Name: עכבר עוברי פיתוח במערכת סרום ללא תרבות שלמה עובר (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: למד שיטת תרבית עוברים ללא סרום מחמצנת לעכברים עובריים. שיטה זו מאפשרת מחקר מדויק של התפתחות עוברית תוך שמירה על שלמות כלי הדם והתפתחות מורפולוגית דומה לתנאי רחם.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ברצוננו להודות לד&quot;ר ג&#39;ולי גורדון וד&quot;ר ננסי מנלי לעצות מועילות שלהם עם טכניקת התרבות. עבודה זו נתמכה על ידי הגלאוקומה הקרן לילדים ושרון-סטיוארט Aniridia אמון מחקר.

תרבות עובר עכבר: כל הליכי הניסוי נערכו בהתאם קפדן עם המכון הלאומי לבריאות ההנחיות הבאה # פרוטוקול A2010 07-119, שנבדק ואושר על ידי אוניברסיטת ג&#39;ורג&#39;יה המוסדית טיפול בבעלי חיים ועדת שימוש, השומר על פיקוח רגולטורים המשיך. 1. הכנת תרבות מדיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את מדיום תרבות באמצעות תקשורת בתאי גזע זמינה באופן מסחרי ותוספים בסכומים הבאים: נוקאאוט DMEM, החלפה בנוקאאוט סרום (KSR) (10%), N-2 מוסף (1x), אלבומין, משור הסרום (2%), פניצילין ( 50 IU / ml), סטרפטומיצין (50 מיקרוגרם / מיליליטר) וAmphotericin-B (1.25 מיקרוגרם / מיליליטר). מדיום התרבות הכין דומה לזה שתואר קודם לכן 15 עם השינויים הבאים: תוספת של אנטי mycotics ובאמצעות פעמיים הריכוז של אנטיביוטיקה (לפרטים של חומרים כימיים וציוד מסוימים, ראה ליst של חומרים). שים לב: ריכוז אנטיביוטיקה כהשתמש בעבר (. מור-סקוט, et al 15) היה מספיק לתרבויות עובר ביצעו עד 24 תקופת זמן שעה. עם זאת, כאשר התרבות נמשכה מעבר 24 שעות, שחווינו זיהום של התרבות וזה היה בשליטה בהצלחה על ידי הכפלת ריכוז האנטיביוטיקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסן את רכיבי תקשורת על 4 מעלות צלזיוס או ב-20 מעלות צלזיוס בהתאם להמלצות יצרן. יש לאחסן KSR ו-N-2 מוסף בaliquots ב -20 מעלות צלזיוס, כדי למנוע הקפאה והפשרה חוזרות ונשנות. נוקאאוט DMEM פתח פעם אחת צריך להיות מנוצל בתוך 30 ימים לפי המלצת יצרן. לפני השימוש, לחמם את המרכיבים באמבט מים עד 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את התקשורת בתנאים סטריליים. לחטא את פני השטח של כל הציוד והבקבוקים המכילים את מרכיבי תקשורת עם 70% ספריי אלכוהול לפני הצבתי במכסת המנוע בתרבית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתן לערבב את רכיבי התקשורת או בכוס סטרילית או ישירות במערכת הסינון (קורנינג). ראשון מוסיף את אבקת אלבומין לDMEM נוקאאוט. מערבבים היטב על ידי בעדינות רועדת עד אלבומין מתמוסס לחלוטין. לאחר מכן להוסיף את תוספת N-2, KSR ואנטיביוטיקה ומערבבים היטב באמצעות pipettor. ואז לסנן לעקר את התקשורת באמצעות מסנן גודל נקבובית 0.22 מיקרומטר עם שאיבת ואקום. לוותר מדיה לתוך 50 צינורות מ&quot;ל ולאחסן בצורת חרוט על 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש. יש להשתמש באמצעי התקשורת מוכן פעם אחת בתוך 4-5 ימים לתרבות. </li></ol> 2. הכנה של תרבות ציוד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר את בקבוקי תרבות זכוכית ופקקי גומי. לעטוף את בקבוקי התרבות ברדיד אלומיניום ומניח את פקקי בקבוק גומי בכוס מים ולעקר ידי מעוקר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר את חדר התרבות (Precision חממת יחידה) עם 70% ספריי אלכוהול וחם 37 מעלות צלזיוס לפני שמתחיל התרבות. חדר התרבות הוא דוארהתלוצץ עם דיסק מתגלגל במרכז שמחזיק את בקבוקי התרבות. זרימת גז לתוך התא מוסדרת על ידי מד לחץ וקצב הזרימה יכול להיות מותאם על ידי התבוננות יצוא של בועות אוויר במים בצינור זכוכית בסוף. מנגנון תרבות זו מתגלגל בקבוק הוא גרסה שונה של המכשיר המקורי שהוצג על ידי בניו וCockroft 17. