פרוטוקול מהיר לשילוב מערכים חוץ-כרומוזומליים עם קצב העברה גבוה לגנום C. elegans

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להטמיע מערכים טרנסגניים חוץ-כרומזומליים לתוך הגנום של serratus elegance באמצעות הקרנת על-סגול (UV). ראשית, בחרו את השורה הטרנסגנית עם שיעור ההעברה הגבוה ביותר האפשרי, באופן אידיאלי מעל 80%. לאחר מכן, הקרינו ב-UV את הזחלי L4 הטרנסגניים שנבחרו, והפרידו ארבעה בעלי חיים טרנסגניים פלואורסצנטיים מדור F2 מכל צלחת F1 שנבחרה. לאחר מכן, סרקו את צלחות ה-F2 לאיתור טרנסגניים פלואורסצנטיים בשיעור של 100%.

דור F3 של תולעים. בחירה סופית של בעלי חיים פלואורסצנטיים מדור F3 יכולה להראות הורשה של 100% של הגן המעובּר. גישה ניסונית זו מתאימה היטב לקווים טרנסגניים המעבירים מערכי כרומוזומים נוספים בשיעור גבוה.

את הפרוצדורה תדגים סטפני בלמן, טכנאית מהמעבדה שלנו. התחילו עם 500 צלחות פטרי גדולות המכילות מצע גידול לנמטודות. זרעו בכל צלחת 0.3 milliliters של isia coli רווי.

תרבית OP 50. העריכו את קצב ההעברה של השורה הטרנסגנית המיועדת לשילוב עבור כל שורה טרנסגנית. העבירו 10 מבוגרים פלואורסצנטיים ל-10 צלחות תרבית נפרדות תחת סטריאוסקופ פלואורסצנטי.

יש להניח את בעלי החיים באינקובטור לתולעים בטמפרטורה המאפשרת רבייה עבור הרקע הגנטי. יש לעקוב אחר הצאצאים מדי יום כדי להעריך באיזה שלב התפתחותי בא לידי ביטוי הסמן של ההזרקה המשותפת (co-injection marker) ומתי ניתן להשריו בצורה המיטבית באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. יש להעריך את שיעור ההעברה של הצאצאים על ידי קביעת אחוז הצאצאים הפלואורסצנטיים.

עבור אינטגרציה של הגן התחליפי, בחרו את השבט הטרנסגני עם שיעור ההעברה הגבוה ביותר. השגו אוכלוסייה של בעלי חיים טרנסגניים מסונכרנת בשלב הזחל L4. לצורך האינטגרציה, העבירו 30 בוגרי GRA פלואורסצנטיים לחמש צלחות תרבית.

לאחר שהתולעים הטילו ביצים במשך שלוש עד ארבע שעות בטמפרטורה של 15 degrees Celsius, יש לוודא נוכחות של לפחות 30 ביצים לכל צלחת, ולאחר מכן להסיר את הבוגרים מהצלחות. דגרו את בעלי החיים באינקובטור לתולעים עד שהצאצאים יגיעו לשלב הזחל L4. הניחו כל צלחת המכילה 15 עד 20 בעלי חיים טרנסגניים פלורסצנטיים בשלב L4 בתוך UV crosslinker ללא מכסים, והקרינו את התולעים לצורך התאוששות. דגרו את התולעים שהוקרנו למשך לילה בטמפרטורה של 15 degrees Celsius.

בדקו את מספר בעלי החיים ששרדו. שיעור הישרדות של כ-80 עד 90% הוא המדד להקרנה יעילה. גדלו את בעלי החיים שהוקרנו בטמפרטורה של 15 עד 25 °C עד שהצאצאים יגיעו לשלב התפתחותי המאפשר תצפית בביטוי של סמן ההזרקה המשותפת (co injection marker).

העבירו בעלי חיים בודדים פלורסצנטיים מדור F1 לצלחות תרבית נפרדות. שמרו את צלחות F1 אלו בטמפרטורה של 15 עד 25 מעלות צלזיוס עד שהצאצאים יגיעו לשלב מתאים לצפייה בבעלי חיים פלורסצנטיים מדור F2, בהתאם לסימן המשותף (co marker) שנעשה בו שימוש. במקרה זה, צפינו בתולעים בשלב הבגרות והשלכנו את כל צלחות F1 שהראו: אחת, היעדר צאצאים, מה שמעיד על כך שבעל החיים מדור F1 היה עקר או מת; או שתיים, היעדר או מספר מועט מאוד של בעלי חיים פלורסצנטיים מדור F2, מה שמעיד על כך שבעל החיים מדור F1 לא העביר את התראנסגן בשיעור הצפוי.

בסו מבחר של ארבעה בעלי חיים פלורסצנטיים טרנסגניים מדור F2 מכל צלחת F1 שנבחרה. בעת שימוש בטרנסגנים פלורסצנטיים, יש לבחור תולעי F2 עם רמה גבוהה של פלורסצנציה, שכן הדבר עשוי להעיד על כך שבעלי חיים אלו הם הומוזיגוטים למערך האינטגרטיבי. שימו לב שבעת בחירת בעלי חיים מדור F2, קריטי שלא להעביר עמם ביצים או לרוות, וזאת כדי למנוע תוצאות שליליות שגויות בשלב הבא.

לאחר גידול בעלי דור ה-F2, סרקו את פלטות ה-F2 לאיתור תולעי F3 טרנסגניות פלואורסצנטיות בשיעור של 100%. הסריקה מהירה למדי, שכן נוכחותו של תולע אחד שאינו פלואורסצנטי מעידה על כך שיש להשליך את הפלטה. בחרו שמונה בעלי חיים פלואורסצנטיים מדור ה-F3 מפלטות נבחרות כדי לאשר הורשה של 100% של הטרנסגן. במידת האפשר, שמרו מספר זני טרנסגנים אינטגרטיביים בלתי תלויים.

בוצעו אינטגרציות של טרנס-גנים בשני קווים שונים, שהעבירו מערכים אקסטרה-כרומוזומליים בתדירות דומה בקירוב. תוך שימוש בפרוטוקול הסטנדרטי ובפרוטוקול המשופר, אופטימיזציה של הזמן ומספר הצלחות הנדרשות לכל קו אינטגרציה הושגה בפרוטוקול המשופר. לאחר מכן, בחנו את ההשערה ששיעור העברה גבוה יותר של הטרנס-גן בקו שאינו אינטגרטי מקל על שילוב הטרנס-גן בתוך הגנום.

טרנסגן מסוים שולב בקוים בעלי שיעורי העברה שונים, תוך שימוש בפרוטוקול המשופר עבור הקו בעל שיעור ההעברה הגבוה ביותר. שלושה קווים משולבים התקבלו מתוך 90 בעלי חיים בלבד מדור F1 שנבחרו, בעוד שעבור הקו הטרנסגני עם שיעור העברה של 50% עד 60%, התקבל קו משולב אחד מתוך 110 בעלי חיים נבחרים מדור F1. לאחר הליך זה, ניתן לבצע שיטות שונות כדי להשיב על שאלות נוספות, כגון קביעת ביטוי גנים, דפוסים ובקרה, לוקליזציה של חלבונים וביטוי יתר של חלבונים, או פיתוח של סמנים תת-תאיים.