Name: במבחנה Assay כדי להעריך את ההשפעה של immunoregulatory מסלולים על פונקצית Effector הנייד HIV-ספציפית T מסוג CD4 (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-15T17:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 26 s
Description: חקור מסלולים אימונורגולטוריים המשפיעים על תאי T CD4 ספציפיים ל-HIV באמצעות בלוקדת נוגדנים. שיטה זו מאפשרת הערכת הפרשת ציטוקינים וניתוח פנוטיפי לחקר תפקוד תאי החיסון.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לגורדון פרימן למתן נוגדן החסימה אנטי PD-L1. אנו מודים לצוות הרפואי ומעבדה בבית החולים הכללי מסצ&#39;וסטס וכל משתתפי המחקר לתפקיד רב הערך שלהם בפרויקט זה. מחקר זה נתמך על ידי המכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות של המכונים הלאומיים לבריאות (PO1 AI-080,192; DEK), הלאומי ללב ריאות ודם מכון של המכון הלאומי לבריאות (RO1 HL-092,565; DEK). DEK נתמך פרס קריירה Scholar המחקר של בריאות קרן המחקר לקוויבק (FRQS) על ידי. FP נתמך על ידי מענק מלגה של כללי וועד הפועל של בית החולים מסצ&#39;וסטס על מחקר והמוסד לבריאות הגלובלית של הרווארד (HGHI).

1. דלדול ובידוד של PBMCs באמצעות הפרדת Ficoll <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרוקן תאי CD8 + T על ידי הוספת קוקטייל דלדול אדם CD8 + ב50 / מיליליטר μl של דם מלא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים היטב דגירה עבור 20 דקות בטמפרטורת חדר (18-25 ° C). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירה, לערבב דם כל עם HBSS (תמיסת מלח מאוזנת של האנק ללא Ca 2 + או Mg 2 +) ושכבה מעל Histopaque. ספין ב340 RCF ל30 דקות (לא בלם, האצה איטית). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף PBMCs ולהעביר לחרוטי 50ml חדשים. לשטוף 2x עם 45 RPMI מיליליטר 1640 בתוספת 50 IU פניצילין, 50 מיקרוגרם / מיליליטר סטרפטומיצין, 2 מ&quot;מ L-גלוטמין, וHEPES 1% על ידי ספינינג 10 דקות ב 340 RCF. </li></ol> 2. מצור נוגדנים וגירוי אנטיגן ספציפי של תאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי resuspend ב2x10 6 לכל מצב בRPMI 1640 מכיל 10% סרום אדם בתוספת 50 IU פניצילין, 50 מיקרוגרם / מיליליטר סטרפטומיצין, 2 מ&quot;מ L-גלוטמין, ו -1% HEPES,היווה 500 μl לכל מצב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquot 500 μl של תא השעיה לכל צינור FACS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בהתאם למסלול שנחקר, להוסיף PD-L1, IL-10Rα חסימת נוגדנים ו / או בקרות אלוטיפ ב10 מיקרוגרם / מיליליטר ו דגירה במשך 15 דקות ב37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעורר תאים עם בריכת פפטיד HIV-1 Gag בריכוז סופי 1 מיקרוגרם / מיליליטר / פפטיד. כמו כן כולל שליטת &quot;אין גירוי&quot; לכל מצב חסימה. לדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 למשך 48 שעות. </li></ol> 3. איסוף וניתוח של supernatant <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 48 שעות, ספין למטה צינורות FACS ל7 דקות ב340 RCF. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף בזהירות 2 x 225 supernatant μl בצינורות Eppendorf עבור מערכי חרוז Luminex מבלי להפריע גלולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשבית וירוס בsupernatant נאסף עם 25 μl 0.5% PBS-Tween לתת ריכוז סופי של 0.05% PBS-Tween. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> supernatants חנות שנאסף שאינם immediately משמש ב-80 ° C במקפיא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדוד ריכוזים ציטוקינים רצויים באמצעות ערכת Millipore Luminex על פי הפרוטוקול של היצרן. </li></ol> 4. איסוף וניתוח פנוטיפי של תאים באמצעות cytometry הזרימה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר איסוף supernatant, לשטוף תאים ב-PBS 3ml. ספין תאים למשך 7 דקות ב340 RCF ולמזוג לשטוף עודף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כתם לכדאיות באמצעות ערכת כתם תאים מתות בשידור חי / DEAD ניתן לתקן על פי הפרוטוקול של היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו תאי PBS למשך 7 דקות ב340 RCF וב 4 ° C. Resuspend ב 100 μl FBS 1% PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם מכתים את מונוציטים או תאי המציגים אנטיגנים אחרים, קולטני Fc בלוק על ידי הוספת 1.4 μl של FCR חסימה מגיב ומערבולת לערבב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה של 10 דקות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת נוגדני פני השטח, מערבולת, ו דגירה של 20 דקות ב 4 ° C בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף תאים עם FBS 1% PBS, למזוג שטיפה עודפת, ולהוסיף 200 paraformaldehyde μl 4%. לדגורבטמפרטורת חדר למשך 20 דקות בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף תאים עם FBS 1% PBS, resuspend ב 250 μl FBS 