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר בלון גז המכיל תערובת גז של 95% O 2/5% CO 2 לחדר התרבות ולהתאים את זרימת הגז ל&quot; בועת אוויר אחת לשנייה &quot;, שנותנת קצב זרימה של 50 סמ&quot;ק / דקה ומבטיחה אספקת חמצן נאותה לעוברי התרבות. </li></ol> 3. עובר אוסף מאוס והכנה לתרבות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לקבל עוברי עכברי סוג בר, אנחנו מנוצלים עכברים של C57BL/6J ו-CD-1 (Charles River Laboratories) זני רקע גנטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את נקבות העכברים לתקעים בנרתיק בכל יום בבוקר. בצהריים ביום של מציאת הדואר תקע נרתיק צריך להיחשב כE0.5 DPC (ימים שלאחר משגל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף עובר עכבר בE10.5 DPC ידי הרדמת חסד העכברים בהריון הבא פרוטוקולים סטנדרטיים. עכברים מורדמים באמצעות מכשיר משאיפת CO 2 כמו שצוין על ידי האגודה האמריקנית לרפואת וטרינרית (AVMA) הנחיות להמתת החסד של בעלי חיים (2013). כדי להבטיח את המוות, נקע בצוואר הרחם בוצע לאחר החשיפה ל-CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ריסוס 70% אתנול על פני בטן הגחון, כדי למנוע הידבקות של שיער בבטן למכשירים. לאחר מכן פתח את חלל בטן ventrally באמצעות מספריים הפעלה חדים בוטים וזוג 4-3/4 בmicrodissecting מלקחיים כדי לאתר את הרחם. באמצעות 4 במלקחי microdissecting להרים את הרחם כולו ולהפריד אותו מהגוף על ידי חיתוך עם מספריים הפעלה אור בגוף הרחם ובטיפים של קרן הרחם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מהר לשטוף את הרחם כולו ב1x PBS חימם ל37 מעלות צלזיוסכדי להסיר כל דבק דם אל הרחם ואת המקום באופן מיידי בDMEM לחמם 37 מעלות צלזיוס בצלחת פטרי. לעקר את המכשירים על ידי 70% תרסיס אתנול לפני שימוש נוסף. הערה: Preheating הפתרונות כוללים PBS, DMEM ובינוני התרבות ושמירתם על 37 מעלות צלזיוס במהלך ההליך כולו מומלץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת מיקרוסקופ לנתח, הרחם צריך להיות גזור segmentally עם מספריים הפעלת אור. התוצאה היא פתחים קטנים בכל צד של הרחם המפולח דרכו פינצטה microdissecting שונה (קצוות קהה) יכולה להיות מוכנסת בעדינות כדי להרחיב את הפתח. זה מאפשר החשיפה של decidua השליה, אשר לאחר מכן ניתן להסיר בעדינות על ידי קריעה עם פינצטה microdissecting לחשוף את שק החלמון הקודקודית (פיז) עם הקרום של רייכרט. שימוש בקצה אחד של פינצטה בעדינות לנקב את הקרום של רייכרט יחד עם פיז ונפרד מן הדואר בסיסי שק חלמון קרביים (VYS) שכבה לחשוף את העוברים עם VYS ללא פגע. קונוס ectoplacental ונגזרי trophoectoderm ניתן להסיר גם עם decidua השליה או עם הקרום של רייכרט. יש להקפיד להימנע מקרע של VYS כעוברים קופצים החוצה באופן מיידי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עובר עם VYS שלם אמורים להיות מועבר לצלחת פטרי שמכילה את מדיום תרבות לחמם 37 מעלות צלזיוס באמצעות פיפטה העברה פלסטיק. הערה: העברה למדיום תרבות מייד לאחר פרידה מרחם מסייעת להתפתחות טובה יותר של העובר בתרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח קטן צריכה להתבצע בצק החלמון עם פינצטה microdissecting הימנעות כלי דם גדולים. זוג חד של פינצטה יכול לשמש כדי להפוך את הפתיחה בעדינות על ידי הפירסינג באזור סמוך לאזור הראש. לחלופין שני זוגות של פינצטה הבוטה יכולים לשמש כדי להחזיק את שק החלמון ועדינות לקרוע כדי להפוך את פתח קטן.ואז בעדינות להרחיב את הפתח על ידי הרחבת עם פינצטה לגודל פשוט מספיק כדי להתאים את הראש העוברי. הקרום השפיר העוטף את העובר באופן הדוק צריך להתנהל בעדינות מהגוף וקרוע באמצעות פינצטה. הראש העוברי ולאחר מכן את כל העובר צריך להיות exteriorized עדינות מצק החלמון, תוך שמירה על שלמות כלי הדם העוברי עם זה של שק החלמון 15. הערה: כל פגיעה בכלי דם שק החלמון עלול להשפיע על התפתחותו של העובר בתרבות. אין להשתמש בעוברים כזה עם כלי דם שניזוקו לתרבות ויכולים לשמש לאחסון הזמני העוברים אשר מאוחר יותר יכול להיות מושלך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קריטריוני היערכות עובריים: בדוק את העוברים תחת מיקרוסקופ לנתח וקבוצתי על ידי קריטריונים מורפולוגיים, כולל גוף וגודל הראש, גפיים ומורפולוגיה העין ובמה על ידי ספירת מספר somite (ות) עבור לפחות שני עוברים מכל קבוצה. &lt;strong&gt; הערה: בדרך כלל עוברים המתקבלים מהבדלי מופע ההמלטה זהים בפיתוח ברחם ושונה בגודל הגוף, תכונות מורפולוגיות ומספר somites. עם זאת, מצאנו כי עוברי מקובצים לפי הקריטריונים מורפולוגיים שלנו בדרך כלל הציגו מספר דומה somite (± 1). מסיבה זו, היא אינה נדרשת לספור somites לכל עובר כמו זה יעכב את הזמן להתחלת התרבות. שים לב: אין להשתמש