Name: Luminometric ושמרים Xenopus ביצית בחינות אלקטרו של Mechanosensitivity המולקולרי של TRPV4 (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-31T13:15:00.000+00:00
Duration: 12 min 9 s
Description: חקור את הרגישות המכנית של ערוץ היונים TRPV4 בשיטות לומינומטריה ואלקטרופיזיולוגיה בביצי Xenopus ובתאי שמרים. שיטות אלו מאפשרות ניתוח כמותי של תגובות הערוץ לגירויים מכניים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ברצוננו להודות לאנדריאה Kremsreiter לקבלת סיוע טכני מעולה. עבודה במעבדה שלנו היא נתמכת על ידי NIH GM096088 והאמון וילאס באוניברסיטת ויסקונסין - מדיסון.

1. שיטות Luminometry השמרים השתמש BYYT זן של שמר אפייה. זה yvc1-tok1 נגזר של BY4741 (מאטה, ura3D0, his3D1, leu2D0, lys2D0, yvc1 :: HIS3, tok1 :: kanMX4). להפוך לתאים עם pEVP1/Aeq Leu לבחירה להביע aequorin פלסמיד והעכברוש-להביע TRPV4 פלסמיד ura לבחירת p416GPDV4, כפי שתואר בBatiza et al. 26 וLoukin et al. 24 שיטות סטנדרטיות שימוש בבניית פלסמיד ושינוי 27 . זן שמרים ופלסמידים זמינים לפי בקשה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות 2 מיליליטר של שמרי תאי הלילה לשלב שלאחר לוגריתמים שייקרו 30 מעלות צלזיוס בLeu-ura-&quot;DCD&quot; בינוני נשירת 28 (גרסה המדולדלת סולפט של מדיום CMD-Leu-ura 29), בתוספת סורביטול 1M . לחסן 200 μl של תרבויות אלה לתוך 1.8 מיליליטר של מדיום טרי בתוספת 2 מיקרומטר של lucifericoelenterazine n. לגדול בחושך בטמפרטורת חדר למשך שעה 24 אחרת בלי ללחוץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את osmolarity של התרבות (בדרך כלל ב1,400 mOsM) ופתרונות אחרים (להלן) באמצעות osmometer לחץ אדים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquot 20 μl של תרבות הטרי לתוך צינור luminometer 12 מ&quot;מ לluminometer צינור יחיד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להלם hypotonic, להוסיף 200 μl של פתרון, המכיל 25 מ&quot;מ NaEGTA (pH 7.2) או שמות (pH 7.2) ו500-100 mM NaCl, (osmolarity הכולל של 1,200-400 mOsM) בהתאם לרמה של ההלם הרצוי. ברציפות לפקח על הארה לפני ולפחות 120 שניות לאחר downshock האוסמוטי, שנקטע רק על ידי פעולת דילול הקצרה. הירשם פלט luminometer במחשב שולחני כיחידות יחסי הארה (רול). </li></ol> אמנם לא ללימוד TRPV4 המהונדס, השתמשנו גרסה של הפרוטוקול הנ&quot;ל במערכת אוטומטית לבחון את תגובותיהם של מספר גדול של זני שמרים. o מחקרf התגובות להיפו 30 או 31 בגירויי hyperosmotic של deletome השמרים (האוסף של deletants גן יחיד 4,906 שמרים) באמצעות luminometer microplate וניתחו עם תוכנה מקבילה היו מוצלחות. 2. ו -3. שיטות אלקטרופיזיולוגיה ביצית אלקטרופיזיולוגיה משתמשת בשיטות בסיסיות 32. PCR להגביר את המסגרת הפתוחה קריאה של wild-type או TRPV4 מוטציה באמצעות איכות גבוהה פולימראז PfuUtra והשתלב pGH19 33. זה כרוך בהחדרה מדויקת של ORF בין 5 &#39;ו 3&#39; UTRs של גן גלובין β Xenopus ומורד הזרם של אמרגן RNA-פולימראז T7. Linearize המבנה במורד הזרם של UTR &#39;3 ומשמש כתבניות בתגובה במבחנה פולימראז T7-RNA. השתמש בטכניקות מולקולרית ביולוגיות סטנדרטיות 34. השתמש בביציות V-VI שלב מX. laevis. גידול בעלי חיים, ovariecto חלקישלי, הסרת מעטפת defolliculation, וvitelline בצע את הליכים סטנדרטיים 32,33,35. הזרק 2-40 ננוגרם של פתרון קרן לביצית באמצעות microinjector האוטומטי דראמונד Nanoinject השני. הזרק ~ 30 ביציות עבור כל קבוצה של ניסויים. לאחר הזרקת TRPV4-קרן, דגירה הביציות במדיום ND96 עם גנטמיצין (100 מיקרוגרם / מיליליטר) ורותניום 1 מיקרומטר אדום 14. 2. שתי אלקטרודה מתח קלאמפ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוך טפטפות הקלטת זכוכית ורוסיליקט מmicropipettes חד פעמי דיוק 100 μl בנפרד עם חולץ פיפטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוך את שני מתח מדידה ואלקטרודות פיפטה הזרקה שוטפות נמשכים יש צמצם קצה ~ 1 מיקרומטר קוטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אלקטרודות למילוי עם 2 M KCl וכתוצאה מכך 0.1-0.2 התנגדות mΩ. לעלות אותם על headstages HS2A, אשר יחד עם מהדק מרחץ מקורקע וירטואלי VG-2Ax100, מחוברים לממשק מגבר GeneClamp 500 דרך digitizer Digidata 1440. לרכוש<html> הנתונים באמצעות תוכנת pClamp10. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הביצית להיבדק באמבט 1 מיליליטר בתא פלסטיק מפוברק רכוב על הבמה של מיקרוסקופ לנתח עם ההגדלה 20X. פתרון האמבטיה הוא על ידי גשר אגר 3 M KCl וחוט כסף כלור ממוקם קרוב לביצית ומחובר לבמת קרקע הווירטואלית VG-2A-מקורקע וירטואלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבנות את החדר לזלוף רציף עם tubings פלסטיק כפתרון כניסה ויציאה. חבר את צינורות היניקה מחוברים למערכת זלוף מפוברקת, שהוא סעפת של שישה פגזים 50 מזרק מיליליטר, כל אחת מלאה בפתרון אחר. שיעורי עדכון כובד של פתרון מסוים הוא נשלט ל~ 2-3 מיליליטר / דקה באמצעות מהדק רמפה &quot;קק&quot; על tubings. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר שני אלקטרודות עם headstages על micromanipulators. לבצע חדירות האלקטרודה של הביצית על ידי מיקרומניפולציה. </li></ol> 3. הצמד תיקון בחינת ישיר Mechanosensitivity &quot;&gt; השיטות הבסיסיות של מהדק תיקון כולל הכנת פיפטה, היווצרות GΩ-חותם, והיווצרותם של תאים או במצבים נכרת הן אלה בהאמיל et al. 36 ומחולית 32. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא טפטפות זכוכית ורוסיליקט עם פתיחה ~ 1 מיקרומטר קוטר בקצה (מספר הבועה 5-6) עם 98 מ&quot;מ KCl, 1 מ&quot;מ MgCl 2, ו10 מ&quot;מ K +-HEPES, pH 7.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף את פיפטה מהדק תיקון באמצעות צינורות פלסטיק למזרק 5 מ&quot;ל ובאמצעות T-משותף, גם מד לחץ. להשתמש במחשב כדי לטפל בשתי האלקטרודה ותפוקות מד הלחץ. רוכשת את הנתונים ב10 קילוהרץ, ולאחר מכן לנגן דרך מסנן שמונה מוט בסל בקילוהרץ 1 לניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתן נכרת מאותה הביצית תיקונים שונים שוב ושוב. נוהג זה הופך את הבדיקה של הפעילות המולקולרית של TRPV4 יותר יעילה ואמינה. </li></ol>