1% PBS, ולרכוש בmultilaser cytometer זרימה (לדוגמא BD LSRII או Fortessa). </li></ol> 5. ניתוח של תאים באמצעות qRT-PCR <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתאים לא ניתח באמצעות cytometry זרימה: לאחר איסוף supernatant, תאי lyse ב300 μl RLT Qiagen המאגר המכיל 1% בטא mercaptoethanol. אם לא ממשיך בפרוטוקול, ניתן להקפיא תאים ב -80 ° C לאחר שלב זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בודד RNA באמצעות ערכת בידוד RNA הבאה הפרוטוקול של היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסנתז cDNA מ-RNA באמצעות ערכת סינתזת cDNA הבאה הפרוטוקול של היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע PCR כמותיים תוך שימוש בטכנולוגית SYBR ירוק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ליצור תמהיל פריימר עבור כל צבע יסוד המשמש כוללים גנים משק בית (למשל IL-13, IL-10, IFN-γ, GAPDH) על ידי הוספת פריימרים לnuclease ללא מים לתת ריכוז סופי של 10מיקרומטר. שמור על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יצירת תערובת הורים עבור כל צבע יסוד על ידי הוספת מים 10.5 μl nuclease חינם, 12.5 ירוק SYBR μl, ותמהיל פריימר μl 1 לכל צלחת היטב. שמור על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה תערובת הורים 24 μl לבאר כל הצלחת שתשמש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת cDNA μl 1 היטב כל אחד על פי תבנית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כובע בארות וצלחת צנטריפוגות במשך 3 דקות ב800 RCF. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל צלחת על מכונה qRT-PCR, למשל מכשיר Stratagene MX3005P. </li></ol> 6. הסתגלות לתאית ציטוקין הכתמה ב48 שעות הוספת Brefeldin וMonensin 6 שעות לפני מכתים ציטוקינים תאיים. Brefeldin מתווסף בריכוז של 10 מיקרוגרם / מיליליטר בזמן Monensin מתווסף על פי הוראות יצרן. לנוחיותכם, ניתן להוסיף Brefeldin 12 שעה לפני להכתים בריכוז של 5 מיקרוגרם / מיליליטר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי כתם פני השטח, לשטוף תאים עם FBS PBS 1% וכתם בציטוקינים tracellular כגון IL-12, IFN-γ, ו-TNF-α באמצעות ערכת קיבוע / permeabilization פתרון ופרוטוקול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף תאים, resuspend ב 250 μl FBS 1% PBS, ולהפעיל על multilaser cytometer זרימה (LSR למשל BD השני או Fortessa). </li></ol> 7. הסתגלות למיון תאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 16 שעות לאחר גירוי, כתם לכדאיות באמצעות ערכת כתם תאים מתות בשידור חי / DEAD ניתן לתקן על פי הפרוטוקול של היצרן. שמור את התאים על קרח במהלך ההליך כולו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף תאים עם PBS במשך 7 דקות ב340 RCF וב 4 ° C. Resuspend ב 100 μl FBS 1% PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת נוגדני פני השטח, מערבולת לערבב, ותאי דגירה על קרח בחושך עבור 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו תאים עם FBS 1% PBS ב340 RCF וב 4 ° C ו resuspend ב 500 μl RPMI הקר 1640 המכיל 10% בסרום שור עוברי בתוספת 50 IU פניצילין, 50 מיקרוגרם / מיליליטר סטרפטומיצין, 2 מ&quot;מ L-גלוטמין, ו -1% HEPES. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי סינון באמצעות 5 מיליליטר פוליסטTube מסביב לתחתית רנה עם מכסה תא מסננת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן צינורות איסוף למין על ידי הוספת 200 RPMI μl 1640 המכיל 10% בסרום שור עוברי בתוספת 50 IU פניצילין, 50 מיקרוגרם / מיליליטר סטרפטומיצין, 2 מ&quot;מ L-גלוטמין, וHEPES 1% לצינור אחד. שמור את כל הצינורות על קרח במהלך מיון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשידור חי למיין את תת התא של ריבית על מכשיר (לדוגמא BD FACS Aria II) ממוקם במתקן המצויד לחומרים ביולוגיים מסוכנים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי התאים מוינו, תאי מקום בחזרה בחממה לסכום רצוי של זמן ופעל עם ניתוח אוסף supernatant / Luminex וניתוח אוסף התא גלולה / ה-PCR. </li></ol>

<ol><li>Zajac, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+immune+evasion+due+to+persistence+of+activated+T+cells+without+effector+function%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Viral immune evasion due to persistence of activated T cells without effector function.</a> J. Exp. Med. 188, 2205-2213 (1998).</li>
<li>Wherry, E. J., Blattman, J. N., Murali-Krishna, K., vander Most, R., Ahmed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+persistence+alters+CD8+T-cell+immunodominance+and+tissue+distribution+and+results+in+distinct+stages+of+functional+impairment%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Viral persistence alters CD8 T-cell immunodominance and tissue distribution and results in distinct stages of functional impairment.</a> J. Virol. 77, 4911-4927 (2003).</li>