בעוברים ששמשו לספור somites לתרבות. ספירת somites לאחר תחילת התרבות לעוברים אחרים על מנת למנוע את השהיית הזמן במתחיל התרבות. העוברים שעוכבו לתרבות אחרי פרידה מהרחם בדרך כלל תערוכת פיתוח עני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעביר את העוברים מייד לצלחת פטרי עם תרבות טרי בינוני לחמם 37 מעלות צלזיוס ולקחת אותו למכסת מנוע התרבות שבה עובר שוב צריך להיות מועבר לצלחת פטרי עם cultur סטריליתקשורת דואר לפני שמכניסה אותם לבקבוקי התרבות עם מדיום כדי להתחיל את התרבות. הערה: העברות תקשורת מרובות עבור העוברים לפני התרבות מסייעת במניעת זיהום כצעדים השונים של אוסף עובר ונתיחה בוצעו תחת מיקרוסקופ לנתח שלא הותקן במכסת המנוע בתרבית. הערה: כאשר גודל ההמלטה הוא גדול (&gt; 12 עוברים), חצי מעוברי התהליך ולהתחיל את התרבות או לשים אותם בצלחת עם מדיום התרבות ולמקם אותו בCO 2 באינקובטור ב 37 ° C. כאשר עוברים הושארו מחוץ לתקופות ארוכות יותר (&gt; דקות 35-40) שנצפינו קצב הלב להאט את קצב וזה ישפיע על ההתפתחות המאוחרת יותר בתרבות. </li></ol> 4. Culturing עוברי עכברים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את בקבוקי תרבות autoclaved בשכונה התרבות ולתייג אותם כמו שצריך. העברת 3 מיליליטר של מדיום תרבות לחמם 37 ° C לכל אחד tהוא בקבוקים ולאחר מכן את עוברי העכבר צריכים להיות מועברים בעדינות לתוך בקבוקי התרבות באמצעות טפטפות העברת פלסטיק סטרילית. בקבוקי התרבות אמורים להיות כתרים עם פקקי בקבוק גומי המסייעים להחזיק את בקבוקי התרבות לדיסק מתגלגל במנגנון התרבות. הערה: אפשר להכין בקבוקי התרבות עם התקשורת והניחו על הדיסק מתגלגל של מנגנון התרבות לפני והרדמת חסד העכברים. זה מקצר את הזמן להעברת עוברים לתוך בקבוקי התרבות. שימו לב: יכול להיות מתורבת עוברי עכבר בנפרד או כcocultures עם שניים או שלושה עוברים באותו בקבוק התרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקבוקי התרבות צריכים להתבצע סביבה נקיה מחיידקים למנגנון התרבות על 37 מעלות צלזיוס והדוקות חבר אותם לחורים שבדיסק מתגלגל עם פקקי הגומי. הפעל את הדיסק מתגלגל כדי לסובב במהירות קבועה של 35 סיבובים לדקה (סל&quot;ד), המאפשרת ציפה החופשית של embryos בתקשורת וגם מסייע בחילוף גזים בחינם על ידי הרקמה העוברית. הגז מהצילינדר המחובר לחדר התרבות זורם דרך הדיסק מתגלגל ופקקי גומי לבקבוקי התרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התרבות עובר ל16-40 שעה ובאופן קבוע לבדוק את יצוא הגז וטמפרטורת חדר התרבות. הערה: מניפולציה עובר מאוס בתרבות: בואו לקבל העוברים מותאמים לתנאי התרבות לפחות 30 דקות. לאחר מכן עובר עם ביצועים נמוכים ומראה דופק חלש יכול להיות מושלך ואת העוברים שנותרו יכולים להיות מנוצל עבור מחקרי מניפולציה נוספים. ניתן לבצע מניפולציות עובר כגון 5,9,16 electroporation, microinjections 18, השתלת חרוז 16, טיפול תרופתי והליכים אחרים בשלב זה. אנחנו ביצענו בהצלחה השתלה של חרוזים agarose Affi ג&#39;ל שטופלו במולקולות איתות מסוימות כדי ללמוד את תפקידם בפיתוח העין מוקדם. העוברים לאחרניתן להחזיר מניפולציות בחזרה במדיום חדש והמשיכו בתרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף את התקשורת והתרבות לגמרי עם מדיה חדשה במרווחי זמן מסוימים לאחר שעות 9-10 ו18-19 שעות של התרבות שבה התרבות הייתה נמשכה 40 שעה. הערה: החלפת מדיה תרבות לא ייתכן שתידרש אם התרבות הוא נעצרה על ידי 16-18 שעה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדדי הצלחה בתרבות של: הישרדות עוברי בתרבות צריכה להיקבע על ידי קצב לב גלוי וזרימת דם בגוף, תוך צמיחה עוברית בתרבות צריכה להיות מוערכת על ידי עלייה בגודל גוף, מספר somite ופיתוח הצורני של ראש, גפיים, לב ועיניים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוברים ברחם שפותח בE11.0 DPC (~ 40-41 ים) וE12.0 DPC (~ 49-50 ים) אמורים לשמש כבקרה להשוואה בין עוברים בתרבית למשך 16-18 שעות ו38-40 שעות, בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התפתחות עוברי בנקודות זמן שונות במהלך תרבות ובשלבי רחם יכולה להיות קפטןured תחת מיקרוסקופ לנתח. תוכנת ההדמיה ספוט נוצלה כדי ללכוד את התמונות ולאחר מכן תעובד באמצעות תוכנת עיבוד תמונה. </li></ol>

