שיטת הכנת שקופיות לשמירה על ארכיטקטורת כרומטין תלת מימדית של תאי נבט האשכים

שיטת הכנת שקופיות תלת מימדית זו משמרת את סידור הכרומטין התלת מימדי של התאים כפי שהודגם עם תאי נבט אשכים של עכברים. ראשית, לחלחל את הצינורות הברזליים כדי להסיר את החומרים הציטופלזמיים ולשפר את הנגישות של ריאגנטים מכתימים כגון נוגדנים ובדיקות דגים. לאחר קיבוע החומרים הגרעיניים, נתק מכנית את תאי הנבט עם מלקחיים וציטוזין את הדגימות על שקופיות.

לאחר מכן, רכוש נתונים עם מספר קטעי Z כדי לכסות גרעין בתלת מימד כאשר מיושמים באופן אסטרטגי תוצאות מהכנות שקופיות תלת מימדיות. באמצעות COT דג RNA אחד יכול להראות RNA מתהווה גרעיני כדי לזהות את האזורים הפעילים מבחינה שעתוק בגרעין. פיתחתי את השיטה הזו כשהייתי במעבדת הגנים בבית החולים הכללי של מסצ'וסטס.

באותה תקופה, ביצעתי אופטימיזציה של שיטת הכנת השקופיות לתובנה פלואורסצנטית של RNA כותנה להכלאה, הנקראת גם דגים לזיהוי נמרים. חומצה ריבונוקלאית. בדיקות כותנה יכולות להכליא רצפים חוזרים באינטרונים וב-tls ולדמיין את אתר השעתוק הפעיל. דגי כותנה RA דורשים שימור של הפצת RNA גרעיני.

נקודת המפתח של שיטת הכנה נכונה זו היא ששלבי האיזציה צריכים להמשיך שלב הקיבוע. כדי להסיר את הרקע הפלזמי של Cy, פרמו את צינורות ה-OUS מאשך קרוע ב-PBS על קרח, העבירו כמה חתיכות של צינורות באורך של חמישה עד 10 מילימטרים ל-500 מיקרוליטר של מאגר CSK עם 0.5% טריטון X 100, ודגרו במשך שש דקות על קרח. כעת העבירו את כל הצינורות לתמיסה של 4% P-F-A-P-B-S בבאר אחת של צלחת ארבע בארות דגירה למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן, דגרו את כל הצינורות ב- PBS למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. הגדר את תאי הסיבוב של cyto ו-cyto spin במהלך תקופות הדגירה בצד האחורי של מגלשת זכוכית, העביר את כל הצינורות ל-30 מיקרוליטר של PBS. לאחר מכן השתמש בקצות של שני מלקחיים כדי לקרוע את הצינורות לחתיכות.

קוצצים את הצינורות בכיוון אופקי על ידי חיתוך הצינורות בין קצות שני מלקחיים ומשיכת המלקחיים אופקית. לאחר הוספת 30 מיקרוליטר PBS, מערבבים את המתלה על ידי פיפטינג, ואז מעבירים אותו לצינור מיקרו צנטריפוגה ומוסיפים PBS לנפח כולל של 1.3 מיליליטר. כעת החל 100 מיקרוליטר של המתלה על כל אחד מתאי הסיבוב של ציטו. ציטו.

סובב את הדגימות ב-2000 סל"ד למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. יבש את השקופיות על ספסל מעבדה למשך מספר דקות בטמפרטורת החדר באמצעות צנצנת קופלן המכילה PBS. שוטפים את השקופיות במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן העבירו את השקופיות ל-70% אתנול למשך שתי דקות לפחות. בתגובה של 20 מיקרוליטר הוסיפו 100 ננוגרם שנתפסו, בדיקת NA 1D, קומפלקס ריבונוקלאוטיד ונדיל 20 מילי-מולרי ומאגר הכלאה. בעזרת מכונת PCR, דגרו במשך 10 דקות בטמפרטורה של 80 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן פראה.

מדרגות כריעה בטמפרטורה של 42 מעלות צלזיוס עד שהן מוכנות לשימוש. כעת יש לייבש את המגלשות ב-80% אתנול למשך שתי דקות, ולאחר מכן 100% אתנול למשך שתי דקות. יש לייבש את ההחלקות לחלוטין על ספסל המעבדה בטמפרטורת החדר.

כעת הנח את השקופית על תא קופסת טיפים בטמפרטורה של 42 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, צנטריפוגה קצרה של בדיקות הקדם-צורך ופיפטה אותם ישירות על המגלשות המיובשות. הנח בעדינות פתק כיסוי מעל המגלשה לשלב ההכלאה של לפחות שש שעות ב-42 מעלות צלזיוס.

מחממים את תמיסות הכביסה בצנצנות קופלן בטמפרטורה של 42 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות באמבט מים בעזרת סכין גילוח, מסירים את החלקת הכיסוי מקצה המגלשה מבלי לשרוט את הדגימות, טובלים בהדרגה את המגלשות בתמיסת הכביסה למשך חמש דקות כל אחת. החל מצנצנת הקופלן הראשונה המכילה שני XSSC ו-50% צורה באמצע, ואחריה צנצנת הקופלן השנייה המכילה שני XSSC ו-50% צורה באמצע. ואז שתי הצנצנות האחרונות המכילות שני XSSC.

לאחר מכן הוסף 20 מיקרוליטר של מדיית הרכבה DPI לדגימות והנח פתק כיסוי. לחץ בעדינות על זכוכית הכיסוי וכתם את אמצעי ההרכבה הנוסף עם רקמת ניקוי. בניסוי זה שנתפס דג RNA אחד בוצע כדי לזהות בו זמנית שעתוק מתהווה וצביעה חיסונית של חלבונים המתמקמים באימונוהיסטוכימיה של גוף XY.

ב-PACU זה, זרע הזרע זיהה את חלבון ההטרוכרומטין CCB X אחד וגם צורה זרחנית של וריאנט היסטון H two A X בגוף XY. הדג שהתקבל תפס אותות אחד שהצטבר על האזורים הכרומטיים האלקטרוניים בהתפשטות פני השטח שטופלו בתמיסה היפוטונית. מבנה הכרומטין התלת מימדי מופרע וניתן ללכוד את כל צירי הכרומוזומים המיוטיים במישור Z יחיד.

הכנת שקופיות תלת מימד, לעומת זאת, שומרת על מבנה הכרומטין השלם בעקבות הליך זה. שיטת הכנה נכונה זו ישימה עבור דגי DNA ו-RNA אימונופלואורסצנטיים, והשילוב של שיטות זיהוי אלה.