Name: MicroRNA באתרו הכלאה לרקמות כליה פורמלין קבועה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-30T19:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 21 s
Description: למד הכלאה in situ לזיהוי microRNA ברקמות כליה קבועות בפורמלין. השיטה מאפשרת הדמיה צבעונית של ביטוי microRNA במגמות כליה ואברונים שונים באמצעות בדיקת חלבון וחומר NBT-BCIP.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מכוני בריאות הלאומיים של ארה&quot;ב מעניק HL082798 וHL111580.

1. סעיפים רקמת כליה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סעיפי כליות מוטבעים פרפין קבוע פורמלין (10%) נחתכים על גבי שקופיות מיקרוסקופ ב5 מ&quot;מ עובי באמצעות ס microM HM 355 השקופיות יכולות להיות מאוחסנות במשך מספר חודשים לפני הניתוח. </li></ol> 2. פתרון הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 1 ליטר של 1x PBS בDDH 2 O בבקבוק בראש בורג autoclavable. מלא עוד בקבוק עם 1 ליטר של DDH 2 O. הוסף 1 מיליליטר של DEPC לכל בקבוק, מכסים ולנער במרץ. תן הפתרונות לשבת לילה בטמפרטורת חדר כדי להרוס RNases ולאחר מכן חיטוי. להוסיף 400 מיליליטר 20-Tween עד 1 ליטר של 1x PBS לעשות PBS-T. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן proteinase חיץ K (50 mMTris-HCl, pH 8.0 ו1 מ&quot;מ CaCl 2 בDEPC מים מטופלים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון של גליצין 0.2% ב-PBS-T. </li></ol> 3. הכנת רקמה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן כמות גדולה של חיץ הכלאה (50-100 מיליליטר) המורכב מFormamide 50%, 5x SSC, Tween 0.1%, 9.2חומצת לימון מ&quot;מ להתאמה ל-pH 6, 50 מיקרוגרם / מיליליטר הפרין, ו500 מיקרוגרם / מיליליטר RNA שמרים בDEPC טופלה DDH 2 O. מחלקים ל 1 מיליליטר aliquots ולאחסן ב -80 º C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את פרפין מהרקמה על ידי שטיפת 3x בקסילן הטרי במשך 5 דקות כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רעננותם סעיפי רקמות על ידי 5 incubations דקות בהפחתת ריכוזים של אתנול (100%, 75%, 50%, ו25%) בDDH 2 O. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פנק את השקופיות עם מספיק DEPC כדי לכסות לחלוטין את סעיפי רקמות (כ 0.4-0.5 מיליליטר) דקות 1. רקמות בטוחים הפוך לא יתייבשו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את השקופיות בDEPC טופלו PBS-T פעמיים במשך 5 דקות, איסוף פסולת DEPC מכילים לסילוק נאות. צריכים DEPC יטופלו כל ריאגנטים לחסל RNases מנקודה זו והלאה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Prewarm proteinase K חיץ ולהוסיף K proteinase לריכוז סופי של 10 מיקרוגרם / מיליליטר. כסה סעיפי רקמות עם פתרון K proteinase ולדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להסיר במהירות את proteinasפתרון e K ולהוסיף גליצין 0.2% ב-PBS-T ל30 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מגלשות יש לשטוף בDEPC טופלו PBS-T פעמיים ל30 שניות כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתקן סעיפים בparaformaldehyde 4% טריים ל10 דקות. </li></ol> 4. הכלאה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 μl של חיץ הכלאה (Formamide 50%, 5x SSC, Tween 0.1%, חומצת לימון 9.2 מ&quot;מ להתאמה ל-pH 6, 50 מיקרוגרם / מיליליטר הפרין, 500 מיקרוגרם / שמרים RNA מיליליטר) לכל קטע רקמה ומכסים בHybriSlips RNase ללא לחתוך פשוט גדול מסעיפי הרקמות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סעיפי Prehybridize בתנור הכלאת לחות מבוקרת במשך שעה 2 בטמפרטורת הכלאה שנקבעה לבדיקת 3 &#39;שכותרתו digoxigenin (בדרך כלל DNA Tm של החללית -21 ° C, (כלומר 54 מעלות צלזיוס במשך miR-382, הבדיקה DNA Tm = 75 ° C ), תוך שימוש במעבדת רקמת מגבונים ספוגים ב50% formamide/50% SSC 5x כדי לשמור על התא humidified. