Name: שיטת הכנת שקופיות לשמירה על ארכיטקטורת כרומטין תלת מימדית של תאי נבט האשכים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-10T14:15:00.000+00:00
Duration: 7 min 34 s
Description: למד שיטת הכנת שקופיות תלת-ממדית לשימור ארכיטקטורת כרומטין בתאי נבט האשכים. השיטה משפרת רגישות זיהוי מבנים תת-גרעיניים ומתאימה לטכניקות פלואורסצנציה שונות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

אני מודה לג'יני טי לי על הפיקוח על הפרויקט הזה כשהייתי במעבדה של לי וטיילר ברורינג על עריכת כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי פרס בזיל אוקונור סטרטר מלומד מקרן מצעדת דימס ו- NIH Grant GM098605.

1.3D הכנת שקופיות
<ol><li>הכן את ריאגנטים הבאים:<ol>
<li>מאגר CSK: 100 mM NaCl, 300 מ"מ סוכרוז, 10 mM צינורות, 3 mM MgCl2. כוונן את ה-pH ל-6.8 עם 1 M NaOH. אחסן את מאגר CSK ב- 4 °C (69 °F).</li>
		<li>מאגר CSK עם 0.5% טריטון X-100: להוסיף 200 מיקרוליטר של טריטון X-100 כדי 40 מ"ל של מאגר CSK. מערבבים את הפתרון באמצעות stirrer מגנטי עד טריטון X-100 מומס לחלוטין. אחסן את מאגר CSK עם 0.5% טריטון X-100 ב 4 °C (69 °F).</li>
		<li>4% Paraformaldehyde (PFA)–PBS, pH 7.4: להמיס 4 גרם של PFA בכ 70-80 מ"ל של מים. על מנת לזרז את תהליך המסה, להוסיף כ 20 μl של 4 N NaOH ולשמור את הפתרון באמבט מים ב 60 מעלות צלזיוס עד PFA התמוסס לחלוטין ואת הפתרון הוא שקוף. תהליך זה אורך כשעה. לאחר PFA התמוסס לחלוטין, להוסיף 10 מ"ל של 10x PBS. כוונן את הנפח הסופי ל-100 מ"ל במים וצנן את הפתרון לטמפרטורת החדר (25°C). השתמש בפתרון מוכן טרי עבור כל ניסוי חדש. הערה: קבל אישור מוסדי לכל עבודה בבעלי חיים ופעל בהתאם להנחיות הרלוונטיות לטיפול בבעלי חיים.</li>
	</ol>
</li>
	<li>המתת חסד לעכברים זכרים. באמצעות מלקחיים ומספריים, בלו את האשכים מן העכבר. הנח את האשכים ב- PBS (או RPMI 1640). לאחר הסרת האשכים, בצע במהירות את השלבים הבאים 1.3-1.4 על מנת למנוע השפלה של RNA.</li>
	<li>קרע את האשכים על צלחת פטרי קטנה ולהסיר את אלבוגניאה טוניקה. לפענח את הצינוריות חצי-חופן ב- PBS על קרח באמצעות מלקחיים.</li>
	<li>באמצעות מלקחיים, להעביר כמה tubules (כמה חתיכות של tubules כ 5-10 מ"מ אורך) לתוך באר אחת של צלחת 4-באר המכיל 500 מ"ל של חיץ CSK + 0.5% טריטון X-100 על קרח, ואת הדגירה במשך 6 דקות. חשיפת יתר למאגר CSK עלולה לגרום להפרעה לתאים.</li>
	<li>בעזרת מלקחיים, מעבירים את כל הצינוריות לבאר אחת של צלחת של 4 בארות המכילה 4% פתרון PFA-PBS. שלב זה יכול להיות מעוצב מראש ללא סטריאומיקרוסקופ, אך באופן אופציונלי ניתן להשתמש בו. דגירה במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. במקביל להתחיל להכין 12 תאי ציטוספין במהלך תקופות הדגירה.</li>
	<li>בעזרת מלקחיים, מעבירים את כל הצינוריות לבאר אחת של צלחת של 4 בארות המכילה PBS. דגירה במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>בחלק האחורי של מגלשת זכוכית, להעביר את כל tubules לתוך 30 μl של PBS (החלק העליון של השקופית יש להימנע עקב תשלום קטיוני). בעזרת קצות שתי מלקחיים, קורעים את הצינוריות לחתיכות. קוצצים את הצינוריות בכיוון אופקי על ידי גזירת צינוריות בין קצות של שני מלקחיים ומושך את המלקחיים אופקית. המשך בשלב זה במשך כ- 10-20 שניות.</li>
	<li>מערבבים את ההשעיה על ידי pipetting באמצעות פיפטה P20.</li>
	<li>מעבירים את ההשעיה לצינור מיקרוצנטריפוגה, מדללים עם PBS ל-1.3 מ"ל בקירוב. החל 100 μl של השעיה על כל אחד 12 תאי ציטוספין (1.2 מיליליטר בסך הכל). בשלב זה, אין צורך לקבוע את ריכוז התאים.</li>