<ol><li>Behesti, H., Holt, J. K., Sowden, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+level+of+BMP4+signaling+is+critical+for+the+regulation+of+distinct+T-box+gene+expression+domains+and+growth+along+the+dorso-ventral+axis+of+the+optic+cup%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">The level of BMP4 signaling is critical for the regulation of distinct T-box gene expression domains and growth along the dorso-ventral axis of the optic cup.</a> BMC Dev. Biol. 6, 62 (2006).</li>
<li>Gray, J., Ross, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+tube+closure+in+mouse+whole+embryo+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Neural tube closure in mouse whole embryo culture.</a> J. Vis. Exp. , (2011).</li>
<li>Tam, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postimplantation+mouse+development%3A+whole+embryo+culture+and+micro-manipulation%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Postimplantation mouse development: whole embryo culture and micro-manipulation.</a> Int. J. Dev. Biol. 42, 895-902 (1998).</li>
<li>Miura, S., Mishina, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-embryo+culture+of+E5.5+mouse+embryos%3A+development+to+the+gastrulation+stage%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Whole-embryo culture of E5.5 mouse embryos: development to the gastrulation stage.</a> Genesis. 37, 38-43 (2003).</li>
<li>Osumi, N., Inoue, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+transfer+into+cultured+mammalian+embryos+by+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Gene transfer into cultured mammalian embryos by electroporation.</a> Methods. 24, 35-42 (2001).</li>
<li>Yokoo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+mesenchymal+stem+cells+in+rodent+whole-embryo+culture+are+reprogrammed+to+contribute+to+kidney+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Human mesenchymal stem cells in rodent whole-embryo culture are reprogrammed to contribute to kidney tissues.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 3296-3300 (2005).</li>
<li>Sadler, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+of+early+somite+mouse+embryos+during+organogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Embryol.+Exp.+Morphol%22%5BJournal%5D)">Culture of early somite mouse embryos during organogenesis.</a> J. Embryol. Exp. Morphol. 49, 17-25 (1979).</li>
<li>Kitchin, K. T., Ebron, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Further+development+of+rodent+whole+embryo+culture%3A+solvent+toxicity+and+water+insoluble+compound+delivery+system%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology%22%5BJournal%5D)">Further development of rodent whole embryo culture: solvent toxicity and water insoluble compound delivery system.</a> Toxicology. 30, 45-57 (1984).</li>
<li>Takahashi, M., Nomura, T., Osumi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transferring+genes+into+cultured+mammalian+embryos+by+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Growth+Different%22%5BJournal%5D)">Transferring genes into cultured mammalian embryos by electroporation.</a> Dev. Growth Different. 50, 485-497 (2008).</li>
<li>Cuthbertson, R. A., Beck, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postimplantation+whole+embryo+culture%3A+a+new+method+for+studying+ocular+development%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Postimplantation whole embryo culture: a new method for studying ocular development.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 31, 1653-1656 (1990).</li>
<li>New, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+explanted+rat+embryos+in+circulating+medium%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Embryol.+Exp.+Morphol%22%5BJournal%5D)">Development of explanted rat embryos in circulating medium.</a> J. Embryol. Exp. Morphol. 17, 513-525 (1967).</li>
<li>Chung, K. C., Park, J. H., Kim, C. H., Ahn, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+necrosis+factor-alpha+and+phorbol+12-myristate+13-acetate+differentially+modulate+cytotoxic+effect+of+nitric+oxide+generated+by+serum+deprivation+in+neuronal+PC12+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Tumor necrosis factor-alpha and phorbol 12-myristate 13-acetate differentially modulate cytotoxic effect of nitric oxide generated by serum deprivation in neuronal PC12 cells.</a> J. Neurochem. 72, 1482-1488 (1999).</li>
<li>Sasaoka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+a+functional+role+of+Shc+proteins+in+mitogenic+signaling+induced+by+insulin%2C+insulin-like+growth+factor-1%2C+and+epidermal+growth+factor%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Evidence for a functional role of Shc proteins in mitogenic signaling induced by insulin, insulin-like growth factor-1, and epidermal growth factor.</a> J. Biol. Chem. 269, 13689-13694 (1994).</li>
<li>Chotani, M. A., Mitra, S., Eid, A. H., Han, S. A., Flavahan, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+cAMP+signaling+pathways+differentially+regulate+alpha2C-adrenoceptor+expression%3A+role+in+serum+induction+in+human+arteriolar+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Distinct cAMP signaling pathways differentially regulate alpha2C-adrenoceptor expression: role in serum induction in human arteriolar smooth muscle cells.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 288, 69-76 (2005).</li>
<li>Moore-Scott, B. A., Gordon, J., Blackburn, C. C., Condie, B. G., Manley, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+serum-free+in+vitro+culture+technique+for+midgestation+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">New serum-free in vitro culture technique for midgestation mouse embryos.</a> Genesis. 35, 164-168 (2003).</li>
<li>Gordon, J., Moore, B. A., Blackburn, C. C., Manley, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum-Free+Culture+of+Mid-gestation+Mouse+Embryos%3A+A+Tool+for+the+Study+of+Endoderm-Derived+Organs%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Serum-Free Culture of Mid-gestation Mouse Embryos: A Tool for the Study of Endoderm-Derived Organs.</a> Methods Mol. Biol. 1092, 183-194 (2014).</li>
<li>New, D. A., Cockroft, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rotating+bottle+culture+method+with+continuous+replacement+of+the+gas+phase%5BTitle%5D)+AND+%22Experientia%22%5BJournal%5D)">A rotating bottle culture method with continuous replacement of the gas phase.</a> Experientia. 35, 138-140 (1979).</li>
<li>Cockroft, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+in+culture+of+rat+foetuses+explanted+at+12.5+and+13.5+days+of+gestation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Embryol.+Exp.+Morphol%22%5BJournal%5D)">Development in culture of rat foetuses explanted at 12.5 and 13.5 days of gestation.</a> J. Embryol. Exp. Morphol. 29, 473-483 (1973).</li>
<li>Zeeb, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+manipulation+of+blood+and+lymphatic+vascularization+in+ex+vivo-cultured+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Pharmacological manipulation of blood and lymphatic vascularization in ex vivo-cultured mouse embryos.</a> Nat. Protoc. 7, 1970-1982 (2012).</li>
<li>Wawersik, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMP7+acts+in+murine+lens+placode+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">BMP7 acts in murine lens placode development.</a> Dev. Biol. 207, 176-188 (1999).</li>
<li>Thut, C. J., Rountree, R. B., Hwa, M., Kingsley, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+large-scale+in+situ+screen+provides+molecular+evidence+for+the+induction+of+eye+anterior+segment+structures+by+the+developing+lens%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">A large-scale in situ screen provides molecular evidence for the induction of eye anterior segment structures by the developing lens.</a> Dev. Biol. 231, 63-76 (2001).</li>
<li>Greenfield, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogen+lowers+Alzheimer+beta-amyloid+generation+by+stimulating+trans-Golgi+network+vesicle+biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Estrogen lowers Alzheimer beta-amyloid generation by stimulating trans-Golgi network vesicle biogenesis.</a> J. Biol. Chem. 277, 12128-12136 (2002).</li>
<li>Cheng, J., Dutra, A., Takesono, A., Garrett-Beal, L., Schwartzberg, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+generation+of+C57BL%2F6J+mouse+embryonic+stem+cells+in+a+defined+serum-free+media%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Improved generation of C57BL/6J mouse embryonic stem cells in a defined serum-free media.</a> Genesis. 39, 100-104 (2004).</li>
<li>Kim, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+reprogramming+of+human+neural+stem+cells+by+OCT4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Direct reprogramming of human neural stem cells by OCT4.</a> Nature. 461, 649-643 (2009).</li>
<li>Totonchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feeder-+and+serum-free+establishment+and+expansion+of+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Feeder- and serum-free establishment and expansion of human induced pluripotent stem cells.</a> Int. J. Dev. Biol. 54, 877-886 (2010).</li>
</ol>