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את הבדיקה מירנה, בקרה חיובית (U6, RNA הגרעיני קטן) ובקרה שלילית (מקושקשתרצף) ל40 ננומטר במאגר הכלאה (75 μl של חיץ נחוץ לכל סעיף). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחממים את הבדיקה במאגר הכלאה ב65 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את השקופיות מתנור הכלאה ולהסיר coverslips וחיץ הכלאה עודף מprehybridization. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 75 μl של חללית המכילה חיץ לכל קטע רקמה, ישירות לרקמות. כסה רקמות עם HybriSlips פשוט גדול מספיק כדי לכסות את חלקי רקמות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמירה על רמת מחזיק שקופיות, לחזור לתנור הכלאה לדגירת הלילה בטמפרטורה מהשלב 4.2 (כ 16 hr). </li></ol> 5. החמרת שטפי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 200 μl 2x SSC, מחומם לטמפרטורת ההכלאה, רק תחת קצה אחד של coverslips כדי לעזור לשחרר את coverslip מהרקמות. הסר את coverslip על ידי הטיית השקופיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את השקופיות ב200 μl של פוראמיד 50%, SSC 2x 50% ב3x טמפרטורת ההכלאה ל30 דקות כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוףשקופיות 5x ב-PBS-T בטמפרטורת חדר במשך 5 דקות כל אחד בייקר מסלולית במהירות נמוכה. </li></ol> 6. איתור <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה שקופיות בחסימת המאגר (עז 2% או בסרום סוס, 2 מ&quot;ג / מיליליטר BSA ב PBS-T) במשך שעה 1 בטמפרטורת חדר בייקר מסלולית במהירות נמוכה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל ברים אנטי DIG-AP Fab בחסימת מאגר ב1:100. להוסיף לקטע רקמה 100 μl ומכסים בHybriSlips לחתוך פשוט גדול מספיק כדי לכסות את הסעיף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה נוגדן בתא humidified על 4 מעלות צלזיוס (כ 16 שעה) למשך הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את שקופיות PBS-T 7x, במשך 5 דקות כל אחד בייקר מסלולית במהירות נמוכה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את השקופיות במאגר AP (100 מ&quot;מ TrisHCl pH 9.5, 50 מ&quot;מ MgCl 2, 100mm NaCl, 0.1% Tween 20) 3x, במשך 5 דקות כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת פתרון NBT / BCIP לחיץ AP (200 חיץ מיליליטר μl/10) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 400-500 מיליליטר של תמיסת NBT / BCIP מדולל לכל שקופית כדי לכסות את כל חלקי הרקמות לחלוטין. לפתח בחושך, ברמה, humidifתא מטען ל4-5 שעות. </li></ol> 7. שקופיות הרכבה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייבש את החלקים בהגדלת ריכוזים של אתנול (25%, 50%, 75%, 100%) במשך 5 דקות כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה ב5x קסילן כדי לנקות את החלקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר שקופיות בהרכבה הבינוני Permount ולילה יבש. </li></ol>