	<li>ציטוספין הדגימות ב 2,000 סל"ד במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר ציטוספין, יבש שקופיות על ספסל המעבדה במשך כמה דקות בטמפרטורת החדר. לאחר ששקופיות הורשו להתייבש לחלוטין למשך מספר דקות, עבור לשלב הבא.</li>
	<li>באמצעות צנצנת קופלין המכילה PBS, לשטוף את השקופיות במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>מעבירים שקופיות לצנצנת קופלין המכילה 70% אתנול ומחכים לפחות 2 דקות לפני תחילת RNA FISH. שקופיות יציבות במשך כמה שבועות ב 70% אתנול ב 4 מעלות צלזיוס. לאחסון ארוך טווח, לייבש שקופיות באמצעות טיפול סדרתי עם 80% ו 100% אתנול בצנצנות Coplin במשך 2 דקות כל אחד אוויר יבש לחלוטין לייבש את המגלשות. יש לאחסן ב-80°C בתיבת שקופיות.</li>
</ol>2. הכנת בדיקת DNA ע"ש קוט-1 על ידי פרימיום אקראי
<ol><li>הכן את ריאגנטים הבאים:<ol>
<li>מאגר הכלאה: מערבבים את הרכיבים המתקדמת כדי להכין 900 מ"ל של מלאי מאגר הכלאה; פתרון זה ישמש לבדיקות מלאי. מלאי חיץ הכלאה זה מאפשר תוספת של 10% נפח של פתרון מעכבי RNase (ריבונוקלוזיד ונדיל קומפלקס) לפני הכלאה.<table><tbody>
<tr>
<td>רכיב</td>
					<td>סכום (μl)</td>
					<td>ריכוז סופי</td>
				</tr>
<tr>
<td>פורמפיד (פירושונים)</td>
					<td>500</td>
					<td>50% (v/v)</td>
				</tr>
<tr>
<td>50% דקסטרן</td>
					<td>200</td>
					<td>10% (עם/v)</td>
				</tr>
<tr>
<td>20x SSC</td>
					<td>100</td>
					<td>פי 2</td>
				</tr>
<tr>
<td>1% BSA</td>
					<td>100</td>
					<td>0.1%</td>
				</tr>
</tbody></table>לפני הכלאה, להוסיף 1/10 vol של 200 מ"מ ריבונוקלוזיד Vanadyl קומפלקס או מים למלאי חיץ הכלאה כדי להתאים את הריכוז הסופי. ב -20 מעלות צלזיוס, תערובת זו יציבה במשך יותר משנה.</li>
		<li>20x SSC: להמיס 88.2 גרם של נתרן ציטראט ו 175.3 גרם של NaCl בכ 800 מ"ל של מים. כוונן את ה- pH ל- 7.0 באמצעות כמה טיפות של 1 M HCl. הוסף מים כדי להתאים את עוצמת הקול הסופית ל- 1 L. Sterilize על-ידי שיקום אוטומטי. לאחר ההכנה, ניתן לאחסן 20x SSC בטמפרטורת החדר.</li>
		<li>50% (w / v) דקסטרן: מערבבים מים ולאט לאט מוסיפים 50 גרם של דקסטרן סולפט. המשיכו לבחוש לילה בטמפרטורת החדר. מוסיפים מים כדי להתאים את הנפח הסופי ל-100 מ"ל. יש לאחסן בטמפרטורת החדר.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הוסף את המרכיבים הבאים המפורטים להלן לצינור PCR. באמצעות מכונת PCR, לערבב ולהדגיר את הפתרון במשך 5 דקות ב 95 °C (69 °F).<table><tbody>
<tr>
<td>רכיב</td>
				<td align="center">סכום לתגובה (μl)</td>
				<td align="center">הסופי</td>
			</tr>
<tr>
<td>קוט-1 דנ"א: 1 מ"ג/מ"ל</td>
				<td align="center">1</td>
				<td align="center">1 מיקרוגרם</td>
			</tr>
<tr>
<td>פריימר 9מר אקראי (מתוך ערכה)</td>
				<td align="center">10</td>
				<td align="center"></td>
			</tr>
<tr>
<td>מים</td>
				<td align="center">27</td>
				<td align="center"></td>
			</tr>
</tbody></table>
</li>
	<li>צנטריפוגה בקצרה ומניחים על קרח.</li>
	<li>הוסף את הרכיבים הבאים. מערבבים ומדגרים במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס באמצעות מכונת PCR. (לפרטים על הערכה המשמשת ראו טבלת ריאגנטים וציוד).<table><tbody>
<tr>
<td>רכיב</td>
				<td align="center">סכום לתגובה (μl)</td>
				<td align="center">ריכוז סופי</td>
			</tr>
<tr>
<td>תערובת מוכנה משלב 2.2</td>
				<td align="center">38</td>
				<td align="center"></td>
			</tr>
<tr>
<td>מאגר נוקלאוטידים 5x (מערכת)</td>
				<td align="center">9.2</td>
				<td align="center"></td>