<ol><li>Ramsey, I. S., Delling, M., Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+introduction+to+TRP+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Physiol%22%5BJournal%5D)">An introduction to TRP channels.</a> Annu. Rev. Physiol. 68, 619-647 (2006).</li>
<li>Nilius, B., Owsianik, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transient+receptor+potential+family+of+ion+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">The transient receptor potential family of ion channels.</a> Genome Biol. 12, 218 (2011).</li>
<li>Everaerts, W., Nilius, B., Owsianik, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+vallinoid+transient+receptor+potential+channel+Trpv4%3A+From+structure+to+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Biophys.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The vallinoid transient receptor potential channel Trpv4: From structure to disease.</a> Prog. Biophys. Mol. Biol. , (2009).</li>
<li>Nilius, B., Voets, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+puzzle+of+TRPV4+channelopathies%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep.%22%5BJournal%5D)">The puzzle of TRPV4 channelopathies.</a> EMBO Rep.. , (2013).</li>
<li>Liedtke, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vanilloid+receptor-related+osmotically+activated+channel+%28VR-OAC%29%2C+a+candidate+vertebrate+osmoreceptor%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Vanilloid receptor-related osmotically activated channel (VR-OAC), a candidate vertebrate osmoreceptor.</a> Cell. 103, 525-535 (2000).</li>
<li>Strotmann, R., Harteneck, C., Nunnenmacher, K., Schultz, G., Plant, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OTRPC4%2C+a+nonselective+cation+channel+that+confers+sensitivity+to+extracellular+osmolarity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">OTRPC4, a nonselective cation channel that confers sensitivity to extracellular osmolarity.</a> Nat. Cell Biol. 2, 695-702 (2000).</li>
<li>Wissenbach, U., Bodding, M., Freichel, M., Flockerzi, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trp12%2C+a+novel+Trp+related+protein+from+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Trp12, a novel Trp related protein from kidney.</a> FEBS Lett. 485, 127-134 (2000).</li>
<li>Delany, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+a+novel+human+vanilloid+receptor-like+protein%2C+VRL-2%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Genomics%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of a novel human vanilloid receptor-like protein, VRL-2.</a> Physiol. Genomics. 4, 165-174 (2001).</li>
<li>Rock, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gain-of-function+mutations+in+TRPV4+cause+autosomal+dominant+brachyolmia%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Gain-of-function mutations in TRPV4 cause autosomal dominant brachyolmia.</a> Nat. Genet. 40, 999-1003 (2008).</li>
<li>Krakow, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+the+gene+encoding+the+calcium-permeable+ion+channel+TRPV4+produce+spondylometaphyseal+dysplasia%2C+Kozlowski+type+and+metatropic+dysplasia%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Hum.+Genet%22%5BJournal%5D)">Mutations in the gene encoding the calcium-permeable ion channel TRPV4 produce spondylometaphyseal dysplasia, Kozlowski type and metatropic dysplasia.</a> Am. J. Hum. Genet. 84, 307-315 (2009).</li>
<li>Camacho, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dominant+TRPV4+mutations+in+nonlethal+and+lethal+metatropic+dysplasia%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Med.+Genet.+A%22%5BJournal%5D)">Dominant TRPV4 mutations in nonlethal and lethal metatropic dysplasia.</a> Am. J. Med. Genet. A. 152, 1169-1177 (2010).</li>
<li>Voets, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+determinants+of+permeation+through+the+cation+channel+TRPV4%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Molecular determinants of permeation through the cation channel TRPV4.</a> J. Biol. Chem. 277, 33704-33710 (2002).</li>
<li>Watanabe, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+TRPV4+gating+by+intra-+and+extracellular+Ca2%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Modulation of TRPV4 gating by intra- and extracellular Ca2.</a> Cell Calcium. 33, 489-495 (2003).</li>
<li>Loukin, S., Zhou, X., Su, Z., Saimi, Y., Kung, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wild-type+and+brachyolmia-causing+mutant+TRPV4+channels+respond+directly+to+stretch+force%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Wild-type and brachyolmia-causing mutant TRPV4 channels respond directly to stretch force.</a> J. Biol. Chem. 285, 27176-27181 (2010).</li>
<li>Gao, X., Wu, L., O'Neil, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature-modulated+diversity+of+TRPV4+channel+gating%3A+activation+by+physical+stresses+and+phorbol+ester+derivatives+through+protein+kinase+C-dependent+and+-independent+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Temperature-modulated diversity of TRPV4 channel gating: activation by physical stresses and phorbol ester derivatives through protein kinase C-dependent and -independent pathways.</a> J. Biol. Chem. 278, 27129-27137 (2003).</li>
<li>Watanabe, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anandamide+and+arachidonic+acid+use+epoxyeicosatrienoic+acids+to+activate+TRPV4+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Anandamide and arachidonic acid use epoxyeicosatrienoic acids to activate TRPV4 channels.</a> Nature. 424, 434-438 (2003).</li>
<li>Vriens, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+swelling%2C+heat%2C+and+chemical+agonists+use+distinct+pathways+for+the+activation+of+the+cation+channel+TRPV4%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Cell swelling, heat, and chemical agonists use distinct pathways for the activation of the cation channel TRPV4.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 396-401 (2004).</li>
<li>Vincent, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+novel+TRPV4+modulators%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of novel TRPV4 modulators.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 389, 490-494 (2009).</li>
<li>Willette, R. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+activation+of+the+transient+receptor+potential+vanilloid+subtype+4+channel+causes+endothelial+failure+and+circulatory+collapse%3A+Part+2%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Exp.+Ther%22%5BJournal%5D)">Systemic activation of the transient receptor potential vanilloid subtype 4 channel causes endothelial failure and circulatory collapse: Part 2.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 326, 443-452 (2008).</li>
<li>Thorneloe, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+orally+active+TRPV4+channel+blocker+prevents+and+resolves+pulmonary+edema+induced+by+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">An orally active TRPV4 channel blocker prevents and resolves pulmonary edema induced by heart failure.</a> Sci. Transl. Med. 4, (2012).</li>
<li>Kang, S. S., Shin, S. H., Auh, C. K., Chun, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+skeletal+dysplasia+caused+by+a+constitutive+activated+transient+receptor+potential+vanilloid+4+%28TRPV4%29+cation+channel+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Human skeletal dysplasia caused by a constitutive activated transient receptor potential vanilloid 4 (TRPV4) cation channel mutation.</a> Exp. Mol. Med. 44, 707-722 (2012).</li>
<li>Lamande, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+TRPV4+cause+an+inherited+arthropathy+of+hands+and+feet%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Mutations in TRPV4 cause an inherited arthropathy of hands and feet.</a> Nat. Genet. 43, 1142-1146 (2011).</li>
<li>Loukin, S., Su, Z., Kung, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+Basal+Activity+Is+a+Key+Determinant+in+the+Severity+of+Human+Skeletal+Dysplasia+Caused+by+TRPV4+Mutations%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Increased Basal Activity Is a Key Determinant in the Severity of Human Skeletal Dysplasia Caused by TRPV4 Mutations.</a> PLoS One. 6, (2011).</li>
<li>Loukin, S. H., Su, Z., Kung, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypotonic+shocks+activate+rat+TRPV4+in+yeast+in+the+absence+of+polyunsaturated+fatty+acids%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Hypotonic shocks activate rat TRPV4 in yeast in the absence of polyunsaturated fatty acids.</a> FEBS Lett. 583, 754-758 (2009).</li>
<li>Loukin, S., Su, Z., Zhou, X., Kung, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forward+genetic+analysis+reveals+multiple+gating+mechanisms+of+TRPV4%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Forward genetic analysis reveals multiple gating mechanisms of TRPV4.</a> J. Biol. Chem. 285, 19884-19890 (2010).</li>
<li>Batiza, A. F., Schulz, T., Masson, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+respond+to+hypotonic+shock+with+a+calcium+pulse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Yeast respond to hypotonic shock with a calcium pulse.</a> J. Biol. Chem. 271, 23357-23362 (1996).</li>
<li>Amberg, D. C., Burke, D., Strathern, J. N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAmberg%2C+DC+%22Methods+in+Yeast+Genetics%3A+a+Cold+Spring+Harbor+Laboratory+Course+Manual%22">Methods in Yeast Genetics: a Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. (2005).</li>
<li>Loukin, S., Zhou, X., Kung, C., Saimi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genome-wide+survey+suggests+an+osmoprotective+role+for+vacuolar+Ca2%2B+release+in+cell+wall-compromised+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">A genome-wide survey suggests an osmoprotective role for vacuolar Ca2+ release in cell wall-compromised yeast.</a> FASEB J. 22, 2405-2415 (2008).</li>
<li>Denis, V., Cyert, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Internal+Ca%282%2B%29+release+in+yeast+is+triggered+by+hypertonic+shock+and+mediated+by+a+TRP+channel+homologue%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Internal Ca(2+) release in yeast is triggered by hypertonic shock and mediated by a TRP channel homologue.</a> J. Cell. Biol. 156, 29-34 (2002).</li>
<li>Loukin, S. H., Kung, C., Saimi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+perturbations+sensitize+osmotic+down-shock+activated+Ca2%2B+influx%2C+a+yeast+%26%2334%3Bdeletome%26%2334%3B+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Lipid perturbations sensitize osmotic down-shock activated Ca2+ influx, a yeast &#34;deletome&#34; analysis.</a> FASEB J. 21, 1813-1820 (2007).</li>
<li>Loukin, S. H., Zhou, X. -L., Kung, C., Saimi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genome-wide+survey+suggests+an+osmo-protective+role+for+vacuolar+Ca2%2B+release+in+cell-wall-compromized+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">A genome-wide survey suggests an osmo-protective role for vacuolar Ca2+ release in cell-wall-compromized yeast.</a> FASEB J. 22, 2405-2415 (2008).</li>
<li>Conn, P. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aConn%2C+PM+%22Methods+in+Enzymology%22">Methods in Enzymology</a>. 294, Academic Press. (1999).</li>
<li>Iverson Rudy, L. E. Methods in Enzymology. 207, Harcourt Brace Jovanovich. 279-298 (1992).</li>
<li>Loukin, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Random+mutagenesis+reveals+a+region+important+for+gating+of+the+yeast+K%2B+channel+Ykc1%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Random mutagenesis reveals a region important for gating of the yeast K+ channel Ykc1.</a> EMBO J. 16, 4817-4825 (1997).</li>
<li>Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch+clamp+recording+of+ion+channels+expressed+in+Xenopus+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Patch clamp recording of ion channels expressed in Xenopus oocytes.</a> J. Vis. Exp. , (2008).</li>
<li>Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+patch-clamp+techniques+for+high-resolution+current+recording+from+cells+and+cell-free+membrane+patches%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches.</a> Pflugers Arch. 391, 85-100 (1981).</li>
<li>Maroto, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRPC1+forms+the+stretch-activated+cation+channel+in+vertebrate+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">TRPC1 forms the stretch-activated cation channel in vertebrate cells.</a> Nat. Cell Biol. 7, 179-185 (2005).</li>
</ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