<ol><li>Nagalakshmi, V. K., Ren, Q., Pugh, M. M., Valerius, M. T., McMahon, A. P., Yu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dicer+regulates+thedevelopment+of+nephrogenic+and+ureteric+compartments+in+the+mammalian+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int%22%5BJournal%5D)">Dicer regulates thedevelopment of nephrogenic and ureteric compartments in the mammalian kidney.</a> Kidney Int. 79 (3), 317-330 (2011).</li>
<li>Ho, J., Pandey, P., Schatton, T., Sims-Lucas, S., Khalid, M., Frank, M. H., Hartwig, S., Kreidberg, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pro-apoptotic+protein+Bim+is+a+MicroRNA+target+in+kidney+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Neph%22%5BJournal%5D)">The pro-apoptotic protein Bim is a MicroRNA target in kidney progenitors.</a> J. Am. Soc. Neph. 22 (6), 1053-1063 (2011).</li>
<li>Tian, Z., Greene, A. S., Pietrusz, J. L., Matus, I. R., Liang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-target+pairs+in+the+rat+kidney+identified+by+microRNA+microarray%2C+proteomic%2C+and+bioinformaticanalysis%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-target pairs in the rat kidney identified by microRNA microarray, proteomic, and bioinformaticanalysis.</a> Genome Res. 18 (3), 404-411 (2008).</li>
<li>Mladinov, D., Liu, Y., Mattson, D. L., Liang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+contribute+to+the+maintenance+of+cell-type-specific+physiological+characteristics%3A+miR-192+targets+Na%2B%2FK%2B-ATPase+%CE%B21%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs contribute to the maintenance of cell-type-specific physiological characteristics: miR-192 targets Na+/K+-ATPase β1.</a> Nucleic Acids Res. 41 (2), 1273-1283 (2013).</li>
<li>Liu, Y., Taylor, N. E., Lu, L., Usa, K., Cowley, A. W., Ferreri, N. R., Yeo, N. C., Liang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Renal+medullary+microRNAs+in+Dahl+salt-sensitive+rats%3A+miR-29b+regulates+several+collagens+and+related+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension%22%5BJournal%5D)">Renal medullary microRNAs in Dahl salt-sensitive rats: miR-29b regulates several collagens and related genes.</a> Hypertension. 55 (4), 974-982 (2010).</li>
<li>Kato, M., Zhang, J., Wang, M., Lanting, L., Yuan, H., Rossi, J. J., Natarajan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-192+in+diabetic+kidney+glomeruliand+its+function+in+TGF-b-induced+collagen+expression+via+inhibition+of+E-box+repressors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-192 in diabetic kidney glomeruliand its function in TGF-b-induced collagen expression via inhibition of E-box repressors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (4), 3432-3437 (2007).</li>
<li>Krupa, A., Jenkins, R., Luo, D. D., Lewis, A., Phillips, A., Fraser, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+microRNA-192+promotes+fibrogenesis+in+diabetic+nephropathy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Neph%22%5BJournal%5D)">Loss of microRNA-192 promotes fibrogenesis in diabetic nephropathy.</a> J. Am. Soc. Neph. 21 (3), 438-447 (2010).</li>
<li>Wang, B., Herman-Edelstein, M., Koh, P., Burns, W., Jandeleit-Dahm, K., Watson, A., Saleem, M., Goodall, G. J., Twigg, S. M., Cooper, M. E., Kantharidis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((E-cadherin+expression+is+regulated+by+miR-192%2F215+by+a+mechanism+that+is+independent+of+the+profibrotic+effects+of+transforming+growth+factor-%CE%B2%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">E-cadherin expression is regulated by miR-192/215 by a mechanism that is independent of the profibrotic effects of transforming growth factor-β.</a> Diabetes. 59 (7), 1794-1802 (2010).</li>
<li>Kato, M., Arce, L., Wang, M., Putta, S., Lanting, L., Natarajan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microRNA+circuit+mediates+transforming+growth+factor-%CE%B21+autoregulation+in+renal+glomerular+mesangial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int%22%5BJournal%5D)">A microRNA circuit mediates transforming growth factor-β1 autoregulation in renal glomerular mesangial cells.</a> Kidney Int. 80 (4), 358-368 (2011).</li>
<li>Gottardo, F., Liu, C. G., Ferracin, M., Calin, G. A., Fassan, M., Bassi, P., Sevignani, C., Byrne, D., Negrini, M., Pagano, F., Gomella, L. G., Croce, C. M., Baffa, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-RNA+profiling+in+kidney+and+bladder+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Urol.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Micro-RNA profiling in kidney and bladder cancers.</a> Urol. Oncol. 25 (5), 387-392 (2007).</li>
<li>Juan, D., Alexe, G., Antes, T., Liu, H., Madabhushi, A., Delisi, C., Ganesan, S., Bhanot, G., Liou, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+microRNA+panel+for+clear-cell+kidney+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Urol%22%5BJournal%5D)">Identification of a microRNA panel for clear-cell kidney cancer.</a> Urol. 75 (4), 835-841 (2010).</li>
<li>Xu, X., Kriegel, A. J., Liu, Y., Usa, K., Mladinov, D., Liu, H., Fang, Y., Ding, X., Liang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delayed+ischemic+preconditioning+contributes+to+renal+protection+by+upregulation+of+miR-21%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int%22%5BJournal%5D)">Delayed ischemic preconditioning contributes to renal protection by upregulation of miR-21.</a> Kidney Int. 82 (11), 1167-1175 (2012).</li>
<li>Kriegel, A. J., Mladinov, D., Liang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+study+of+microRNAs+and+its+application+in+kidney+disease+and+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Translational study of microRNAs and its application in kidney disease and hypertension.</a> 122 (10), 439-447 (2012).</li>
<li>Kloosterman, W. P., Wienholds, E., de Bruijn, E., Kauppinen, S., Plasterk, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+detection+of+miRNAs+in+animal+embryos+using+LNA-moidified+oligonucleotide+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">In situ detection of miRNAs in animal embryos using LNA-moidified oligonucleotide probes.</a> Nat. Methods. 3 (1), 27-29 (2006).</li>
<li>Nelson, P. T., Baldwin, D. A., Kloosterman, W. P., Kauppinen, S., Plasterk, R. H., Mourelatos, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RAKE+and+LNA-ISH+reveal+microRNA+expression+and+localization+in+archival+human+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">RAKE and LNA-ISH reveal microRNA expression and localization in archival human brain tissue.</a> RNA. 12 (2), 187-191 (2006).</li>
<li>Obernosterer, G., Martinez, J., Alenius, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Locked+nucleic+acid-based+in+situ+detection+of+microRNAs+in+mouse+tissue+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protocols%22%5BJournal%5D)">Locked nucleic acid-based in situ detection of microRNAs in mouse tissue sections.</a> Nat. Protocols. 2 (6), 1508-1514 (2007).</li>
<li>Kriegel, A. J., Liu, Y., Cohen, B., Usa, K., Liu, Y., Liang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MiR-382+targeting+of+kallikrein+5+contributes+to+renal+inner+medullary+interstitial+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Genomics%22%5BJournal%5D)">MiR-382 targeting of kallikrein 5 contributes to renal inner medullary interstitial fibrosis.</a> Physiol. Genomics. 44 (4), 259-267 (2012).</li>
</ol>

