ההדמיה confocal של הבזקים בודדים מיטוכונדריאלי Superoxide בלב שלם או בVivo

המטרה הכוללת של הליך זה היא לנטר אירועים מיטוכונדריאלים בודדים כגון הבזקי סופראוקסיד ותנודות פוטנציאליות של הממברנה במקום או in vivo כדי להשיג הערכה בזמן אמת של תפקוד המיטוכונדריה בהקשר רלוונטי מבחינה פיזיולוגית. זה מושג על ידי חשיפת שריר השלד בגפה האחורית של העכבר. לאחר מכן, תמונות קונפוקליות של שרירי השלד מתקבלות in vivo.

לאחר מכן לב העכבר מוחדר ומצולם באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית. לבסוף, התמונות מעובדות והנתונים מנותחים. בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות המראות הבזקי סופראוקסיד מיטוכונדריאלי בודדים ותנודות פוטנציאליות של הממברנה בשרירי השלד, in vivo או בלב מחורר באמצעות תמונות קונפוקליות דו-ממדיות.

היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שרירים קיימים כמו הערכת תפקוד המיטוכונדריה בבידוד מיטוכונדריה הוא שטכניקה זו מאפשרת הערכה בזמן אמת של תפקוד מיטוכונדריה בודד במצב רלוונטי מבחינה פיזיולוגית. אנו מדגימים שיטה זו היא קריטית מכיוון שסכין, בעל חיים או רקמת סכין קשה ללמוד הדמיה קונפוקלית מכיוון שמדובר בהליך תלול ומסובך יותר. לאחר הכנת תמיסת מלח איזוטונית מאוזנת או IBSS, Krebs HENSEL Light Buffer, או KHB ומכשירים כירורגיים על פי פרוטוקול הטקסט, הרדימו עכבר עם הזרקה תוך צפקית של פנטוברביטל ובצעו צביטה בבוהן כדי לאשר שהחיה מורדמת.

בעזרת סכין גילוח, הסר את השיער באחת הגפיים האחוריות לפני חיטוי המקום באתנול 70%. לאחר מכן, בצע חתך בעור לאורך הצד החיצוני של הגפה כדי לחשוף את שרירי אנמיה בקיבה. לאחר מכן בעזרת מלקחיים חדים, הרם בעדינות את האפימיסיום והשתמש במספריים כדי לבצע דרכו חתך.

נתח עוד כדי להסיר את האפימיסיום ולחשוף את סיבי השריר שמתחתיו. הוסף 500 ננו-מולרי טטראתיל, מוט דומין מתיל אסטר או TMRM ל-IBSS וטבול את השריר בתמיסה למשך 30 דקות. לאחר העמסת TMRM לשריר, שטפו את השריר עם תסמונת המעי הרגיז ללא TMRM באמצעות יעד שמן פי 40.

הנח את העכבר על צדו על המיקרוסקופ הקונפוקלי stage ורסן את הגפה האחורית כך ששריר השלד החשוף יהיה בתא בהתאמה אישית כנגד החלקת הכיסוי. לאחר מכן לחץ בעדינות כלפי מטה על הרגל כדי ליצור מגע הדוק בין הרקמה להחלקת הכיסוי ולטבול את השרירים החשופים ב- IBSS באמצעות עומק פיקסלים של שמונה סיביות וקצב דגימה של שנייה אחת לכל מסגרת להקליט סריקה סדרתית דו מימדית של השריר. אסוף תמונות עוקבות על ידי ריגוש ראשון ב-405 ננומטר ואיסוף של יותר מ-505 ננומטר.

ואז מרגש ב-488 ננומטר תוך איסוף של יותר מ-505 ננומטר. לעירור באורך גל כפול של MT. CCP YFP, השתמש בעירור רציף ב-405, 488 ו-543 ננומטר ואסף פליטה ב-505 עד 5, 45.505 עד 5, 45 ויותר מ-560 ננומטר בהתאמה. להדמיית עירור משולש באורכי גל של M-T-C-P-Y-F-P ו-TMRM כדי לדמות את לב העכבר, הזריק לבעל החיים 200 יחידות הפרין.

לאחר המתנה של 10 דקות והמתת חסד של העכבר על ידי כריתת בית החזה, הסר במהירות את הלב והריאות ואת בלוטת התימוס המחוברים אליו. העבירו במהירות את הרקמה המושתלת ל-IBSS קר כקרח. לאחר מכן זהה את אונות התימוס וקילף אותן בעדינות לאחור.

כדי לחשוף את אבי העורקים העולה, הסר את הריאה ואת בלוטת התימוס ובודד את אבי העורקים על ידי הסרה זהירה של כל הרקמות שמסביב. לאחר מכן, בצע חתך בקצה העליון של אבי העורקים העולה לפני הענף הראשון של קשת אבי העורקים. לאחר מכן, בעזרת שני מלקחיים מיקרו-תפירה, החזק בעדינות את דופן אבי העורקים כדי לחשוף את הלומן והנח אותו בזהירות על צינורית.

השתמש בכלי מיקרו clamp כדי להחזיק את אבי העורקים במקומו ולקשור במהירות תפרים סביבו. הסר את המהדק והשתמש במלקחיים כדי לבדוק היטב שקצה הצינורית נמצא מעל שורש אבי העורקים. אבטח קשרים נוספים במידת הצורך כדי להחזיק את הלב במקומו.