כאמור במבוא, השיטות נפוצות ללמוד פונקציות TRPV4 לעתים הסתיימו בסתירות ומחלוקות. שתי קבוצות של שיטות שתוארו כאן מציעות כמה יתרונות והוא יכול להשלים את השיטות הקיימות. למרות שאנו רק לתאר מחקרים על TRPV4, השיטות ניתן להאריך ללמוד תעלות יונים אחרות גם כן. 1. שיטות Luminometry השמרים יש שמרי ניצני Ca 2 + תגובה-זרם יליד הלם היפו אוסמוטי, כי ה...

TRPS (פוטנציאלי קולטן חולפים) מהווה שבעה subfamilies ערוצי קטיון המשרתים פונקציות חושיות 1,2. ביונקים, TRPV, תת משפחת vanilloid של TRPS, יש שישה סוגים. TRPV4 (סוג 4) 3,4 מגיב לחום, כימיקלים מסוימים, נפיחות האוסמוטי, או מאמץ גזירה. גן TRPV4 היה מבודד שוב ושוב על ידי מועמד גן ו / או ביטוי שיבוט 5-8. השיטה השנייה ואחרי התגובה של מוצר הגן להיפו אוסמולריות. TRPV4 בא לידי ביטוי כמעט בכל איברים ופונקציות בפיתוח, הפיסיולוגיה, פתולוגיה או של סוגי תאים שונים רבים 3,4. בולט הם&gt; 50 מוטציות TRPV4 אוטוזומלית דומיננטיות אנושי, גורם נוירופתיה היקפית ו / או dysplasias שלד (ליקויים בהתפתחות שלד) 9-11. Dysplasias השלד נע בין סוג brachyomia קל 3 (סוג 3 גמדות), סוג קוזלובסקי דיספלזיה spondylometaphyseal, לseveמחדש dysplasias, חלקם בגרימת מוות בילוד או עוברי. למרות כל הנימוסים של מנגנונים נראים אפשריים, אף מסביר את הגיוון, את המורכבות, השתנות, ומדי פעם חפיפות של מחלות אלו 4. כמו ערוצים אחרים TRP 1, TRPV4 הוא tetramer. בחולדה או TRPV4 אדם, כל מקטע הוא כלל 871 שאריות. האלמנט המרכזי שלה הוא הטרנסממברני שישה סלילים (S1-S6), שסביר להניח שמסודרים בצורה דומה ל-K + ערוצי מתח מגודרת. שם, S1 לS4 מהווה תחום היקפי וS5 S6 ויוצרים תחום הנקבובית חלחול. בין S5 ו S6 של TRPV4 הוא סליל נקבובית קצר אחרי LDLFKLTIGMGDL הרצף, ארבעה מהם להתכנס ככל הנראה כדי ליצור את מסנן קטיון. קטע cytoplasmic N-מסוף 470 השאריות מכיל 6 חזרות ankyrin, היודע להתקשר לחלבונים או ligands הקטן. קטע cytoplasmic 152 שאריות C-המסוף כולל רצף מחייב calmodulin בין אתרים אפשריים אחרים אשר נקלטות otהאלמנטים שלה 3. TRPV4 הוא ערוץ קטיון שלמעשה אינו כולל אניוני 1. בעוד התפקוד הפיזיולוגי שלה הוא transduce גירויים לCa 2 + זרם, הוא גם חדיר לקטיונים אחרים עם רצף חדירות אייזנמן IV, לטובת דו ערכית בCa P: P Na 7 ~ 12V. מוליכות ערוץ יחיד מתקנת ב ~ 90 PS 40 PS כלפי חוץ וכלפי פנים ~ 6,13,14. הביע Heterologously יכול להיות מופעל נוכחית (להלן) על ידי נפיחות היפו אוסמוטי, מאמץ גזירה, או חום 15. כמו כן, מופעל על ידי חומצות שומן רבות בלתי רוויות שומן 16,17 ואסתר phorbal הסינתטי 4αPDD 18. בשלב נוכחי, אגוניסט החזק ביותר הוא GSK1016790A 19 ואנטגוניסט הוא GSK2193874, יעיל ב10 -9 ל10 -8 M 20, שניהם התגלו על ידי תפוקה גבוהה, מסך קטן מולקולרי. שני תחומים מרכזיים של מחקר TRPV4 יישארו מבלבל: (1) גם כTRPV4 נלמד במידה רבה לmechanosensitivity, הבסיס המולקולרי שלה הוא שנוי במחלוקת. מודל אחד מתאר היפו osmolarity איכשהו מפעיל פוספוליפאז A2 (PLA2) כדי לייצר את חומצת שומן רב בלתי רווי (PUFA) חומצה ארכידונית (AA), אשר מומרת epoxyeicosatrienoic חומצה (EET) על ידי epoxygenase, ואת הכריכה של EET מפעילה TRPV4 16, 17. ובכל זאת, TRPV4 עצמו הוכח להגיב ישירות לקרום למתוח 14 (להלן), ומספק הסבר פשוט יותר. (2) פתולוגיות המוטציה TRPV4 הם מבלבלים. בבסיס, צריך לדעת אם המחלות הן תוצאה של האובדן, הירידה, או העלייה של פעילות ערוץ. גם כאן, הספרות היא רחוק מלהיות ברור. בעוד אללים שלד-דיספלזיה מרובות דווחו ליש פעילות גבוהה יותר, (, GOF לזכות-of-פונקציה) 4,21, כמה דווחו לצמצם פעילות (, LOF אובדן של פונקציה) 10,22. לימוד שיטתי של 14 אללים מצא אותםכל המוטציות שGOF (להלן) 23. נראית את הטענה כי חלקם LOFs לסתור את הפנוטיפ של trpV4-/ - עכבר בנוקאאוט, שהם ברי קיימא או פורה, עם פגמים קלים בלבד, למרות אובדן תפקוד TRPV4 מלא. חלק מהמחלוקות אלה יש מוצא מתודולוגי. מעבדות להשתמש בשיטות שונות, או גרסאות של שיטה אחת, ומעסיקות תקני שיפוט שונים. הנפוץ ביותר, TRPV4 מתבטא transiently בתאי יונקים בתרבית (HEK, CHO, הלה) והעלייה פנימי [Ca 2 +] על אגוניסט או גירוי hypotonic רשום עם Ca 2 + צבע פלואורסצנטי רגיש, הפורע-2. הסתמכות היתר על assay fluorometric זה זכתה לביקורת 1. רמת הביטוי באוכלוסיות שונות, ההפצה בו, כמו גם את ריכוז הצבע היעיל, צריכה להיות מבוקרת ומתועדת. יותר אמין הוא בדיקות אלקטרו הישירות. גם זה, כמו commonly התאמן, הוא גם לא בלי בעיות. מכיוון שרמות הביטוי בתאים בתרבית בודדות הן קשות לשליטה, יש לי כל תא זרמים וריאציות גדולות. יתר על כן, מכיוון שהזרמים קטנים, נתונים סטטיסטיים אמינים יצטרכו להסתמך על מדגמים גדולים, לעתים קרובות לא מעשיים. בדיקות תיקון מהדק רק לעתים נדירות כבר בוצעו. כמה הקלטות כאלה מראות אשכולות של פרצי פעילות שהופכים את ההערכה סטטיסטית מאתגרת 16,17. כדי להבין טוב יותר mechanosensitivity המולקולרי, פיתחנו שתי מערכות נוספות כדי לבחון TRPV4. (1) כדי לבודד TRPV4 מהשותפים של היונקים הרגילים שלו, יש לנו הביע TRPV4 עכברוש בשמרי ניצני 24. ביטוי תפקודי של TRPV4 בהקשר אבולוציונית רחוק זה הראה שזה יכול עדיין להגיב לכוח האוסמוטי ללא שותפים הרגילים שלו. מכיוון ששמרים אינו PUFAs כגון AA או EET, ויש לו את הגנום שלו אין גנים PLA2 או epoxygenase, expre זהssion גם מראה כי הם אינם נדרשים לTRPV4 לחוש בכוח. לאחר TRPV4 באאוקריוטים ביולוגי נוחים ביותר המולקולריים גם מאפשר מניפולציות יעילים קדימה או לאחור גנטיות 25. (2) עבור ניתוחי biophysical מעמיקים של TRPV4, הבענו TRPV4 ב ביציות Xenopus. שלא כמו תאים בתרבית, אשר יניבו תת Na Na ל( 10 -10 ל10 -9) זרמים, ביצית מבטאת זרמים בμA של (10 -6 ל10 -4). אות גדולה בהרבה מעל הרעש מאפשרת כימות והשוואה בטוחה יותר טובות יותר. TRPV4, כך באו לידי ביטוי, יכול גם להיבחן כמולקולות בודדות באמצעות מהדק תיקון. ביצית אחת מאפשרת דגימת תיקון חוזר ונשנה, מה שהופך שוב כימות אמין יותר. מחקרים כאלה הראו כי ערוץ TRPV4 עצמו יכול באופן ישיר להיות מופעל על ידי כוח מתיחת קרום 14. ניתוח הראה גם כי 14 אללים שלד-דיספלזיה נציג כל מוטציות הרווח של הפונקציה. יתר על כן, degrEE של דליפה + זה מכונן Ca 2 מקביל לחומרת המחלות שלד 23. בגלל החידוש והתועלת שלהם, הנהלים מפורטים של שתי שיטות אלה הם התאספו כאן כדי לאפשר משוכפלים במחקר עתידי על TRPV4 או ערוצים דומים.