אין מה לחשוף.

מטרתו של מאמר זה הייתה לתאר את הפרוטוקול למירנה הכלאה באתרו שפועל היטב ברקמות כליה קבועות פורמלין. תוך כדי העבודה בחוץ פרוטוקול זה כמה מקורות חשובים של חפץ מכתים זוהו. תשומת לב רבה לנקודות אלה יכולים לסייע במניעת חפץ מכתים ומעלה את הסבירות לריצה ISH מוצלחת. אחת הסיבות למניעה ביותר של חפץ מכתים יכול להתרחש כאשר חלקי רקמה הפכו התייבשו במהלך incubations הארוך. כאשר זה קורה החלק מהרקמה שהופכת יבשה יהיה כתם כ...

MicroRNA הם קטנים (אורכו כ -22 נוקלאוטידים) noncoding RNAs שמיוצרים באופן אנדוגני. הם בדרך כלל לתפקד לדכא ביטוי חלבון באמצעות דיכוי translational או השפלה mRNA. לאגד miRNAs למטרות mRNA עם השלמה שלמה, מה שמאפשר למירנה אחת כדי לדכא את המטרות מרובות. הבנה שסוגי תאים ומבנים להביע miRNAs היא חלק חשוב בהבנת המנגנונים שבאמצעותם שינויים בתא השפעת ביטוי מירנה ופנוטיפים רקמות. בעוד שיטות כגון רצף של מירנה, qPCR וסופג צפון יכולות לשמש לזיהוי של miRNAs בכל רקמות, גישה זו אינה מאפשרת אחד כדי לקבוע איזה סוג תא מסוים שממנו באו בתוך רקמה מסוימת. Dissection של רכיבים סלולריים ומבניים לפני הניתוח באמצעות שיטות אלה יכול להיות מאוד קשה והתנאים הדרושים להשגת בידודים נאותים יכולים להוביל לאלterations בביטוי גנים או השפלה של RNAs. microRNA הכלאה באתר הוא שיטה המשמשת כדי להמחיש מיקום microRNA ורמות ביטוי ברקמות. טכניקה זו היא חשובה במיוחד ברקמות מורכבות של מבנים שונים, כמו למשל בכליות. מיקרו RNA הוכח לשחק תפקיד רגולציה ב2,3 פיתוח כליות ופיזיולוגיה 4. שינויי ביטוי microRNA יש גם הוכח להיות מעורבים בפתולוגיה של כליות כמו סיסטיק 5-10, נפרופתיה סוכרתית 7, קרצינומה של הכליה 11,12, וניזק כלייתי חריף 13. במחקר שלנו, מצאנו כי אופטימיזציה של microRNA הכלאה באתרו לרקמות כליה הייתה בעל ערך לקביעת המיקומים המבניים המדויקים של ביטוי מירנה בבריאות והן במחלה 14. קביעת הביטוי צינורי וסלולרי של מיקרו RNA השונים היא חשובה משום שהרגולציה שלהם targets עשוי להיות תלוי בתפקודים תאיים. במדינות חולות חשוב גם כדי לקבוע כיצד שינויים בביטוי מירנה עלולים להיות השפעה על תפקוד. המטרה של השיטה שתוארה כאן הייתה לבנות על מתודולוגיות ISH קיימות שפותחו על ידי קלוסטרמן et al. 15, חוקרים אחרים 16,17, ואלה שהוצעו על ידי 1 Exiqon ולייעל את השיטה לרקמות כליה קבועה פורמלין. אנחנו השתמשנו בהצלחה בשיטה זו כדי לזהות הבדלים אזוריים מובהקים בביטוי כליות microRNA miR-382 עם חסימה בשופכן חד צדדית 18. גישה זו יכולה לשמש גם עם רקמות אחרות, עם אופטימיזציה נוספת.