<li>Kwon, D. S., Kaufmann, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+and+detrimental+roles+of+IL-10+in+HIV+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+Cytokine+Netw%22%5BJournal%5D)">Protective and detrimental roles of IL-10 in HIV pathogenesis.</a> Eur. Cytokine Netw. 21, 208-214 (2010).</li>
<li>Porichis, F., Kaufmann, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+PD-1+in+HIV+pathogenesis+and+as+target+for+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+HIV%2FAIDS+Rep%22%5BJournal%5D)">Role of PD-1 in HIV pathogenesis and as target for therapy.</a> Curr. HIV/AIDS Rep. 9, 81-90 (2012).</li>
<li>Wherry, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+exhaustion%5BTitle%5D)+AND+%22Nat%22%5BJournal%5D)">T cell exhaustion.</a> Nat. 12, 492-499 (2011).</li>
<li>Trautmann, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Upregulation+of+PD-1+expression+on+HIV-specific+CD8%2B+T+cells+leads+to+reversible+immune+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Upregulation of PD-1 expression on HIV-specific CD8+ T cells leads to reversible immune dysfunction.</a> Nat. Med. 12, 1198-1202 (2006).</li>
<li>Day, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PD-1+expression+on+HIV-specific+T+cells+is+associated+with+T-cell+exhaustion+and+disease+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">PD-1 expression on HIV-specific T cells is associated with T-cell exhaustion and disease progression.</a> Nature. 443, 350-354 (2006).</li>
<li>Brockman, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-10+is+up-regulated+in+multiple+cell+types+during+viremic+HIV+infection+and+reversibly+inhibits+virus-specific+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">IL-10 is up-regulated in multiple cell types during viremic HIV infection and reversibly inhibits virus-specific T cells.</a> Blood. 114, 346-356 (2009).</li>
<li>Barber, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restoring+function+in+exhausted+CD8+T+cells+during+chronic+viral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Restoring function in exhausted CD8 T cells during chronic viral infection.</a> Nature. 439, 682-687 (2006).</li>
<li>Zhang, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PD-1+up-regulation+is+correlated+with+HIV-specific+memory+CD8%2B+T-cell+exhaustion+in+typical+progressors+but+not+in+long-term+nonprogressors%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">PD-1 up-regulation is correlated with HIV-specific memory CD8+ T-cell exhaustion in typical progressors but not in long-term nonprogressors.</a> Blood. 109, 4671-4678 (2007).</li>
<li>Ndhlovu, Z. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-dimensional+immunomonitoring+models+of+HIV-1-specific+CD8+T-cell+responses+accurately+identify+subjects+achieving+spontaneous+viral+control%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">High-dimensional immunomonitoring models of HIV-1-specific CD8 T-cell responses accurately identify subjects achieving spontaneous viral control.</a> Blood. 121, 801-811 (2013).</li>
<li>Porichis, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Responsiveness+of+HIV-specific+CD4+T+cells+to+PD-1+blockade%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Responsiveness of HIV-specific CD4 T cells to PD-1 blockade.</a> Blood. 118, 965-974 (2011).</li>
<li>Kwon, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD4%2B+CD25%2B+regulatory+T+cells+impair+HIV-1-specific+CD4+T+cell+responses+by+upregulating+interleukin-10+production+in+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">CD4+ CD25+ regulatory T cells impair HIV-1-specific CD4 T cell responses by upregulating interleukin-10 production in monocytes.</a> 86, 6586-6594 (2012).</li>
</ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

אוסף supernatant הוא חלק הכרחי של עיצוב ניסיוני זה. כאשר קצירת supernatants עבור assay Luminex, aliquots נעשו והמשיכו ב-80 ° C כדי למנוע פירוק חלבונים בשל ההפשרה להקפיא מחזורים. הקפאה והפשרה יכולה להיות תהליכים קשים לחלבונים, ועל ידי מזעור הקפאה מפשירה, אות תהיה מוגדלת במבחנים. לכן, קל יותר להשיג נתונים הדיר ומדויקים יותר כאשר עובדים מaliquots כי כבר-מופשר הקפאה אותו מספר הפעמים. אנחנו ביצענו בעבר ניתוח הקינטית ש...