<table><tbody><tr><td>מד אוסמומטר לחץ אדים</td><td>Wescor</td><td>Wescor 5500</td><td>לוגן, יוטה, ארה"ב</td></tr><tr><td>סיריוס צינור יחיד לומינומטר&nbsp;</td><td>טיטרטק-ברהולד</td><td>סיריוס</td><td>האנטסוויל, לוס אנג'לס, ארה"ב</td></tr><tr><td>מד לומינומטר מיקרופלייט</td><td>טיטרטק-ברטולד</td><td>מיתרס LB940</td><td>האנטסוויל, לוס אנג'לס, ארה"ב</td></tr><tr><td>תוכנת לומינומטריה</td><td>Titertek-Berthold</td><td>MikroWin2000</td><td>האנטסוויל, לוס אנג'לס, ארה"ב</td></tr><tr><td>מהדק תיקון ותוכנה</td><td>Axon Instrument</td><td>HS2A headstage, VG-2Ax100 מהדק אמבטיה מקורקע וירטואלי, מגבר GeneClamp 500, דיגיטייזר digidata 1440, תוכנת pClamp10</td><td>יוניון סיטי, קליפורניה, ארה"ב</td></tr><tr><td>מנומטר</td><td>ביו-טק</td><td></td><td>Winooski, VT, ארה"ב</td></tr><tr><td>מושך פיפטה</td><td>Sutter Instrument Co</td><td>דגם P-97</td><td>נובאטה, קליפורניה, ארה"ב</td></tr><tr><td>מיקרו-מזרק</td><td>Drummond Scientific</td><td>Nanoinject II</td><td>Broomall, PA, ארה"</td></tr><tr><td>ב Luciferin coelenterazine</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>Carlsbad, CA, USA</td></tr><tr><td>T7 RNA פולימראז תגובה</td><td>אמביון</td><td>mMessage mMachine</td><td>אוסטין, טקסס, ארה"</td></tr><tr><td>ב Gentamicin</td><td>Sigma</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>רותניום אדום&nbsp;</td><td>סיגמא</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>מיקרופיפטות&nbsp;</td><td>Drummond</td><td>100 מיקרוליטר מיקרופיפט</td><td>Broomall, PA, ארה"ב</td></tr><tr><td>PfuUtra פולימראז בנאמנות גבוהה&nbsp;</td><td>סטרטג'ן</td><td></td><td>לה ג'ולה, קליפורניה, ארה"ב</td></tr></tbody></table>

luminometric ושמרים xenopus ביצית בחינות אלקטרו של mechanosensitivity המולקולרי של trpv4

Yeast Luminometric and Xenopus Oocyte Electrophysiological Examinations of the Molecular Mechanosensitivity of TRPV4

TRPV4 (חלוף קולטן פוטנציאלים, משפחת vanilloid, סוג 4) באו לידי הביטוי באופן נרחב ברקמות חוליות ומופעל על ידי מספר גירויים, ובכלל זה על ידי כוחות מכאניים. מוטציות TRPV4 מסוימות לגרום לעצם תורשתי מורכב או פתולוגיות עצביות בבני אדם. transgenes Wild-type או TRPV4 המוטציה באים לידי ביטוי בדרך כלל בתאי יונקים בתרבית ונבדק על ידי הפורע-2 fluorometry ועל ידי אלקטרודות. במונחים של המנגנון mechanosensitivity והבסיסים המולקולריים של המחלות, הספרות הנוכחית היא מבלבלת ושנויה במחלוקת. כדי להשלים את השיטות קיימות, אנו מתארים שתי שיטות נוספות כדי לבחון את המאפיינים המולקולריים של TRPV4. (1) החולדה TRPV4 וtransgene aequorin הופכים שמרי ניצנים. הלם היפו osmtic מאוכלוסיית transformant תשואות אות luminometric בשל שילוב של aequorin עם Ca 2 +, שוחררה דרך ערוץ TRPV4. הנה TRPV4 מבודד מחלבונים היונקים הרגילים שלו השותףומגלה mechanosensitivity משלו. (2) קרנה של TRPV4 מוזרקת לתוך ביציות Xenopus. לאחר תקופה מתאימה של דגירה, הנוכחי TRPV4 מקרוסקופית נבחן עם מהדק מתח שתי אלקטרודות. העלייה הנוכחית עם הסרת osmoticum אינרטי מאמבטית הביצית מעידה על mechanosensitivity. זרמי microAmpere (10 -6 ל10 -4) מביציות הם הרבה יותר גדולים מאשר זרמי subnano לnanoAmpere (10 -10 ל10 -9) מהתאים בתרבית, מניב quantifications והערכות בטוחים יותר ברורים יותר. זרמים מיקרוסקופיים המשקפים את פעילותם של חלבוני ערוץ בודדים יכולים גם להיות רשומים ישירות תחת מהדק תיקון, בתאים או במצב נכרת. אותה הביצית מספקת דגימות תיקון מרובות, מאפשר שכפול נתונים טובים יותר. שאיבה להחיל תיקונים יכולה להפעיל TRPV4 להעריך mechanosensitivity ישירות. שיטות אלו צריכה להיות גם שימושיות בחקר סוגים אחרים של ערוצי TRP.