<table><tbody><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>70011044</td><td></td></tr><tr><td>דיאתיל פירוקרבונט</td><td>Sigma</td><td>D5758</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Xylenes</td><td>Sigma</td><td>534056</td><td></td></tr><tr><td>אתנול</td><td>טהור במיוחד</td><td>200CSPTP</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Life טכנולוגיות</td><td>15506-017</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C2536</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>J.T. Baker</td><td>4059-00</td><td></td></tr><tr><td>חומצת לימון</td><td>סיגמא</td><td>C2404</td><td></td></tr><tr><td>פורממיד</td><td>סיגמא</td><td>F9037</td><td></td></tr><tr><td>20x SSC Buffer</td><td>Life Technologies</td><td>15557-044</td><td></td></tr><tr><td>הפרין</td><td>SAGENT</td><td>25021-400-30</td><td></td></tr><tr><td>שמרים</td><td>RNA Life Technologies</td><td>AM7118</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M8266-1004</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>J.T. Baker</td><td>4058-01</td><td></td></tr><tr><td>פרוטאינאז K</td><td>Fermentas</td><td>EO0491</td><td></td></tr><tr><td>3' DIG- בדיקה miRNA</td><td>Exiqon</td><td>miR dependent-05</td><td></td></tr><tr><td>3' DIG- בדיקה miR מקושקשת</td><td>Exiqon</td><td>99004-05</td><td></td></tr><tr><td>3' DIG- U6 miR בדיקה</td><td>Exiqon</td><td>99002-05</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Digoxigenin-Ab Fab</td><td>Roche</td><td>11093274910</td><td></td></tr><tr><td>NBT/BCIP</td><td>Roche</td><td>11681451001</td><td></td></tr><tr><td>Permount</td><td>Fisher</td><td>SP15-500</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips</td><td>Fisher</td><td>מתאים לגודל</td><td></td>רקמה</tr><tr><td>Microtom HM 355 S</td><td>Thermo Scientific</td><td>23-900-672</td><td></td></tr><tr><td>תנור היברידיזציה בשקופית החוצה</td><td>Boekel</td><td>241000</td><td></td></tr><tr><td>מכלול מגש אלומיניום</td><td>Boekel</td><td>C2403973</td><td></td></tr><tr><td>מתלה נירוסטה הכנס</td><td>Boekel</td><td>C2403754</td><td></td></tr></tbody></table>

microrna<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה לרקמות כליה פורמלין קבועה

MicroRNA In situ Hybridization for Formalin Fixed Kidney Tissues

במאמר זה אנו מתארים שיטה לגילוי colorimetric של מירנה בכליות באמצעות הכלאה באתר עם ​​digoxigenin מתויגים בדיקות microRNA. פרוטוקול זה, שפותח במקור על ידי קלוסטרמן ועמיתיו לשימוש רחב בבדיקות Exiqon מירנה 1, כבר שונה כדי להתגבר על אתגרים הכרוכים בניתוח מירנה ברקמות כליה. אלה כוללים נושאים כמו זיהוי מבנה וקשה להסיר בדיקה ונוגדן שיורית. שימוש בדק יחסית, 5 מ&quot;מ עובי, חלקי רקמות אפשרו להדמיה ברורה של מבנים בכליות, ואילו אות בדיקה חזקה נשמרה בתאים. בנוסף, תנאי ריכוז בדיקה ודגירה היו מותאמים כדי להקל על ויזואליזציה של ביטוי microRNA עם רקע נמוך ואות ספציפיות. הנה, בפרוטוקול מותאם מתואר, המכסה את אוסף רקמות הראשוני והכנה דרך ההרכבה של שקופיות בסוף ההליך. Compone הבסיסילילות של פרוטוקול זה יכול להיות שונה ליישום לרקמות אחרות ומודלי תרבית תאים.

האזורים של קטע רקמה שהופכים התייבש במהלך ההכלאות, incubations או לשטוף צעדים בדרך כלל בסופו של הכתמה כהה יותר במהלך פיתוח NBT / BCIP. איור 1 מציג חלק מסעיף בכליות שבי HybriSlip החליק מהקצה הרקמות, שמאפשרים לו להתייבש באופן חלקי. למרות החזרת נוזלים וכיסוי בשלבים הנותרים, האות בחלק מיובש היא גבוהה באופן מלאכותי. החשיבות של שליטה על הזמן של פיתוח NBT-BCIP באה לידי ביטוי בדמויות ו2A 2B.</stro...

מאמר זה מתאר בפרוטוקול הכלאה באתר מותאם לגילוי colormetric ביטוי microRNA בסעיפי כליות קבועים פורמלין.

MicroRNA<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה לרקמות כליה פורמלין קבועה

In this article we describe a method for colorimetric detection of miRNA in the kidney through in situ hybridization with digoxigenin tagged microRNA ...