			</tr>
<tr>
<td>Cy3-dUTP (1 מ"מ)</td>
				<td align="center">0.8</td>
				<td align="center">16 מיקרומטר</td>
			</tr>
<tr>
<td>קלנאו (מערכה)</td>
				<td align="center">2</td>
				<td align="center"></td>
			</tr>
</tbody></table>
</li>
	<li>הוסף 2 μl של חוצץ עצירה (מתוך ערכה) כדי להפסיק את התגובה.</li>
	<li>לטהר את התגובה שנעצרה באמצעות עמודות microspin.</li>
	<li>הוסף 50 מיקרוגרם (5 μl) של DNA זרע הרינג (50 קיפול עודף של תבנית Cot-1 DNA) לשבר המטוהר.</li>
	<li>מדוד את הנפח הכולל באמצעות פיפטה. הוסף נפח 0.7x של 100% אתנול ונפח 0.1x של 3 M נתרן אצטט (pH 5.2), לערבב היטב, וצנטריפוגה במשך 15 דקות במהירות המרבית (17,000 x g) באמצעות microcentrifuge ב 4 °C (69 °F).</li>
	<li>הסר את הנוזל, ולהוסיף 200 μl של 70% אתנול, לערבב היטב צנטריפוגה במשך 5 דקות במהירות מקסימלית ב 4 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>הסר את הנוזל העודף. יבש את המשקעים במשך 10 - 30 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>להמיס את גלולה ב 20 μl של מלאי חיץ הכלאה. בגלל גלולה לעתים קרובות קשה להתמוסס, פיפטה שוב ושוב. כאפשרות חלופית, מערבל מערבולת יכול לשמש גם כדי להמיס ביעילות את גלולה. ניתן לשמור את הבדיקות ב-20°C עד לשימוש.</li>
</ol>3. קוט-1 RNA פיש
<ol><li>הוסף את הרכיבים המפורטים להלן לצינור PCR. באמצעות מכונת PCR, דגירה במשך 10 דקות ב 80 °C (60 °F), ואחריו צעד preannealing של כ 10-30 דקות ב 42 °C (69 °F). יש לשמור על 42°C עד להכלאה. מתחם ונדיל ריבונוקלוזיד הוא אופציונלי; זה יכול להיות מוחלף במים.<table><tbody>
<tr>
<td>רכיב</td>
				<td align="center">סכום לתגובה (μl)</td>
				<td align="center">הסופי</td>
			</tr>
<tr>
<td>בדיקת DNA של מעריסה 1 (50 ng/μl)</td>
				<td align="center">2</td>
				<td align="center">100 ng</td>
			</tr>
<tr>
<td>מתחם ריבונוקלאוסייד ונדיל (200 מ"ר)</td>
				<td align="center">2</td>
				<td align="center">20 מ"מ</td>
			</tr>
<tr>
<td>מאגר הכלאה</td>
				<td align="center">נוסף ל- 20</td>
				<td align="center"></td>
			</tr>
</tbody></table>
</li>
	<li>לייבש שקופיות בצנצנת Coplin המכיל 80% אתנול במשך 2 דקות, ואחריו צנצנת Coplin המכיל 100% אתנול במשך 2 דקות. יבש שקופיות לחלוטין על ספסל המעבדה בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>מחממים מראש תא תיבת קצה (מלא 2-3 ס"מ של מים) באינקובטור 42 מעלות צלזיוס מראש. מקם את השקופית בתא תיבת הקצה. בקצרה צנטריפוגה בדיקות preannealed ופיפט ישירות על שקופיות מיובשות. הימנע מהפיכת בועות. כסו בעדינות את השקופית בתעודת כיסוי.</li>
	<li>להכלאה למשך 6 שעות עד לילה (14-15 שעות) ב-42 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>הכינו פתרונות שטיפה בצנצנות קופלין (שתי צנצנות עם 2x SSC ו-50% פורממיד, ושתי צנצנות עם 2x SSC). מחממים ב 42 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות באמבט מים.</li>
	<li>השתמש בסכין גילוח כדי להסיר את החלקת המכסה מקצה השקופית. הימנע מגרד דגימות. לשטוף שקופיות בצנצנת Coplin המכיל 2x SSC ו 50% formamide במשך 5 דקות ב 45 מעלות צלזיוס. חזור על שלב זה פעם אחת.</li>
	<li>לשטוף שקופיות בצנצנת Coplin המכיל 2x SSC במשך 5 דקות ב 45 מעלות צלזיוס. חזור על שלב זה פעם אחת.</li>
	<li>הוסף 20 μl של מדיה להרכבה על-ידי DAPI לשקופיות, וכסה באמצעות שובר כיסוי. לחץ בעדינות על זכוכית כיסוי כדי להסיר מדיית הרכבה נוספת. כתם מדיה הרכבה נוספת עם רקמת ניקוי. השקופיות מוכנות להערכת מיקרוסקופיה.</li>
</ol>