בניסוי luminometry טיפוסי, מגוון של זעזועי hypotonic למטה 400-1,200 mOsM מושגת על ידי הוספת 200 μl של פתרונות הלם osmolarity הנמוך שונה ל20 μl של התרבות ב1,400 mOsM. פעילות TRPV4 לידי ביטוי כאשר RLU של הניסוי הוא בהשוואה לזה של שני פקדים שליליים: תאי שמרים הפכו עם פלסמיד p416GPDV4 הריק או אחד המכיל את גן TRPV4 עם מוטציה במסנן יון (איור 1) 24. בניסוי המתח-clamp שתי אלקטרודות טי...

כדי להשלים את השיטות נפוצות ללמוד TRPV4 של שתי שיטות מתוארות: mechanosensitivity ניתן ללמוד על ידי 2 luminometry +-aequorin Ca בשמרים מהונדסים על אתגר היפו אוסמוטי. כמו כן, ניתן לבדוק בTRPV4-RNA מוזרק ביציות Xenopus ידי מהדק כל תא שתי אלקטרודות מתח או צמד תיקון בתאים או במצב נכרת.

Luminometric ושמרים Xenopus ביצית בחינות אלקטרו של Mechanosensitivity המולקולרי של TRPV4

TRPV4 (Transient Receptor Potentials, vanilloid family, type 4) is widely expressed in vertebrate tissues and is activated by several stimuli, including ...