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא לאתר ולכמת ביטוי של micro RNA ברקמות כליה. דבר זה מושג תחילה על ידי היברידציה של גשש מסומן ב-diggen ל-micro RNA נתון בתוך רקמת הכליה. כשלב שני, מדגרירים את הרקמה עם נוגדן ל-digogen, אשר מצומד לפוספטאזת alkalise.בשלב הבא, מתווסף למרקמה מצע N-B-T-B-C-I-P כדי להנמיח את מיקום ה-microRNA באמצעות פיתוח של תוצר בצבע כחול באתרים שבהם התהibrdiזציה של גששי ה-microRNA; התוצאות המתקבלות מראות היכן מבוטאים microRNAs באזורי הכליה ובמקטעי הנפרון על בסיס היברידיזציה של גששי microRNA משלימים. פרוצדורה זו משתמשת בחתכים של כליה מקובעים בפורמלין ומוטמעים בפראפין, אשר נגלו על עלויות מיקרוסקופ בעובי של 5 µm. כדי להכין את חתכי הכליה לאנליזה, ראשית יש להסיר את הפראפין מהרקמה באמצעות שלושה שטיפות בקסילן טרי למשך 5 דקות.בצעו רהידרציה לחתכי הרקמה באמצעות אינקובציות של חמש דקות בריכוזים יורדים של אתנול במים מזוקקים פעמיים. לאחר מכן, טפלו בلامשליות בכמות מספקת של dathyl, percarbonate או desy כדי לכסות לחלוטין את חתכי הרקמה למשך דקה אחת. ודאו שהרקמות אינן מתייבשות.הוצאו את השקופיות מהדסיקטור ושטפו אותן ב-PBST פעמיים למשך חמש דקות. ודאו כי הדסיקטור המכיל פסולת נאסף לצורך פינוי נאות.מהשלב זה ואילך, יש להכין את כל הרכיבים בטיפול dsy. כדי לסלק RNAs, הוסף proteinase K למסיינר proteinase K שחומם מראש, עד לריכוז סופי של 10 micrograms per milliliter. כסה את נתחי הרקמה בתמיסת protein A K והדגש ב-37 degrees Celsius למשך חמש דקות. הסר במהירות את תמיסת ה-proteinase K והוסף 0.2%glycine ב-PBST למשך 30 שניות.שטפו את העגילות פעמיים ב-PBST שעבר טיפול ב-Desy, למשך 30 שניות בכל פעם. לבסוף, קבעו את נתחי הרקמה ב-4% paraformaldehyde שהוכן רגע לפני השימוש למשך 10 דקות.כדי להתחיל הליך זה, יש להוסיף 50 µL של תמיסת היברידיזציה לכל חתך רקמה ולכסות בלוחות היברידיזציה נטולי RNA שגודלם מעט גדול מחיתוכי הרקמה. הנח את השקופיות בתוך תא לחות המכיל ניגוני מעבדה ספוגים בתמיסה של 50% formamide ו-50% five XSSC. בצע היברידיזציה מקדימה של חיתוכי הרקמה על ידי הנחת תא הלחות למשך שעתיים בתנור בטמפרטורת ההיברידיזציה שנקבעה עבור הגשוש (probe) המסומן ב-three prime dig oxygen. טמפרטורת ההיברידיזציה עבור הגשוש היא בדרך כלל טמפרטורת ההמסה של ה-DNA, או ה-TM של הגשוש, פחות 21 °C.לדוגמה, טמפרטורת ההיברידיזציה עבור הגשש mere 3 82 היא 54 °C מכיוון שה-TM שלו הוא 75 °C. הכין את גשש ה-micro RNA ואת הביקורות החיובית והשלילית על ידי דילול של כל אחד מהם לריכוז של 40 nM בבופר היברידיזציה. הביקורת החיובית היא U six small nuclear RNA והביקורת השלילית היא רצף scrambled.חממו את הגשש ואת הביקרות בטמפרטורה של 65 °C למשך חמש דקות. הוציאו את השקופיות מתנור ההכלה (hybridization oven). הסירו את השקופיות ההכליליות ואת עודפי תמי विलयן ההכלה מההסדרה של טרום ההכלה.הוסיפו 75 µL של תמיסת גשש המכילה בופר ישירות על כל פלח רקמה. כסו עם זכוכית כיסוי להיברידיזציה, שוב, בגודל שיהיה רק מספיק כדי לכסות את פלחי הרקמה. שמרו על מחזיק השקופיות במצב מאוזן.החזיר את השקופיות לתנור ההיברידיזציה בטמפרטורה המתאימה. דגרי למשך לילה, למשך כ-16 שעות. עם השלמת ההיברידיזציה, הוצא את השקופיות מתנור ההיברידיזציה.הוסיפו 200 µL של two XSSC שחומם לטמפרטורת ההיברידיזציה ממש מתחת לקצה אחד של זכוכית הכיסוי, כדי לסייע בשחרורה מהרקמה. הסירו את זכוכית הכיסוי על ידי הטיית הפיתה. לאחר הסרת זכוכית הכיסוי, שטפו את הפיתות ב-200 µL של formamide 50% ו-two XSSC בטמפרטורת ההיברידיזציה שנקבעה, שלוש פעמים למשך 30 דקות בכל פעם.