אין לנו שום אינטרסים כלכליים מתחרים.

עוברי עכברים בשלב אמצע הריון היו בתרבית בתקשורת ותרבות בסרום ללא באווירה של 95% O 2/5% CO 2 במנגנון תרבות בקבוק מתגלגל על 37 ° C. הרחם לשעבר התפתחות עובר היה תלוי באופן קריטי במספר גורמים: בכל שלב במהלך ההליך מרגע שהרחם בודד מהעכברים מורדמים ועד לסיומה של התרבות (איור 1). הגורם החשוב ביותר שהשפיע על ההתפתחות היה הזמן שנדרש כדי להתחיל את התרבות. נקודות קריטיות האחרות במהלך ההליך שדורשים רוב הטיפול כוללות צעדים כגון ההפרדה עובר עם שק ח...

במבחנה שיטות תרבות ניצול כל העוברים מתאימות גם ללמוד איתות מנגנונים המעורבים בorganogenesis העוברי שקשים אחרת לגישה ברחם. עוברים שלמים לספק את שלמות הרקמות ותמיכה מתאימה לאינטראקציות רקמות, כי הם חיוניים להתרחשות בזמן של איתות מנגנונים חיוניים לתהליכים תאיים שונים במהלך organogenesis. בעוד תרבויות עובר כולו לתת במה לשפע של יישומים, כגון לימודי השתלה, מניפולציות גנטיות ורקמות, מחקרי השתלת חרוז, מחקרי טוקסיקולוגי, וכו &#39;., מערכות תרבות עובר מנוצלים כיום הן בעיקר תלויות בסרום לצמיחה ולתחזוקה נאותות של העוברים בתרבות 1-9. הסרום נוצל כאחד המרכיבים העיקריים הנעים 10-100% מהתקשורת והתרבות 6-8, 10, 11.; עם זאת, ההרכב של סרום אינו מוגדר היטב והוא יכול להיות שונה מבעלי החיים לבעלי חיים ובכל פעם הסרום נאסף. בזמן הכנת מעבדה של סרום היא זמן רב וכרוכה בנהלים מחמירים, סרום רכש מסחרי מציג שונות רבות בקרב הרבה שונים ומעלה את עלויות ניסוי. נוסף על אלה, בסרום עשוי להכיל גורמים בלתי ידועים כגון גורמי גדילה, הורמונים, או חלבונים אחרים, אשר יכול להשפיע על התוצאה של ניסויים מסוימים, בעיקר אלה הכרוכות במחקר של מולקולות איתות חשובות באינטראקציות רקמות. מחקרים הראו כי תוספת של סרום לתרבות עלולה לשנות את הרמות תאית של מולקולות איתות מסוימות, כגון monophosphate המחזורי אדנוזין (cAMP) וחלבונים מעורבים איתות וphosphoinositide 3 mitogenic (PI 3)-kinase איתות מסלולים 12-14. בניגוד לאלה, מערכת תרבות סרום ללא מספקת את היתרונות של סביבת אנטיגן חופשי,התנזרות מאנזימים פעילים ביולוגי, שיכול לשנות את התהליכים התאיים ומאפשרת עקביות בין ניסויים. במחקר הנוכחי, אנו מנוצלים מדיום סרום ללא תרבות שהוכן מתוספי תקשורת תאי גזע זמינים באופן מסחרי לעוברי כל שלב אמצע הריון התרבות באווירה של 95% O 2/5% CO 2 במנגנון תרבות בקבוק מתגלגל על 37 ° C 15,16. עוברי עכבר בתרבית למשך 16-40 שעות בתנאים המוגדרים אלה הציגו התקדמות בפיתוח צורני של גוף ושונה מבנים עובריים הכלליים כגון לב, גפיים, מוח ועיניים המצביעים על הרמות המתאימות של התרבות תאים, נדידה, התמיינות ואינטראקציות רקמות. ניתוח מולקולרי של ההתפתחות העוברית בתרבות לאחת ממערכות האיברים מורכבות כמו העין חשף את הפיתוח העיני להיות עקבי עם זה שנצפה ברקמת העין בembryos מתפתח ברחם (Kalaskar ולודרדייל, בהכנה). כך אנו מראים כי עוברי עכבר בתרבית בשלב אמצע הריון, מפגינים צמיחה מתקדמת ופיתוח מורפולוגיים דומה לזה שנצפה בעוברים מתפתחים ברחם.