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לבחון את רגישות המכאנו של תעלת ארבעת היונים של טריפ V. ניתן להשיג זאת על ידי הפיכת תאי שמרים עם הגן trip V Four ובחינת כניסת הסידן המושרה באופן היפותטי דרך זר טרנסגני באמצעות לומינומטר. ניתן לבחון זאת גם בגישה האלקטרופיזיולוגית.טריפ V ארבע CRNA נוצר לראשונה ומוזרק לתוך ציטים של קסנופוס לאחר הדגירה. ציטים נבדקים על ידי שני מהדקי מתח אלקטרודה על האתגר ההיפוטוני. כדי לבחון את רגישות המכאנו ברמת הערוץ היחיד, היניקה מופעלת על כתמי הממברנה שנכרתו מהצייטים.אני פרופסור ג'ין קונג. בעבר, הפעילויות של ארבע תעלות יונים של TRIP B הוצגו במידה רבה על ידי URA למיתוס הקרינה שפותח כאן, מספקות חלופות עוצמתיות וכמותיות לבחינת הרגישות המכנית של טריפ B ארבע. השיטה הראשונה שאימצנו את השימוש בלום לום היא באמצעות אקווה טרנסגני כדי לבחון את הרגישות המכנית של טריפ V 4 בשמרים ניצנים.בשיטה השנייה בגישה אלקטרופיזיולוגית, נבדקות התכונות של טריפ V ארבע ביטוי הולם של מחווה V ארבע CRNA ב-XUS Cytes. השיטה הבסיסית של אלקטרופיזיולוגיה של ציטים, כגון הסרת קרום הווילין והיווצרות חותם עצמי כבר הודגמה בעבודה של בראון ועמית בכתב עת זה ממש בשנת 2008 כאן תראה צעדים נוספים הדרושים לחקר הרגישות המכנית של Triv four. זה עמיתי לעבודה, ד"ר ג'ין פקון.היא תדגים את השימוש בגיאומטריית T lum כמו גם את ייצור פיפטות ההזרקה, מילוי פיפטות בתמיסת CRNA והזרקת התמיסה לאתרים הישנים. בנוסף, היא תדגים הקלטת צדפות תיקון בתא ובמצב כריתה מבפנים החוצה. היא גם תראה את ההפעלה של התעלה הרגישה למכאנו שמקורה בקרום אתר O, כמו גם את התוצאות מהפעלת ההטרולוגוס.ליי ביטא טלוויזיה ארבע התחל הליך זה על ידי תרבית שני מיליליטר של תאי שמרים בן לילה לפוסט שלב לוגריתמי במדיום הנשירה של DCD Lu Yura, בתוספת סורביטול מולארי אחד בשייקר של 30 מעלות צלזיוס. למחרת יש לחסן 200 מיקרוליטר מהתרבית לתוך 1,800 מיקרוליטר של מדיום טרי, בתוספת שני לוציפר מיקרו-מולרי. לאחר מכן ריסין גדל בחושך בטמפרטורת החדר למשך 24 שעות נוספות מבלי לרעוד ממש לפני הדילול.מדוד את האוסמולריות של התרבית המועשרת בסורביטול טוחנת אחת ואת הנתרן הכלורי באמצעות לחץ אדים OSM ter. לאחר מכן, 20 מיקרוליטר של תרבית טרייה לתוך צינור לומינומטר 12 מילימטר עבור לומינומטר צינור יחיד. עבור ההלם ההיפוטוני הוסף 200 מיקרוליטר של תמיסה המכילה 25 מילי-מולרית נתרן EGTA ב-pH 7.2 או נתרן MES ב-pH 7.2 ו-500 עד 100 מילי-מולרי נתרן כלורי ל-20 מיקרוליטר של התרבית ב-1,400 מילי-אוסמו מנטרים ברציפות את הזוהר לפני, במהלך ולפחות 120 שניות לאחר ההלם האוסמוטי למטה שנקטע רק על ידי פעולת הדילול הקצרה רושמים את פלט הלומינומטר במחשב כיחידות זוהר יחסיות.בהליך זה, משוך מיקרו פיפטה עם מושך פיפטה. למיקרו פיפטה צריך להיות שוק ארוך מתחת למיקרוסקופ מנתח. צבט בזהירות את שוק המיקרו פיפטה הנמשכת בנקודה המתאימה כדי ליצור פתח.פתח המיקרו פיפטה צריך להיות בקוטר של כ-30 מיקרומטר כדי להקל על מילוי ופליטה של תמיסת CRNA. להלן מזרק המיקרו ומחזיק הפיפטה. זוהי הבקרה עם פונקציות הקליטה והפליטה המסומנות בבירור.לאחר מילוי חוזר של הפיפטה בשמן מינרלי המותקן על המחזיק, ואז הורד אותה לטיפה של תמיסת CRNA. לאחר מכן מלא את הפיפטה על ידי מזרק מיקרו באופן אוטומטי תחת מיקרוסקופ הניתוח, בחר ביצית. לאחר מכן הורד את המיקרו פיפטה המלאה כדי לחדור לביצית.לאחר החדרת המיקרו פיפטה לתוכו, התחל בהזרקת CRNA. לאחר הזרקת כ-30 ציטים, העבירו אותם למדיום ND 96 המכיל רותניום אדום וגנטמיצין. לאחר מכן, העבירו אותם בנפרד לצלחת 96 בארות המכילה את מדיום ND 96 בקצה.הנח אותם בחממה למשך מספר ימים כדי לאפשר ביטוי של טיול V ארבעה ערוצים. שתי שיטות אלקטרופיזיולוגיות משמשות לבחינת רגישות המנגנון של טריפ V ארבע. השיטה הראשונה היא מהדק מתח שתי אלקטרודות, וזו ההגדרה בשלב זה.