שטפו את השקופיות חמש פעמים ב-PBST בטמפרטורת החדר, למשך חמש דקות בכל פעם, על מערגי ניעור אורביטלי במהירות נמוכה. התחילו את ההליך על ידי דגירה של השקופיות במאפר חסימה למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר על מערגי ניעור אורביטלי במהירות נמוכה. לאחר שעה, הוסיפו 100 µL של anti dig AP FAB fragments לכל חתך רקמה וכסו עם זכוכיות כיסוי להיברידציה.גזרו חלק גדול מספיק כדי לכסות את הפרוסה. דגרו את השקופיות בתא לחות בטמפרטורה של 4 °C למשך לילה או למשך כ-16 שעות ביום למחרת. שטפו את השקופיות שבע פעמים ב-PBST בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות בכל פעם, תוך שימוש במנער אורביטלי המוגדר למהירות נמוכה.בשלב הבא, שטפו את השקופיות בתמיסת AP buffer שלוש פעמים, למשך חמש דקות בכל פעם. הכינו את תמיסת הפיתוח N-B-T-B-C-I-P על ידי הוספת 200 µL של תמיסת N-B-T-B-C-I-P ל-10 mL של AP buffer. הוסיפו 400 עד 500 µL של תמיסת ה-N-B-T-B-C-I-P המדוללת לכל שקופית, כך שכל נתחי הרקמה יכוסו לחלוטין.פתח את הדגימות בתא לח ביגוד בחושך למשך ארבע עד חמש שעות בטמפרטורת החדר עם סיום הגילוי הכולרה-מטרי. בצע דהידרציה לחתכים בריכוזים עולים של אתנול למשך חמש דקות בכל שלב, ונקה את החתכים באמצעות חמש דגריות בקסילן למשך חמש דקות בכל פעם. לבסוף, הרכב את השקופיות במצע הרכבה מסוג per mount ויבש אותן למשך לילה.הבטחה שסרט התרקמה לא יתייבש היא קריטית להצלחת פרוטוקול ההכלאה באתר (in situ hybridization) זה. החלק השמאלי של איור זה מציג חלק מסרט כליה שבו נסללה נתיב ההכלאה מקצה הרקמה, מה שגרם להתייבשות חלקית שלה. למרות ביצוע רהידרציה וכיסוי בשלבים הנותרים, האות באזור שהתייבש גבוה באופן מלאכותי בהשוואה לחלק שנותר מכוסה על ידי נתיב ההכלאה.סרגל הכיול בתמונה זו מייצג 100 microns. החשיבות של אופטימיזציה למשך זמן הפיתוח של N-B-T-B-C-I-P מודגמת בדגמים הבאים. פאנל A מראה כי תקופות פיתוח העולות על ארבע עד חמש שעות מובילות לפיתוח צבע לא ספציפי בולט ולשיבוש של רקמות הבדיקה של בקרת micro RNA ברחבי הכליה.לוח B מראה כי דגירה למשך יותר מארבעה עד חמישה שעות אינה מובילה לשיפור נוסף באות כאשר בוחנים כליות עבור יעדים בעלי שכיחות גבוהה, כגון בקרה של U6 small nuclear RNA. נתונים אלו, המותאמים ממחקר קודם, מאשרים את ישימותה של שיטת ההיברידיזציה in situ זו לזיהוי microRNA ברקמת כליה. לוח A מציג תמונות מייצגות של ביטוי miR-382 שהתקבלו באמצעות היברידיזציה in situ בחתכים של כליות מעכברים עם או ללא חסימה חד-צדדית של השופכן (UUO), אשר טופלו ב-anti-miR-382 או ב-anti-scrambled. UUO גרם לעלייה בביטוי של miR-382, כפי שניתן לראות בצביעה כהה יותר ברקמת UUO פלוס anti-scrambled בהשוואה לרקמת sham פלוס anti-scrambled.עלייה זו נבלמה על ידי טיפול ב-anti-ME 3 82. הגרפים בפאנל B מציגים את ביטוי ה-mere 3 82 בעכברים שקיבלו פרוצדורת דמה (sham) בתוספת טיפול ב-antis scrambled, כאחוז מהממוצע של צפיפות אופטית משולבת (integrated optical density). מדד לעוצמת הפיקסלים כפי שנצפה, UUO גורם לעלייה משמעותית בביטוי mere 3 82 במדוללה החיצונית והפנימית, ו-anti-ME 3 82 חוסם עלייה זו.עלייה זו, שניתן להדגים ולמדוד אותה באמצעות היברידיזציה של micro RNA in situ. תוצאות אלו עולות בקנה אחד עם תוצאות מ-qPCR שאינן מוצגות כאן, המעידות כי השימוש בהיברידיזציה של INI two לזיהוי ביטוי של mere 3 82 בכליה מקובעת בפורמלין הוא רגיש מספיק כדי לספק תוצאות כמותיות המשקפות את ניתוח הביטוי המבוסס על qPCR. בנוסף, היברידיזציה של C two מאפשרת את מדידת הבדלים אזוריים מובחנים בביטוי של micro RNA בתוך הכליה.