<table><tbody><tr><td>KnockOut DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>10829-018</td><td></td></tr><tr><td>החלפת סרום נוקאאוט</td><td>Invitrogen</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>תוסף N-2</td><td>Invitrogen</td><td>17502-048</td><td>מלאי: 100x</td></tr><tr><td>אלבומין, מסרום בקר</td><td>Sigma</td><td>A9418-50G</td><td>מלאי: 100%</td></tr> <tr><td>אנטיביוטיקה - תמיסה אנטי-פטרייתית</td><td>Cellgro</td><td>30-004-Cl</td><td>מלאי: פניצילין (10,000 יחב"ל/מ"ל); סטרפטומיצין (10,000 ומיקרו; גרם/מ"ל; אמפוטריצין (250 ומיקרו; גרם/מ"ל)&nbsp;</td></tr><tr><td>DMEM&nbsp; &nbsp;</td><td>Cellgro</td><td>15-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>יחידת חממה מדויקת</td><td>B.T.C. הנדסה מילטון קיימברידג' אנגליה</td><td>Id.No. 840-374</td><td></td></tr><tr><td>בקבוקי זכוכית ליחידה מסתובבת</td><td>B.T.C. הנדסה</td><td></td><td></td></tr><tr><td>סיליקון גומי פקק</td><td>B.T.C. הנדסה</td><td></td><td></td></tr><tr><td>95% O2/5% CO2 Cylinder</td><td>AirGas Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stemi SV11 Apo Dissecting Microscope</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stemi SV6 מיקרוסקופ</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CO2 חממה עם מעטפת מים</td><td>Forma דגם מדעי</td><td>: 3110</td><td></td></tr><tr><td>קולט אדים</td><td>Nuaire ארונות בטיחות ביולוגיים Class II TypeA2</td><td>דגם: Nu-425-600</td><td></td></tr><tr><td>Water Bath</td><td>Fisher Scientific</td><td>IsoTemp205</td><td></td></tr><tr><td>משקל איזון</td><td>מטלר טולדו</td><td>AG285</td><td></td></tr><tr><td>צינור צנטריפוגה, 50 מ"ל</td><td>קורנינג</td><td>430291</td><td></td></tr><tr><td>מספריים הפעלה קלים</td><td>Roboz</td><td>RS-6702</td><td></td></tr><tr><td>מספריים חדים-קהים להפעלה&nbsp;</td><td>Roboz</td><td>RS-6812</td><td></td></tr><tr><td>מיקרו-מלקחיים, 4 במלקחיים</td> מיקרו-ניתוחים של <td>Roboz</td><td>RS-5211</td><td></td></tr><tr><td>- הדסון (cWALD), 4-3/4 בפינצטה</td> מיקרו-חיתוך <td>של Roboz</td><td>RS-5237</td><td></td></tr><tr><td>(5/45)</td><td>Roboz</td><td>RS-5005</td><td>שונה - קצוות חדים נעשו</td></tr><tr><td>קהים פינצטה מיקרו-חיתוך (5)</td><td>Roboz</td><td>RS-5060</td><td>שונה - קצוות חדים נעשו קהים</td></tr><tr><td>פינצטה מיקרו (55)</td><td>Roboz</td><td>RS-5063</td><td>שונה - קצוות חדים נעשו קהים</td></tr><tr><td>מגש מכשירים</td><td>Roboz</td><td>RT-1401S</td><td></td></tr><tr><td>מגש מכשירים מכסה</td><td>Roboz</td><td>RT-1401L</td><td></td></tr><tr><td>צלחת פטרי -100 מ"מ</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>087571Z</td><td></td></tr><tr><td>צלחת פטרי-60 מ"מ</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>0875713A</td><td></td></tr><tr><td>צלחת פטרי-35 מ"מ</td> מערכת סינון <td>פישר סיינטיפיק</td><td>0875711YZ</td><td></td></tr><tr><td>(0.22 ומיקרו; m אצטט תאית)-150 מ"ל</td> מערכת סינון <td>431153</td><td></td><td>קורנינג</td></tr><tr><td>(0.22 ומיקרו; m אצטט תאית)-250 מ"ל</td> מערכת סינון <td>430756</td><td></td><td>קורנינג</td></tr><tr><td>(0.22 ומיקרו; m אצטט תאית)-500 מ"ל</td><td>קורנינג</td><td>430758</td><td></td></tr><tr><td>פיפט-אייד פיפטור</td><td>Drummond Scientific Co.</td><td>D57849</td><td></td></tr><tr><td>פיפטה סרולוגית-10 מ"ל</td><td>VWR</td><td>89130-898</td><td></td></tr><tr><td>פיפטה סרולוגית חד פעמית-25 מ"ל</td><td>פיפטה העברה קורנינג</td><td>4251</td><td></td></tr><tr><td>- 7.7 מ"ל</td><td>תרמו סיינטיפיק</td><td>202-20S</td><td></td></tr></tbody></table>

עכבר עוברי פיתוח במערכת סרום ללא תרבות שלמה עובר

Mouse Embryonic Development in a Serum-free Whole Embryo Culture System

עוברי עכברים בשלב אמצע הריון היו בתרבית ניצול מדיום סרום ללא תרבות שהוכן מתוספי תקשורת תאי גזע זמינים באופן מסחרי במערכת תרבות בקבוק מתגלגל מחומצן. עוברי עכברים בE10.5 בודדו בקפידה מתוך הרחם עם שק חלמון בשלמות ובתהליך כרוך תמרון כירורגית מדויק עוברי exteriorized עדינות מצק החלמון, תוך שמירה על ההמשכיות וכלי הדם של העובר עם שק החלמון. בהשוואה לעוברים מוכנים עם שק חלמון ללא פגע או עם שק החלמון הוסר, עובר אלה הוצגו שיעור הישרדות מעולה והתקדמות התפתחותית כאשר בתרבית בתנאים דומים. אנו מראים כי עוברי עכברים אלה, כאשר בתרבית במדיום מוגדר באווירה של 95% O 2/5% CO 2 במנגנון תרבות בקבוק מתגלגל ב37 מעלות צלזיוס במשך שעה 16-40, מפגינים צמיחה והתפתחות מורפולוגית להשוות העוברים מתפתחים ברחם. אנו מאמינים ההשיטה תהיה שימושית עבור חוקרי צורך לנצל תרבות עובר שלמה כדי לחקור אינטראקציות איתות חשובות בorganogenesis העוברי.

פיתוח של עוברי עכברים תלויים לשעבר רחם בגורמים רבים החל מרגע שהרחם הוא מבודד מהגוף לזמן את העוברים בתרבית. כמתואר באיור 1, ההליך כרוך בשורה של צעדים ביניהם, הפרדה של הרחם הרה להולדת מהגוף (איור 1 א), בידודו של עובר עם שק חלמון בשלמותה (איור 1), החצנה של העוברים מצק החלמון ( איור 1 ג) וculturing העוברים בסרום ללא מדיה באווירה של 95% O 2/5% CO 2 במנגנון תרבות בקבוק מתגלגל על 37 ° C. עו...

סרום מנוצל בתרבויות עובר מכיל מרכיבים לא ידועים שיכול להשפיע על התוצאה של ניסויים במיוחד במחקרים שכלל אינטראקציות איתות. כאן אנו מנוצלים מערכת תרבות מחומצן בסרום ללא ולהראות שעוברי עכברים באמצע ההריון תרבותי ל16-40 שעה להפגין פיתוח מורפולוגיים דומה לעוברים המתפתחים ברחם.