משוך את פיפטות ההקלטה למדידת מתח והזרקת זרם מכוסות בוליק של 100 מיקרוליטר עם משיכת פיפטה. אלקטרודות הפיפטה צריכות להיות בעלות צמצם קצה בקוטר של מיקרון אחד. לאחר מכן, מלאו מחדש את האלקטרודות בשני אשלגן כלורי מולארי, מה שיביא להתנגדות של 0.1 עד 0.2 מגה.הרכיבו אותם על שלבי HS שני ראש. שני אלה הם המניפולטורים המיקרו המחזיקים את אלקטרודת בקרת המתח ואת אלקטרודת הזרקת הזרם, אשר יחד עם מהדק אמבטיה מקורקע וירטואלי VG שני x 100 מחוברים לממשק מגבר מהדק גנים 500 באמצעות דיגיטייזר ספרתי 1440. והנתונים נרכשים באמצעות תוכנת P clamp 10.על במת המיקרוסקופ ההפוך יושב תא ההקלטה לביצוע הקלטה, ציט קסנופוס מונח בתא ושתי האלקטרודות מוכנסות לתוכו באמצעות מיקרומניפולציה. התמיסה השוטפת את הצייט בתא ההקלטה היא בזרימה רציפה דרך כוח הכבידה. הזנת הכניסה לתא מחוברת דרך צינורות לסעפת המיוצרת עם בנק קליפות מזרק.כל קליפה מלאה בתמיסה אחרת. תכולת האמבטיה משתנה על ידי סגירה או פתיחה של מהדקים שונים על הצינור. שינוי האמבטיה מאוסמולריות גבוהה לנמוכה מספק צורה אחת של גירוי מכני.כעת, מלאו את פיפטות הזכוכית המשוכות בתמיסה הפנימית. ההגדרה של מהדק תיקון דומה לזו של מהדק מתח כאשר האלקטרודה מותקנת על דרגת הראש ולאחר מכן מאובטחת על המניפולטור המיקרו. חבר את פיפטת מהדק התיקון למזרק של חמישה מיליליטר ולמד לחץ.אלקטרודת מהדק התיקון עוברת מניפולציה על פני הביצית. לאחר הסרת קרום Vitale, הפעל יניקה רציפה כדי להדביק את המדבקה לקצה הפיפטה, מה שיגביר את ההתנגדות החשמלית לדופק זרם הבדיקה. כאשר ההתנגדות גדולה מספיק מה שמעיד על היווצרות מוצלחת של אטם ג'יגה, האלקטרודה עם המדבקה נשלפת מהביצית כדי ליצור את מצב ההקלטה הפנימי החוצה.לאחר מכן מרחו פעימות יניקה על המדבקה הכרותה. יש ערוץ רגיש למכאנו של 40 פיקו סימנס שמקורו בביצית הקסנופוס. איור זה מראה את הפעלת התעלות הללו כאשר מופעל פולס יניקה בממברנה, טלאים שנכרתו מביציות מבטאים בהצלחה את טריפ V ארבע.ניתן לראות את הפעלת המוליכות היחידה של 90 פיקו סימנס של טריפ V 4 באופן דומה. מוצג כאן טריפ החולדה V 4 המתבטא בשמרים המגיבים להלם היפוטוני. הלם היפוטוני של 750 מיליאוסמול מפעיל עלייה גדולה בזוהר בביצועי טריפ V ארבע T, אך לא בביצועי T של פלסמיד ריק או פלסמיד הנושא טריפ V ארבע עם מוטציה במסנן היונים שלו.והנה יחס תגובת המינון בין ההלם ההיפוטוני לתגובת השיא. כל תגובות הזרם המקרוסקופי של הביציות לגירויים היפוטוניים נבדקו באמצעות מהדק מתח של שתי אלקטרודות. זרמי השיא מביצית מבטאים רמות גבוהות מאוד של טריפ מסוג בר V ארבעה על 100 מילישניות צעדי מתח בתגובה להסרת סורביטול 100 מילי-מולרית מתמיסת אמבט אוסמו 250 מילי, ותוספת של שלושה רותניום אדום מיקרו-מולרי.זרם השיא החוזר עולה עם גירויים היפוטוניים והוא יורד עם החזרה לתמיסה איזוטונית או הוספת חוסם הערוצים. איור זה מציג את ההפעלה הישירה של טריפ מסוג פראי V ארבע על ידי מתיחת ממברנה הנראית מתחת למהדק טלאי, דגימה של עקבות גולמיים באיכות ממוצעת ממדבקה שנכרתה מטיול V ארבע מבטאת ביצית המראה הפעלה על ידי 60 מילימטרים של יניקת כספית המופעלת על מדבקת כריתה מבפנים החוצה המוחזקת ב-50 וולט חיובי. המעקב העליון מוצג בבסיס זמן מהיר יותר כדי להציג את מעבר הזרם האחיד בין רמה סגורה לרמה פתוחה.קלטת וידאו זו אמורה לתת לך הבנה קונקרטית יותר כיצד ניתן ליישם שיטות אלקטרופיזיולוגיות של אור שמרים, גיאומטריה ואתר O לחקר הרגישות המכנית של ארבעה ערוצים.

yeast-luminometric-xenopus-oocyte-electrophysiological-examinations

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

גישת פער זלין החתך פתוח משמשת להשגת הקלטות רעש נמוכות של זרמים יוניים וgating מתעלות יונים מתח תלוי מבוטאים בביציות Xenopus עם רזולוציה גבוהה של קינטיקה ערוץ מהר. עם שינוי קל, fluorometry מהדק מתח יכול להיות מצמידים את פרוטוקול ביצית החתך פתוח.