<ol><li>Peters, A. H., Plug, A. W., van Vugt, M. J., de Boer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+drying-down+technique+for+the+spreading+of+mammalian+meiocytes+from+the+male+and+female+germline%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosome+Res%22%5BJournal%5D)">A drying-down technique for the spreading of mammalian meiocytes from the male and female germline.</a> Chromosome Res. 5, 66-68 (1997).</li>
<li>Namekawa, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postmeiotic+sex+chromatin+in+the+male+germline+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Postmeiotic sex chromatin in the male germline of mice.</a> Curr Biol. 16, 660-667 (2006).</li>
<li>Namekawa, S. H., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+nascent+RNA%2C+single-copy+DNA+and+protein+localization+by+immunoFISH+in+mouse+germ+cells+and+preimplantation+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Detection of nascent RNA, single-copy DNA and protein localization by immunoFISH in mouse germ cells and preimplantation embryos.</a> Nat Protoc. 6, 270-284 (2011).</li>
<li>Mahadevaiah, S. K., Costa, Y., Turner, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+RNA+FISH+to+study+gene+expression+during+mammalian+meiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Using RNA FISH to study gene expression during mammalian meiosis.</a> Methods in molecular biology. 558, 433-444 (2009).</li>
<li>Hall, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ectopic+human+XIST+gene+can+induce+chromosome+inactivation+in+postdifferentiation+human+HT-1080+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">An ectopic human XIST gene can induce chromosome inactivation in postdifferentiation human HT-1080 cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 8677-8682 (2002).</li>
<li>Huynh, K. D., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inheritance+of+a+pre-inactivated+paternal+X+chromosome+in+early+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Inheritance of a pre-inactivated paternal X chromosome in early mouse embryos.</a> Nature. 426, 857-862 (2003).</li>
<li>Namekawa, S. H., VandeBerg, J. L., McCarrey, J. R., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex+chromosome+silencing+in+the+marsupial+male+germ+line%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Sex chromosome silencing in the marsupial male germ line.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 9730-9735 (2007).</li>
<li>Namekawa, S. H., Payer, B., Huynh, K. D., Jaenisch, R., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-step+imprinted+X+inactivation%3A+repeat+versus+genic+silencing+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Two-step imprinted X inactivation: repeat versus genic silencing in the mouse.</a> Mol Cell Biol. 30, 3187-3205 (2010).</li>
<li>Ichijima, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MDC1+directs+chromosome-wide+silencing+of+the+sex+chromosomes+in+male+germ+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">MDC1 directs chromosome-wide silencing of the sex chromosomes in male germ cells.</a> Genes Dev. 25, 959-971 (2011).</li>
<li>Sin, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNF8+regulates+active+epigenetic+modifications+and+escape+gene+activation+from+inactive+sex+chromosomes+in+post-meiotic+spermatids%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">RNF8 regulates active epigenetic modifications and escape gene activation from inactive sex chromosomes in post-meiotic spermatids.</a> Genes Dev. 26, 2737-2748 (2012).</li>
</ol>