Mid-gestation stage mouse embryos were cultured utilizing a serum-free culture medium prepared from commercially available stem cell media supplements in ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא להשתמש במערכת תרבית מחומצנת ללא סרום כדי לחקור ולתפעל היבטים ספציפיים של התפתחות עוברית של עכברים. זה מושג על ידי בידוד הרחם עם עוברים מהעכבר האם. השלב השני הוא להפריד את העוברים עם שק חלמון שלם מדצידואה השליה לאחר דיסקציה סגמנטלית של הרחם.לאחר מכן, יש להוציא את העוברים בעדינות משק החלמון תוך שמירה על שלמות כלי הדם העובריים. השלב האחרון הוא תרבית העוברים במנגנון תרבית בקבוק מתגלגל מחומצן ללא סרום ב-37 מעלות צלזיוס למשך פרק זמן מסוים. בסופו של דבר, כל מערכת תרבית העוברים הזו, התומכת בהתפתחות מבנים שונים הן ברמה המורפולוגית והן ברמה המולקולרית, יכולה לשמש לחקר התפתחות עוברי עכברים באמצעות מגוון טכניקות.שיטה זו יכולה לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה ההתפתחותית, כגון תפקידם של מנגנוני איתות שונים באפיון סולפט ומורפוגנזה של רקמות בעובר יונקים מתפתח. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית מכיוון שבידוד של עוברים עם שק חלמון שלם ושלבי איזמון שלאחר מכן או קשה ללמוד, כל נזק לכלי הדם העוברי או לכלי הדם של אוסאק יכול להשפיע על התפתחות העובר בתרבית. כדי להתחיל, יש לחטא את כל משטחי העבודה ב-70% אלכוהול ולרסס כל פריט לפני הכנסתו למכסה המנוע.כשהוא מוכן, הכינו את מדיום התרבות ואת כל התוספים הדרושים להליך ראשית, הוסיפו את אבקת האלבומין ל- DMEM הנוקאאוט וערבבו היטב עד להמסה מלאה. לאחר מכן, הוסיפו את תוסף ה-N two, KSR, והאנטיביוטיקה מערבבים היטב ומסננים את הסטריליזציה. אחסן את המדיה בצינורות חרוטיים של 50 מיליליטר בארבע מעלות צלזיוס עד שיהיה מוכן לשימוש לפני תחילת הדיסקציה, חממו מראש את התמיסות הדרושות ל-37 מעלות צלזיוס ושמרו על חום לאורך כל ההליך.בשלב זה יש להכין את בקבוקי התרבות ולהניח אותם במנגנון התרבות על מנת להקדים גזים ולשמור עליהם בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. זה גם יחסוך זמן בהעברת העוברים מאוחר יותר. כדי להתחיל, הניחו את החיה שהורדמה על משטח עבודה סטרילי ורססו את משטח הבטן הגחוני באתנול.כדי למנוע משיער להידבק למכשירים, פתח את חלל הבטן כדי לאתר את הרחם. הרם את הרחם בעזרת מלקחיים והשתמש במספריים הפעלה קלים כדי לחתוך בגוף הרחם ובקצות קרני הרחם. כדי להפריד אותו במהירות, שטפו את כל הרחם ב-PBS חם כדי להסיר דם והניחו מיד בצלחת פטרי מלאה ב-DMEM חם.עקר את המכשירים עם אתנול 70% לפני שתמשיך תחת מיקרוסקופ מנתח, נתח את הרחם באופן סגמנטלי עם מספריים הפעלה קלים כדי לייצר פתחים קטנים משני הצדדים. הכנס בעדינות זוג פינצטה מיקרו קהה כדי להרחיב את הפתח כשנשיר השליה חשוף. קרעו אותו בעדינות בעזרת זוג פינצטה מיקרו כדי לחשוף את שק החלמון הקודקודי עם קרום הרייקר.השתמש בקצה אחד של הפינצטה כדי לנקב בעדינות את שניהם ולהפריד אותם משק החלמון הקרביים הבסיסי כדי לחשוף את עוברי העוברים. עם שקי חלמון קרביים שלמים יש להעביר מיד למדיום תרבית חם לאחר ההפרדה מהרחם. כדי לסייע בהתפתחות העובר בתרבית, צרו פתח קטן בשק החלמון בעזרת פינצטה חדה על ידי פירסינג עדין באזור הסמוך לאזור הראש, תוך הקפדה על הימנעות מכלי דם גדולים.לחלופין, ניתן להשתמש בשני זוגות פינצטה קהה כדי להחזיק את שק החלמון ולקרוע בעדינות כדי ליצור פתח קטן. הרחב את הפתח בעזרת הפינצטה לגודל מספיק כדי להתאים לראש העוברי. החזיקו את קרום מי השפיר, עטפו את העובר בעדינות הרחק מהגוף וקרעו אותו בעזרת פינצטה, את הראש העוברי, ובהמשך יש להוציא את העובר כולו בעדינות משק החלמון תוך שמירה על שלמות כלי הדם העובריים.כל נזק לכלי הדם של שק החלמון יכול להשפיע על ההתפתחות ואין להשתמש בעוברים כאלה לתרבות. לאחר מכן, בחנו את העוברים וקבצו אותם לפי קריטריונים מורפולוגיים, כולל גודל גוף וראש, מורפולוגיה של הגפיים והעיניים. שלב אותם על ידי ספירת מספר הסומיטים.העבירו את העוברים מיד לצלחת פטרי עם מדיום תרבית טרי וחם, וקחו אותו למכסה המנוע, שם יש להעביר את העוברים שוב לצלחת פטרי עם אמצעי תרבית סטרילי העובד במכסה המנוע, השתמש בפיפטה מפלסטיק סטרילית כדי להכניס עובר עכבר לכל בקבוק שהוכן קודם לכן. לאחר מכן, נשא את בקבוקי התרבות באופן אספטי למנגנון התרבות. אבטח אותם לדיסק המתגלגל והפעל את הסיבוב.זה מאפשר לעוברים לצוף בחופשיות במדיה וגם מסייע בחילופי גזים חופשיים. גז זורם מצילינדר סמוך לתא ואז לבקבוקים דרך תרבית פקק הגומי. העוברים במשך 16 עד 40 שעות ובודקים באופן קבוע את זרימת הגז וטמפרטורת תא התרבית.יש להחליף לחלוטין את המדיה התרבותית במדיה חדשה במרווחי זמן ספציפיים. עדיף לתת לעוברים להסתגל לתנאי התרבית לפחות 30 דקות לפני ביצוע מניפולציה כלשהי ניתן להשליך עוברים בעלי ביצועים גרועים ומראים פעימות לב חלשות, וניתן להשתמש בעוברים הנותרים המראים פעימות לב טובות למחקרים נוספים. תמונות אלה מדגימות כי עוברים בתרבית משתכפלים בהתפתחות הרחם.כ-58% מהעוברים המתורבתים מציגים התפתחות דומה לעוברים שהתפתחו ברחם. התפתחות ביניים נראית בכ-28% מהעוברים C ו-14% מהעוברים מראים התפתחות לקויה בתרבית D.הבדלים התפתחותיים מתרחשים כאשר עוברי עכבר הם עוברים בתרבית משותפת שנראים דומים בתחילת תרבית משותפת A ו-B מראים הבדלים בהתפתחות העובר שלהם. לאחר 16 שעות, A ו-B ברגע ששולטים, ניתן לבצע טכניקה זו תוך 25 עד 30 דקות לגודל מאוחר יותר של 10 עד 12 עוברים.מצאנו שמערכת תרבית עוברים זו היא תוספת חשובה למחקרי envivo שלנו על התפתחות עוברית.