הפעל את המשאבה הפריסטלטית והחדיר את הלב. במיליליטר אחד לדקה, הלב יחזור לפעום עם הזלוף. לאחר 10 דקות של ייצוב, יש להחדיר ללב 10 סטטינים BLEs מיקרו-מולאריים ו-100 עד 500 ננו-מולרי TMRM.

פעימות הלב יאטו לאחר 10 דקות. לאחר מכן, התאם את מיקום מערכת הזלוף והניח את הלב על במת המיקרוסקופ המצוידת במתאם לחימום החדר ל -37 מעלות צלזיוס. הוסף מיליליטר אחד של תמיסת זלוף KHB בתא כדי לטבול חלקית את הלב.

השתמש במשאבה פריסטלטית כדי להוציא את הקולחין מהתא. הגדל בהדרגה את מהירות המשאבה כדי לספק זרימה מספקת ללב כדי להבטיח מגע הדוק של הלב עם החלקת הכיסוי וכדי לדכא עוד יותר את פעימות הלב, הפעל לחץ עדין על הלב. דמיין את האיבר כפי שתואר עבור השריר מוקדם יותר בסרטון זה, והתאם את מישור המוקד כדי לחשוף את התמונה הברורה ביותר האפשרית.

שימוש במודול הניתוח הפיזיולוגי של תוכנת המיקרוסקופ הקונפוקלי. התחל בפתיחת מסד הנתונים שנוצר באופן אוטומטי ולאחר מכן את קובץ התמונה הדו-ממדית לניתוח. לחץ על אזור עניין או על ממוצע החזר על ההשקעה.

כדי לעבור למצב ממוצע של החזר ROI. כבה את תצוגת הערוצים למעט CP YFP ב-488 ננומטר לבחירת ההבזקים. הגדל את התמונה, והזז ידנית את סרגל השקופיות כדי להפעיל את התמונות הדו-ממדיות הטוריות.

לאחר מכן, זהה הבזקי סופראוקסיד מיטוכונדריאלי בודדים על ידי איתור האתר שבו האות הפלואורסצנטי גדל באופן חולף. השתמש בכלי ה-ROI המתאים כדי לסמן את ההבזקים, העקבות המציגות שינוי פלואורסצנטי תלוי זמן של כל החזר ROI יופיעו לצד התמונה. לאחר בחירת כל ההבזקים, הפעל את התצוגה של ערוצים אחרים.

בחר החזר ROI על התמונה מחוץ לתא להפחתת אות רקע. לאחר מכן פלט את הקרינה הממוצעת של כל החזר ROI יחד עם תוויות הזמן. רשום את מספר ההבזקים בכל אחד מקבצי תמונת הסריקה הסדרתית יחד עם זמן הסריקה והאזור של התא.

השתמש ב- Excel כדי לחשב את תדר ההבזק כמספר ההבזקים ל- 100 שניות ולכל שטח תא של 1000 מיקרון מרובע. כדי לחשב את זמן המשרעת לשיא וזמן הדעיכה עבור כל הבזק. השתמש בתוכנית שפותחה בהתאמה אישית לניתוח פרמטרי פלאש שהיא חלק מתוכנית שפותחה בהתאמה אישית הכתובה בשפת נתונים אינטראקטיבית.

באמצעות פרוטוקול זה ניתן לבצע הדמיה in vivo של אירועים מיטוכונדריאלים בודדים בשרירי השלד של עכברים מורדמים, ולאחר מכן הדמיית insi בלב המנופח. כפי שמוצג כאן. TMRM, שהוא אינדיקטור פוטנציאלי של הממברנה המיטוכונדריאלית, משמש לעתים קרובות לאימות המיקום של M-T-C-P-Y-F-P ואמור להראות דפוס חופף מלא עם האות M-T-C-P-Y-F-P.

ניתן להבחין בין הספקטרום שלו לזה של CP YFP, ועל ידי שימוש בשיטת העירור הרציף, אותות הפליטה של TMRM ו-M-T-C-P-Y-F-P לא יפריעו זה לזה. תמונות אלה מדגימות כי ניתן לזהות הבזק סופראוקסיד מיטוכונדריאלי יחיד המלווה בדפולריזציה של הממברנה בתמונות הסריקה הדו-ממדיות הסדרתיות, שהראו עלייה פלואורסצנטית חולפת על פני אותות הרקע הן ברקמות שריר השלד והן בשריר הלב. מלבד רזולוציה גבוהה, נדרשת גם עוצמת פלואורסצנטיות נאותה.

ניתן להשיג זאת על ידי אפנון עוצמת הלייזר והרווח בתעלות האיסוף. באופן כללי, אות הקרינה הבסיסית מהתא מוגדר על שליש עד רבע מהעוצמה המקסימלית של הערוץ. מכיוון שרמת הביטוי של M-T-C-P-Y-F-P והעומס של TMRM יכולים להשתנות בין בעלי חיים, יש לבצע כוונון עדין של תנאי ההדמיה עבור כל ניסוי, הן הפרעות פיזיולוגיות והן הפרעות פתולוגיות, כגון מצעים מטבוליים.

גירוי חשמלי כפי שמצוין כאן, ורפרפוזיה איסכמית שימשו כדי להראות שפעילות הבזק סופראוקסיד מגיבה לשינויים במצב חילוף החומרים התאי. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לשמור על הרדמה מתאימה של הפה ועל המצב הנכון של הלב המוחדר. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו איסכמיה ואיחוי על מנת לענות על שאלות נוספות כמו תפקוד לקוי של המיטוכונדריה במהלך לוקמיה של שריר הלב ופגיעה ברפרפוזיה.