למחבר אין מה לחשוף.

בהכנת שקופיות תלת-ממדיות, שלב ההחלחלה מקדים את שלב הקיבעון. שלבים אלה מבוצעים ישירות על צינוריות חצי-חצי, ובכך משמרים את מבנה הכרומטין התלת מימדי. אפשרות חלופית לשימור מבנה הכרומטין עבור RNA / DNA FISH היא לבצע את שלב permeabilization ואת שלב הקיבעון בו זמנית. טכניקה חלופית זו בוצעה בתאי נבט כיס בעוברים קדם-השתלה של העכבר7,8. עם זאת, אם שלב הקיבעון מקדים את שלב ההחלחלה, הוא עשוי להוליד רקע ציטופלסמי גבוה. לכן, הקובע הקריטי של אופטימיזציה שקופיות עבור RNA ודגים DNA תלוי בסדר של חדירות ואת שלבי הקיבעון. משך שלב ...

באשכים, תאי נבט להבדיל זרע דיפלואידית דרך מיוזיס לתוך בוגר, זרע haploid. במהלך תהליך זה, מבנה הכרומטין הגרעיני של תאי נבט הוא שיפץ באופן רציף ודינמי. ממרחי פני השטח משמשים בדרך כלל לבדיקה ציטולוגית של תאי זרע בודדים. שיטה רווחת של התפשטות פני השטח מעסיקה טיפול היפוטוני שבאמצעותו תאים זרע בודדים מופצים ומשוטחים1. תנאים אלה הם אופטימליים לניתוח מפורט של כרומוזומים מיוטיים. תכונות כרומוזומליות כגון מצב סינפטי ומוקדי רקומביניזציה נצפו בקלות בשיטה זו. עם זאת, הטיפול ההיפוטוני משבש את ארכיטקטורת הכרומטין התת-גרעיני, ולכן טכניקה זו אינה מתאימה לניתוח מבני של גרעינים. כתוצאה מכך, שיטה משופרת תוכננה כדי לשמר את מבנה הכרומטין התלת מימדי של תאי נבט האשכים. שיטה זו נקראה שיטת השקופית התלת-ממדית (3D) (איור 1). שיטת שקופית 3D אפשרה זיהוי של לוקליזציה RNA המתהווה בגרעינים כי זה היה אופטימיזציה בתחילה כדי לבחון ביטוי גנים מצבי כרומטין במהלך התמיינות תא נבט האשכים על ידי פלואורסצנטיות RNA בהכלאה situ (FISH)2,3. שיטה תלת-ממדית זו חלה גם על השילוב של כשל חיסוני, דנ"א ודגי RNA. בנוסף, שיטה זו סייעה בגילוי כרומטין מין פוסט-מיוטי (PMSC), תא שקט של כרומוזומי המין שנמצאו בזרעונים פוסט-מיוטיים2.
שיטת השקופית בתלת-ממד עברה אופטימיזציה במקור באמצעות שילוב של שני שלבים חיוניים של הכנת שקופיות המשמשים בדרך כלל לכתמים גרעיניים: שלב הקיבעון שנועד לתקן חומרים גרעיניים וצעד ההחלחלה שנועד להסיר חומרים ציטופלסמיים על מנת לשפר את הנגישות של ריאגנטים מכתימים, כגון נוגדנים ובדיקות FISH. כפי שתואר קודם לכן בפרסום אחר3, נקבע כי שלב permeabilization חייב להקדים את שלב הקיבעון על מנת להשיג תוצאות אופטימליות עם רקע ציטופלסמי נמוך. בשיטת שקופית תלת-ממדית זו, שלב ההחלחלה ושלב הקיבעון הבאים מבוצעים ישירות על צינוריות חצי-שנתיות ואחריהן הניתוק המכני של תאי נבט עם מלקחיים לפני ציטוספין על שקופיות. שיטה חלופית עבור דג RNA של תאים spermatogenic פותחה במעבדה אחרת4. בשיטה זו, בהתאם לשיטת 3D, שלב permeabilization חייב להקדים את שלב הקיבעון על מנת להשיג תוצאות אופטימליות של RNA FISH.
הפרוטוקול הבא מתאר את שיטת השקופית תלת-ממדית ומספק דוגמה ליישום אפשרי, Cot-1 RNA FISH לגילוי RNAs גרעיניים. דנ"א קוט-1 מורכב מאלמנטים שחוזרים על עצמו בגנום. כאן, גשוש DNA קוט-1 הוא היברידית אינטרון ו UTR של התמלילים המתהווים, ובכך לזהות את האזורים הפעילים שעתוק בגרעין5,6. שקופיות תלת מימד הן רב-תכליתיות וניתן ליישם אותן על שילוב של טכניקות כשל חיסוני, DNA ו- RNA FISH על מנת לקבל בדיקה מפורטת של יחסים מרחביים בין ארכיטקטורת הכרומטין.