mouse-embryonic-development-serum-free-whole-embryo-culture

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

וידאו זה מדגים תרבות חדש, שיטה שבאמצעותה הם עוברים חומוס בתרבית מחוץ הביצה עד 24 שעות. שיטה זו מאפשרת ללמוד פיתוח מוקדם (פס פרימיטיביים עד 14 סום.), תקופה המקבילה E7-9 בעכבר. יישומים של טכניקה זו כוללים electroporation, ב הכלאה אימונוהיסטוכימיה באתרו.

שיטת לתרבות מוקדם של עוברים צ&#39;יק לשעבר vivo (תרבות חדש)

במאמר זה, אנו מציגים מתודולוגיה פשוטה כדי לאפשר לטווח...

לשעבר אובו העובר עוף התרבות מתאים ליישומים הדמיה microsurgery מערכת

שיטה המאפשרת מניפולציה תרופתי ישירה של עוברי עכברים במהלך neurulation עוקף מטבוליזם אימהית מתואר. הטכניקה ניתן להתאים ללמוד היבטים שונים של neurulation על ידי שינוי נקודת זמן סוכן תרופתי.

Tube סגירת עצבית בתרבות העובר שלם עכבר

תרבית עובר שלם של יונקים (WEC) נמצאת בשימוש נרחב בטרטולוגיה ובביולוגיה התפתחותית. סרום חולדות צנטריפוגה מיידי מסופק בדרך כלל כמדיום הן ל-WEC של עכבר והן לחולדות. בסרטון זה, אנו מדגימים את הפרוטוקול הסטנדרטי שלנו להכנת סרום חולדות איכותי המתאים ל-WEC של יונקים.

הכנת סרום העכברוש מתאים לתרבות עובר שלמה יונקים

פרוטוקול זה מתאר בפירוט את השיטה ליצירת אבות עצביים מתאי גזע עובריים בשיטה חד-שכבתית נטולת סרום. ניתן להשתמש באבות אלה כדי לגזור סוגי תאים עצביים בוגרים או לחקור את תהליך המפרט העצבי והם ניתנים לקנה מידה של פורמט מרובה בארות עבור סינון מורכב.

בידול עצבי של תאי עכבר גזע עובריים בסרום ללא חד שכבתי תרבות

פרוטוקול זה מספק שיטה לאיסוף תאי גזע עוברי בעכבר (המסקלין) בינוני -conditioned (המסקלין-CM) נגזר סרום (נסיוב שור עוברי, FBS) - ומזין (פיברובלסטים עובריים בעכבר, MEFs) תנאים -חינם עבור תא גישת -חינם. זה עשוי להיות רלוונטי לטיפול הזדקנות ומחלות הקשורות להזדקנות.

אוסף של Serum- ומזין ללא עכבר גזע עובריים בינוני מותנה-Cell לגישה Cell-חינם

כאן, אנו מציגים organotypic culturing פרוטוקול לגדול עוף עובריים באיברים במבחנה. באמצעות שיטה זו, התפתחות עובריים עוף רקמות ניתן יהיה ללמוד, תוך שמירה על רמה גבוהה של שליטה על הסביבה תרבות.

שיטת Organotypic תרבות ללמוד על התפתחות עובריים עוף רקמות

פלטפורמה משופרת לתרבות העוברים המלאים מאפשרת פיתוח רחם אקס רציף וחזק של עוברי עכבר לאחר ההשתלה עד שישה ימים, משלבי טרום ההדבקה ועד לאורגנוגנזה מתקדמת. בפרוטוקול זה, אנו מפרטים את ההליך הסטנדרטי לתרבות עוברית מוצלחת באמצעות לוחות סטטיים ומערכות בקבוק מסתובבות.

רחם לשעבר תרבות של עוברי עכבר מ pregastrulation כדי Organogenesis מתקדם

אנו מציגים פרוטוקול מפורט לתרבית והדמיית עוברי עכבר המאפשר הדמיה תלת ממדית + זמן של תאי אב לבביים. ערכת כלי וידאו זו מתייחסת למיומנויות המפתח הנדרשות להדמיה חיה מוצלחת שאחרת קשה לרכוש מפרסומים של טקסט בלבד.

הדמיה חיה של אבות לב מוקדמים בעובר העכבר

פרוטוקול זה מתאר מתודולוגיות לביסוס מודל פשוט ויעיל להשתלת עוברים במבחנה להערכת המולקולות הרלוונטיות המשפיעות על תהליך השתלת העוברים.

הקמת מודל השתלת עוברים במבחנה

פרוטוקול זה מתאר הליכים לבשלות חוץ-גופית של ביציות עכברים, הפריה חוץ-גופית , ותרבות עוברים לשלב הבלסטוציסט.

ביציות עכברים בבגרות במבחנה, הפריה ותרבות עוברים לפני ההשתלה

למד שיטת תרבית עוברים ללא סרום מחמצנת לעכברים עובריים. שיטה זו מאפשרת מחקר מדויק של התפתחות עוברית תוך שמירה על שלמות כלי הדם והתפתחות מורפולוגית דומה לתנאי רחם.

עכבר עוברי פיתוח במערכת סרום ללא תרבות שלמה עובר

גלה סרטונים נוספים