<em&gt; Xenopus</em&gt; טכניקת ביצית Cut-פתוח וזלין גאפ מתח מהדק עם Fluorometry

מתוארת שיטה להדמיית שינויים בפוטנציאל הממברנה באמצעות מחווני מתח מקודדים גנטית.

ממברנה הדמיה פוטנציאלית עם שני סוגי חיישני מתח פלורסנט מקודדים גנטיים

מיקרואלקטרודות חדות מאפשרות אפיון אלקטרופיזיולוגי מדויק של תפוקת קולטני האור והאינטרנוירונים החזותיים בדרוזופילה חיה. כאן אנו מראים כיצד להשתמש בשיטה זו כדי להקליט תגובות מתח באיכות גבוהה של תאים בודדים לגירוי אור מבוקר. שיטה זו אידיאלית לחקר עיבוד מידע עצבי בעיניים של תרכובות חרקים.

שיטת אלקטרו עבור תגובות מתח תאיים הקלטה של<em&gt; תסיסנית</em&gt; קולטני אור ו interneurons יאירו גירויים<em&gt; In vivo</em

תעלות יוני לימוד באמצעות מערכת להביע heterologously הפכו טכניקת ליבה במחקר ביו. בכתב היד הזה, אנו מציגים שיטה יעילה זמן כדי להשיג ביטוי ערוץ יון תחת פיקוח הדוק על ידי ביצוע transfection חולף בשליטת האמרגן מושרה.

ביטוי ערוץ יון לשליטה באמצעות Transfection ועין מתנהל חלוף

מאמר זה מתאר שיפור של קונבנציונאלי מתח פלמורומטריה (VCF) שבו פלואורסצנט טבעי חומצות אמינו (fUAA) משמשים במקום צבעים maleimide, כדי לבדוק סידורים מבניים בערוצי יון. ההליך כולל הזרקת Xenopus ביצית דנ"א, RNA / מטבע fUAA, ומדידות בו זמנית ו פלואורסצנטי.

מתח הידוק פלואומטריה ב<em&gt; קסנופוס</em&gt; ביציות באמצעות חומצות אמינו פלואורסצנטי לא טבעי

כל תא הקלטות של תסיסנית melanogaster photoreceptors לאפשר מדידה של ספונטני בליטות כהה, בליטות קוונטיות, תגובות מאקרוסקופיות לאור, ואת המתח הנוכחי היחסים בתנאים שונים. בשילוב עם ד melanogaster כלים מניפולציה גנטית, שיטה זו מאפשרת את המחקר של inositol- השומן ליפיד המסלול נתיב היעד שלה, ערוץ TRP.

שיטה אלקטרו-קולית לקולקציית מתח מלא<em&gt; תסיסנית</em&gt; פוטורספטורים

מאמר זה מתאר שיטות ספציפיות כדי לקבל כמויות הביוכימי של solubilized-חומרי ניקוי TRPV1 לניתוח spectroscopic. הפרוטוקולים המשולב לספק כלים הביוכימי biophysical זה ניתן להתאים להקל פונקציונלי מבניים ללימודי תעלות היונים בתרבית של סביבה מבוקרת ממברנה.

טיהור, בנייתו מחדש של TRPV1 לניתוח Spectroscopic

כאן אנו מתארים רכישה אופטית ואפיון של פוטנציאל פעולה מתאי גזע פלוריפוטנטים המושרים שמקורם בקרדיומיוציטים באמצעות מערכת פוטומטריה מודולרית במהירות גבוהה.

מדידה פוטנציאלית לפעולה אופטית חד-תאית בקרדיומיוציטים שמקורם בתאי גזע מושרים על ידי תאי גזע אנושיים

כאן אנו מציגים פרוטוקול המתאר התמרה ויראלית של אזורי מוח בדידים עם מבנים אופטוגנטיים כדי לאפשר אפיון אלקטרופיזיולוגי ספציפי לסינפסה בפרוסות מוח של מכרסמים חריפים.

אקס ויוו חקירה אופטוגנטית של העברה סינפטית ארוכת טווח ופלסטיות מקליפת המוח הקדם-מצחית האמצעית ועד קליפת המוח האנטורינלית הלטרלית

אלקטרופיזיולוגיה היא תקן הזהב לחקר פעילות תעלות היונים. עם זאת, ישנן גישות חלופיות רבות, כולל שיטות אופטיות. במאמר זה אנו מתארים שיטה לניטור הפעילות של תעלות אניון עשירות בלאוצין המכילות 8 ערוצי אניון (LRRC8) באמצעות שיטה מבוססת העברת אנרגיית תהודה בין תת-יחידות Förster (FRET).

ניטור פעילות חוזרת עשירה בלאוצין המכילה 8 ערוצים (LRRC8/VRAC) באמצעות העברת אנרגיית תהודה של Förster עם פליטה רגישה (SE-FRET)

לחקר תגובות של תאים מעוררים במבחנה, הפרוטוקול מתאר ניטור אופטי של שינויים ביצירת פוטנציאל הפעולה עקב אלקטרופורציה במודל תא מעורר פשוט של תאי HEK מהונדסים גנטית וכן שינויים במתח הטרנסממברני עם מיצוי אוטומטי של פרמטרים רלוונטיים.

ניטור שינויים הנגרמים על ידי אלקטרופורציה ביצירת פוטנציאל פעולה בתאי HEK מהונדסים גנטית

חקור את הרגישות המכנית של ערוץ היונים TRPV4 בשיטות לומינומטריה ואלקטרופיזיולוגיה בביצי Xenopus ובתאי שמרים. שיטות אלו מאפשרות ניתוח כמותי של תגובות הערוץ לגירויים מכניים.

Luminometric ושמרים Xenopus ביצית בחינות אלקטרו של Mechanosensitivity המולקולרי של TRPV4

גלה סרטונים נוספים