extrachromosomal-arrays-with-high

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

פרוטוקול מהיר לשילוב מערכים תת-כרומוזומליים עם שיעור העברה גבוה לתוך הגנום של C. elegans

הייצור של ג elegans Transgenes דרך Recombineering עם GalK לבחירה מרקר

הליך culturing נוזלי מבוסס מחלק...

תפוקה גבוהה הקרנת ו biosensing עם פלורסנט ג elegans מתחים

ניתוח microarray נערך כדי לקבוע פרופילים של ביטוי...

קביעת פרופילים ביטוי גנטיים ג elegans שימוש microarray בזמן אמת PCR

כאן אנו מתארים readout מולקולרי של הסתגלות חוש ריח לטווח הארוך...

Readout מולקולרי של הסתגלות חוש ריח לטווח הארוך ב<em&gt; ג elegans</em

סרטון זה מתאר טכניקה לסינון מהיר של נמטודה בודדת לאיתור סמן גנטי על ידי בדיקת PCR. בפרוטוקול לדוגמה, אנו בודקים עריכת גנום מבוססת קריספר.

PCR תולעת יחידה: שיטה לחלץ ולהגביר DNA גנומי

הזרקה זעירה של טרנסגנים גורמת בדרך כלל לזני C. elegans עם מערכים חוץ-כרומוזומליים גדולים, הגורמים לביטוי והעברה משתנים של הטרנסגן. קרינת UV יכולה לגרום לאינטגרציה כרומוזומלית של המערך ולהעברת טרנסגנים יציבה יותר.

קרינת UV: שיטה לשילוב מערכים חוץ-כרומוזומליים

כאן, אנו מציגים שיטה להנדס את הגנום של C. elegans שימוש CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins ותבניות תיקון התלויים הומולוגיה.

מהירה עם צינור נתיישב עבור יצירת מוטציות נקודה גנומית ב- C. elegans באמצעות CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

מוצג כאן תיאור של הבידוד הישיר והמהיר יחסית של דנ"א גנומי של Caenorhabditis elegans מבעל חיים אחד או כמה בעלי חיים באמצעות ערכת רקמה זמינה מסחרית. הכנת ה-gDNA המתקבלת היא תבנית מתאימה ל-PCR.

מיצוי בקנה מידה קטן של Caenorhabditis elegans דנ"א גנומי

פרוטוקול זה מספק שיטה למדידת תדרי הצלבה והתפלגות במהלך מיוזה ב- Caenorhabditis elegans. גנוטיפ פולימורפיזם חד-נוקלאוטידי עם PCR בזמן אמת שימש לקביעת מקור הכרומוזומים. מיפוי 4 הנקודות איפשר לקבוע את התפלגות ההצלבה של אזורי הזרוע השמאלית, המרכז והימנית של כל כרומוזום. ...

תדירות והתפלגות של הצלבות במיוזה Caenorhabditis elegans על ידי גנוטיפ SNP באמצעות PCR בזמן אמת

כאן, אנו מציגים פרוטוקול ATAC-seq מהיר ופשוט שיושם בתולעת שלמה בשלב L4 Caenorhabditis elegans באמצעות 30 מיקרו-ליטר של כדור תולעת בלבד.

פרופיל נגישות כרומטין בזחלים שלמים של Caenorhabditis elegans L4

תהליך הזרקה מיקרו-CRISPR/Cas9 לתיוג פלואורסצנטי אנדוגני בקו הנבט Caenorhabditis elegans לקבלת קווי הדחיפה הומוזיגוטיים לניתוח מיקום חלבונים בחיים.

תיוג פלואורסצנטי אנדוגני בתיווך CRISPR/Cas9 של גנים ספציפיים לקו הנבט ב-Caenorhabditis elegans

למד פרוטוקול מהיר לשילוב מערכים חוץ-כרומוזומליים בגנום Caenorhabditis elegans באמצעות קרינת UV. שיטה זו מייעלת העברת טרנסגנים בשיעור גבוה וחוסכת בחומרים.

פרוטוקול מהיר לשילוב מערכים חוץ-כרומוזומליים עם קצב העברה גבוה לגנום C. elegans

גלה סרטונים נוספים