<table><tbody><tr><td>מיטת תינוק-1 DNA&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>18440-016</td><td></td></tr><tr><td>ערכת תיוג פלואורסצנטי Stratagene Prime-It Fluor</td><td>Agilent</td><td>300380</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת DNA זרע הרינג</td><td>Invitrogen</td><td>15634-017</td><td></td></tr><tr><td>אתנול. 200 הוכחה (מוחלטת)</td><td>Pharmco-aaper</td><td>111000200</td><td></td></tr><tr><td>נתרן אצטט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>פורמיד דה-יונים</td><td>אמריקן ביואנליטי</td><td>AB00600-00500</td><td></td></tr><tr><td>נתרן ציטראט טריבייס דיהידראט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>C8532</td><td></td></tr><tr><td>אלבומין סרום בקר</td><td>Lifeblood</td><td>Medical 77110-100</td><td></td></tr><tr><td>מלח נתרן דקסטרן סולפט מ- Leuconostoc spp.</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>D6001</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Invitrogen</td><td>A10491-01</td><td></td></tr><tr><td>סוכרוז</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>צינורות</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P6757</td><td></td></tr><tr><td>מגנזיום כלוריד הקסהידראט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>M0250</td><td></td></tr><tr><td>טריטון X-100</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>פרפורמלדהיד</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>76240</td><td></td></tr><tr><td>נתרן הידרוקסיד</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221465</td><td></td></tr><tr><td>פוספט חוצץ</td><td>מלח Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>VECTASHIELD מדיום הרכבה עם DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H1200</td><td></td></tr><tr><td>קומפלקס ריבונוקלאוזיד-ונדיל</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td>S1402S</td><td></td></tr><tr><td>Illustra MicroSpin G-50 עמודות</td><td>GE Healthcare</td><td>27-5330-01</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוצנטריפוגה</td><td>Eppendorf</td><td>5424</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים</td><td>VWR</td><td>300-050</td><td></td></tr><tr><td>צינורות מיקרוצנטריפוגה</td><td>Bioexpress</td><td>C-3262-1</td><td></td></tr><tr><td>Cytospin 3</td><td>שנדון</td><td></td><td></td></tr><tr><td>קופלין צנצנת</td><td>פישר</td><td>08-815</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost /Plus מיקרוסקופ שקופיות</td><td>פישר</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>צלחת 4 בארות</td><td>פישר</td><td>12-566-301</td><td></td></tr><tr><td>כיסוי זכוכית&nbsp;</td><td>חממת אוויר פישר</td><td>12-544-G</td><td></td></tr><tr><td></td><td>מדע מהפכני</td><td>RS-IF-203</td><td></td></tr></tbody></table>

שיטת הכנת שקופיות לשמירה על ארכיטקטורת כרומטין תלת מימדית של תאי נבט האשכים

Slide Preparation Method to Preserve Three-dimensional Chromatin Architecture of Testicular Germ Cells

במהלך התמיינות תאי נבט האשכים, המבנה של כרומטין גרעיני משתנה באופן דינמי. להלן שיטה שנועדה לשמר את סידור הכרומטין התלת מימדי של תאי נבט האשכים המצויים בעכברים; שיטה זו נקראה שיטת השקופית התלת-ממדית (תלת-ממדית). בשיטה זו, צינוריות האשכים מטופלים ישירות עם שלב חדירה שמסיר חומר ציטופלסמי, ואחריו שלב קיבעון שמתקן חומרים גרעיניים. לאחר מכן, הצינוריות מנותקות, השעיית התא היא ציטוספון, והתאים נצמדים לשקופיות. שיטה זו משפרת את הרגישות לגילוי מבנים תת-גרעיניים והיא ישימה עבור פלואורסצנטיות חיסונית, דנ"א ו- RNA בהכלאה במקום (FISH) והשילוב של שיטות זיהוי אלה. כדוגמה ליישום אפשרי של שיטת השקופית 3D, דג RNA Cot-1 מוצג כדי לזהות RNAs המתהווה. שיטת שקופית 3D תאפשר בדיקה מפורטת של יחסים מרחביים בין מבנה כרומטין, DNA, ו RNA במהלך התמיינות תא נבט האשכים.