microrna-in-situ-hybridization-for-formalin-fixed-kidney-tissues

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

הר שלם<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה של E8.5 לעוברי E11.5 עכבר

כאן אנו מתארים תפוקה גבוהה...

תפוקה גבוהה באתרו הכלאה שיטה לאפיון דפוסי ביטוי mRNA של העכבר עוברית בדרכי השתן ואברי המין התחתון

כאן אנו מתארים פרוטוקול פשוט לניתוחי ביטוי microRNA (miRNA) ברקמות קליניות של סרטן ערמונית קפוא (FFPE) או סרטן ערמונית קפוא טרי (PCa) המשתמשות ב-PCR כמותי בזמן אמת (RT-PCR) והכלאה באתרה (ISH).

ניתוח ביטוי מירנה ברקמות קליניות בסרטן הערמונית

כאן אנו מציגים פרוטוקול לאיתור ביטוי miRNA בדגימות חולות סרטן השד באמצעות הכלאה של miRNA באתר.

ניתוח Clinicopathological ביטוי מירנה שד רקמות סרטן על ידי שימוש מירנה<em&gt; באתרו</em&gt; כלאה

מיקרו-RNAs (miRNAs) הם רצפי RNA הומולוגי מאוד וקצר, הגשה הרגולטורים post-transcriptional RNAs שליח (mRNAs). שיטות איתור miRNA הנוכחית להשתנות רגישות. אנו מתארים פרוטוקול המשלבת בחיי עיר הכלאה immunostaining לגילוי בו-זמניות של מולקולות miRNA וחלבון במקטעי רקמת הלב העכבר.

MiRNA רקמות ספציפיות ביטוי פרופיל בהלב העכבר באמצעות סעיפים באתרו של הכלאה

אנו מתארים פרוטוקול למיקרו-דיסקציה בלייזר של תת-מקטעים של הכליה האנושית, כולל הגלומרולוס, צינורית פרוקסימלית, איבר עולה עבה, צינור איסוף ואינטרסטיציום. לאחר מכן, ה- RNA מבודד מהתאים המתקבלים ורצף ה- RNA מתבצע כדי לקבוע שינויים בחתימה התמלולומית בתוך כל מקטע משנה.

יישום של מיקרו-דיסקציה בלייזר לחשיפת תעתיקים אזוריים ברקמת הכליה האנושית

מאמר זה מציג פרוטוקול לזיהוי ביטוי מיקרו-רנ"א בכליות של מודל עכברי פגיעה כלייתית חריפה באמצעות תגובת שרשרת פולימראז כמותית בזמן אמת. פרוטוקול זה מדגיש מודל עכבר של פגיעה כלייתית איסכמית ומיצוי זהיר של דגימות מיקרו-RNA.

שיטת זיהוי כמותית למיקרו-רנ"א בכליה של מודל עכבר פגיעה כלייתית איסכמית

אנו מתארים שיטה להערכת ביטוי microRNA בכליות של עכברים עם חסימה חד צדדית שופכה (UUO) על ידי תגובת שרשרת פולימראז תמלול הפוך כמותי. פרוטוקול זה מתאים לחקר פרופילי ביטוי microRNA של כליה בעכברים עם UUO ובהקשר של תנאים פתולוגיים אחרים.

הערכת PCR בזמן אמת כמותית של ביטויי microRNA בכליות עכבר עם חסימה חד צדדית שופך

מיקרו-רנ"א מעורבים בפתוגנזה של נפרופתיה מסוג IgA. פיתחנו שיטה אמינה לאיתור רמות ביטוי מיקרו-רנ"א בכליות של עכבר נפרופתיה מסוג IgA (עכברי HIGA). שיטה חדשה זו תקל על בדיקת מעורבות miRNA בנפרופתיה מסוג IgA.

זיהוי ביטוי מיקרו-רנ"א בכליות של אימונוגלובולין עכברים נפרופתיים

כאן, אנו מספקים חיקויי miRNA אקסוגניים מסונתזים באופן מלאכותי לכליה באמצעות הזרקת וריד זנב של וקטור לא ויראלי וננו-חלקיקי פוליאתילנימין במספר מודלים של עכברים למחלות כליות. זה הוביל לביטוי יתר משמעותי של miRNA המטרה בכליה, וכתוצאה מכך עיכוב התקדמות של מחלת כליות במספר מודלים של עכברים.

העברה של miRNA אקסוגני מסונתז באופן מלאכותי לחקות לכליה באמצעות ננו-חלקיקי פוליאתילנימין במספר מודלים של עכברים למחלות כליות

הפרוטוקול מתאר בדיקת הכלאה אימונופלואורסצנטית טנדם עם רקמה משובצת פרפין קבועה בפורמלין כדי לזהות ולכמת מיקרו-RNA וחלבונים מרובים בו זמנית.

הגברה וזיהוי של מיקרו-RNA באמצעות הכלאה נעולה של חומצת גרעין-באתרה כשיטת זיהוי וכימות חדשה

למד הכלאה in situ לזיהוי microRNA ברקמות כליה קבועות בפורמלין. השיטה מאפשרת הדמיה צבעונית של ביטוי microRNA במגמות כליה ואברונים שונים באמצעות בדיקת חלבון וחומר NBT-BCIP.

MicroRNA

גלה סרטונים נוספים