תוצאה מייצגת של שקופית תלת-ממדית מוצגת באיור 2. בניסוי זה, Cot-1 RNA FISH בוצע כדי לזהות שעתוק המתהווה יחד עם immunostaining באמצעות נוגדנים נגד CBX1 ו γH2AX. כדי לשלב RNA FISH ו immunostaining, immunostaining בוצע ראשון, ואחריו RNA FISH כמתואר ב3. CBX1 הוא חלבון הטרוכרומטין הממוקם בהטרוכרומטין פריקנטרומרי וכרומוזומי מין שקטים במיאוזה הנקראת גוף XY (או גוף מין). γH2AX היא צורה זרחנית של גרסה היסטון H2AX ו לוקליזציה על גוף XY. בתמונה זו, אותות קוט-1 מצטברים באזורים אוכרומטיים, אך אינם נכללים בה...

החומר כאן מתאר שיטה שפותחה כדי לשמר את מבנה הכרומטין התלת מימדי של תאי נבט האשכים. שיטה זו נקראה שיטת השקופית התלת-ממדית (תלת-ממדית). שיטה זו משפרת את הרגישות לגילוי מבנים תת-גרעיניים והיא ישימה עבור פלואורסצנטיות חיסונית, דנ"א ופלואורסצנטיות RNA בהכלאה במקום (FISH).

During testicular germ cell differentiation, the structure of nuclear chromatin dynamically changes. The following describes a method designed to preserve ...

שיטת הכנת שקופיות תלת מימדית זו משמרת את סידור הכרומטין התלת מימדי של התאים כפי שהודגם עם תאי נבט אשכים של עכברים. ראשית, לחלחל את הצינורות הברזליים כדי להסיר את החומרים הציטופלזמיים ולשפר את הנגישות של ריאגנטים מכתימים כגון נוגדנים ובדיקות דגים. לאחר קיבוע החומרים הגרעיניים, נתק מכנית את תאי הנבט עם מלקחיים וציטוזין את הדגימות על שקופיות.לאחר מכן, רכוש נתונים עם מספר קטעי Z כדי לכסות גרעין בתלת מימד כאשר מיושמים באופן אסטרטגי תוצאות מהכנות שקופיות תלת מימדיות. באמצעות COT דג RNA אחד יכול להראות RNA מתהווה גרעיני כדי לזהות את האזורים הפעילים מבחינה שעתוק בגרעין. פיתחתי את השיטה הזו כשהייתי במעבדת הגנים בבית החולים הכללי של מסצ'וסטס.באותה תקופה, ביצעתי אופטימיזציה של שיטת הכנת השקופיות לתובנה פלואורסצנטית של RNA כותנה להכלאה, הנקראת גם דגים לזיהוי נמרים. חומצה ריבונוקלאית. בדיקות כותנה יכולות להכליא רצפים חוזרים באינטרונים וב-tls ולדמיין את אתר השעתוק הפעיל. דגי כותנה RA דורשים שימור של הפצת RNA גרעיני.נקודת המפתח של שיטת הכנה נכונה זו היא ששלבי האיזציה צריכים להמשיך שלב הקיבוע. כדי להסיר את הרקע הפלזמי של Cy, פרמו את צינורות ה-OUS מאשך קרוע ב-PBS על קרח, העבירו כמה חתיכות של צינורות באורך של חמישה עד 10 מילימטרים ל-500 מיקרוליטר של מאגר CSK עם 0.5% טריטון X 100, ודגרו במשך שש דקות

slide-preparation-method-to-preserve-three-dimensional-chromatin

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

זה פרוטוקול וידאו ממחיש את הטכניקה סקווש המשמשים את המעבדה יוהנסן...

הכנת מועכת תסיסנית Polytene כרומוזום עבור סימון נוגדן

יכולים להיות מבודדים הכרומוזומים מתאי חיים כגון לימפוציטים או fibroblasts עור, ומאורגניזמים כולל בני אדם או עכברים. הכנות כרומוזום אלה יכולים להיות מנוצלים נוספים עבור ה-G-פסים שיגרתי ונהלים ציטוגנטית מולקולריים כגון הקרינה הכלאה באתרו (FISH), הכלאה השוואתית גנומית (CGH), וkaryotyping ספקטרלי (SKY).

הכנת כרומוזום מתאים בתרבית

שיטות לבידוד והכנת דגימות דרוזופילה אשכים (לחיות וקבוע) להדמיה על ידי שלב בניגוד ומיקרוסקופ פלואורסצנטי מתוארים במסמך זה.

ניתוח ציטולוגית של תאי זרע: הכנות בשידור חי והקבועות של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; אשכים

אנו מספקים כאן פרוטוקול יעיל ואמין עבור immunostaining, הקרינה הכלאה באתר, מכתים DNA ואחרי הדמיה בביציות thaliana ארבידופסיס כל הר כמותיים, ברזולוציה גבוהה. שיטה זו השתמשה בהצלחה כדי לנתח שינויי הכרומטין ואדריכלות גרעינית.

שיטה יעילה לניתוח כמותי, תא בודד של הכרומטין שינוי ואדריכלות גרעינית בהר שלם-ביציות ב<em&gt; ארבידופסיס</em

מיוזה הוא תהליך התפתחותי שבו נוצרות גמטות דרך סבב אחד של שכפול ה-DNA, שני סיבובים רצופים של כרומוזום סגרגציה. מיוזה יונקים יכולים להיבדק על ידי ניצול טכניקה כדי להכין ממרחים כרומוזום meiotic. . הנה, נדגים שיטה של הכנת השטח-התפשטות גרעינים של העכבר spermatocytes.

הכנה של כרומוזום Meiotic מתפשטת העכבר Spermatocytes

Oogenesis ביונקים ידוע להיות מועדת לטעויות, במיוחד עקב כרומוזום missegregation. כתב יד זה מתאר שיטות הכנה כרומטין להפיץ prophase העכבר, מפה של אני, oocytes ביים השני. טכניקות יסוד אלה מאפשרים לימוד חלבוני כרומטין מכורך כרומוזום מורפולוגיה ברחבי oogenesis יונקים.

כרומטין להפיץ את ההכנות לניתוח של העכבר Oocyte התקדמות מן Prophase כדי מפה של השני

מוצג כאן הוא פרוטוקול עבור העשרת החומר העשיר pachytene, עגול spermatocytes, ו להאריך spermatocytes מתוך האשכים עכבר למבוגרים באמצעות סרום מתמשך פרה אלבומין הדרגתי עם מעבדה סטנדרטית ציוד.

העשרה של פכיטנא ספרציטים וספרטידים מאשכים עכבר באמצעות ציוד מעבדה סטנדרטית

כפולות משטח גרעיני הם כלי הכרחי עבור לימוד אירועי כרומוזום במהלך meiosis. כאן אנו מדגימים שיטה כדי להכין ולדמיין כרומוזומים מיוטיים במהלך prophase הייתי מתוך הדגים הספרציטים.

הכנת כרומוזום מיוסטי כפולות מדגים בזימטציטים

המטרה של פרוטוקול זה היא לנתח את חלוקת התא ברקמה שלמה על ידי מיקרוסקופ התאים החיים והקבוע באמצעות דרוסוילה מיוטיק מאיוציטים. הפרוטוקול מדגים כיצד לבודד את כל האשכים שלמים, מזחלים מדרוזופילה ומהגלמים המוקדמים, וכיצד לעבד ולטעון אותם למיקרוסקופיה.

הכנת מדרוזופילה זחל ופופל אשכים לניתוח חטיבת תאים בשידור חי, רקמה שלמה

אנו מציגים כאן פרוטוקול משופר להכנה וחיסון של כל ההר של אשכי דרוזופילה, מתאים למיקרוסקופיה קונפוקלית וגם מאפשר תיוג ניתן לשחזור ואמין. אנו ממחישים פרוטוקול זה על ידי ייצוג תלת מימדי וכימות של ניסויי קולוקליזציה על זרעונים S4-S5 גדולים.

חיסון של אשכי דרוזופילה הר שלם לניתוח קונפוקלי תלת מימדי של זרעונים גדולים

שגיאות מיוטיות בסינפסות ורקומבינציה נפוצות בביציות של יונקים. ניתוח קפדני של חלבונים המעורבים בתהליכים אלה חיוני להבנה כיצד ומדוע ביציות משתבשות לעתים קרובות. הטכניקות המוצגות כאן מאפשרות ניטור מקיף של רקומבינציה וסינפסות כדי להעריך את איכות הביציות בעכברים.

הכנת התפשטות כרומוזומים מיוטיים מביציות עכבר להערכת סינפסה ורקומבינציה

למד שיטת הכנת שקופיות תלת-ממדית לשימור ארכיטקטורת כרומטין בתאי נבט האשכים. השיטה משפרת רגישות זיהוי מבנים תת-גרעיניים ומתאימה לטכניקות פלואורסצנציה שונות.

שיטת הכנת שקופיות לשמירה על ארכיטקטורת כרומטין תלת מימדית של תאי נבט האשכים

גלה סרטונים נוספים