במהלך זיהומים נגיפיים מתמשכים, תאים הספציפי-T וירוס לרכוש ליקויים תפקודיים בתהליך המכונה תשישות תא T. בשלב מוקדם במחקרי vivo במודל העכברי LCMV של זיהום נגיפי כרוני ציין כי תאי T ספציפי וירוס המותשים צמצמו פונקצית cytolytic כנגד תאים נגועים בנגיף, לאבד את היכולת שלהם להתרבות וצמצמו יכולת לייצר ציטוקינים כגון IL-2, TNF- α וIFN-γ 1,2. רשת מורכבת של מסלולי immunoregulatory, כגון PD-1 ו-IL-10, הם שהוגברו במהלך זיהומים כרוניים ותורמת לתפקוד תא T (הנסקרת ב 3,4). בvivo ממשל של חסימת נוגדנים נגד מסלולים מעכבים אלו בעכבר LCMV דגם משוחזר תפקוד של תאי T ספציפי וירוס מותשים וסליקה נגיפית משופרת, המציין כי תשישות תא T היא תופעה הפיכה באופן חלקי (הנסקרת ב 5). ממצאים על המודל LCMV דואר הוארך במהירות לדלקות ויראליות כרוניות אנושיות כמו HBV, HCV ו-HIV 5. בהידבקות ב-HIV-1 כרונית, PD-1 ו-IL-10 מסלוליהם הוגברו בנושאים נגועים ולתאם עם פרמטרים של התקדמות מחלה, באופן ישיר עם העומס הנגיפי והפכו עם CD4 לספור 6-8. מצור נוגדן של מסלולי PD-1 או IL-10 בהתפשטות מבחנה המשוחזרת של תאי CD4 ו CD8 T-HIV ספציפיים המצביעים על כך, בדומה למודל של עכברי LCMV, תשישות תא T בבני האדם היא תופעה הפיכה באופן חלקי. עם זאת, בשל האופי העדין של ניסויים על דגימות אנושיות, כמו גם מגבלות ברגישות של מבחני חוץ גופייה, חקירה יסודית של פרופילי השיקום התפקודי הושגו על ידי התערבויות אלה הוא בולטים נעדרו. מבחני למניעת הפצת נשק היו, עד כה, המבחנה assay אמין רק בנבדק במרבית המחקרים, אך יש חוסר מדהים של ראיות על ההשפעה של בין אלהventions על: 1) יכולת ההרג של תאי T ציטוטוקסיים, 2) השפעת נגיפים של תאי T על שכפול נגיפי, 3) פרופיל הפרשת ציטוקינים, ו4) ההשפעה על עזרה תא T מסוג CD4 בתת תא אחר. מכתים ציטוקינים תאיים (ICS) הוא זרימה מאוד שימושית ושימוש נרחב assay המבוסס cytometry המשמש לזיהוי ייצור של ציטוקינים בסוגי תאים שונים בשני עכברים ובני אדם. כמו כן, נעשה שימוש כדי לחקור את ההשפעה של מצור נוגדן של מסלולים מעכבים. במבחני ICS, הפרשת ציטוקינים חסומה על ידי התוספת של Brefeldin ו / או Monensin. ציטוקינים לכודים בתוך התאים ולאחר מכן זוהו עם נוגדני ניאון באמצעות cytometry זרימה צבעוני. משך assay הוא מוגבל בדרך כלל 6 או 12 שעות לאחר גירוי אנטיגן שכן הן Brefeldin וMonensin, אשר מתווספים בדרך כלל תוך 2 שעות של בנוסף אנטיגן, הם רעילים לתאים. ICS assay הוא טכניקה רבת עוצמה שהייתה לי שימושיn החקירה של ההשפעה של in vivo ממשל של חסימת התערבות נוגדנים בעכברים שבו תאים שהוצאו לאחר תקופה מסוימת של זמן לאחר חשיפת נוגדן 9. עם זאת, ישנן מספר מגבלות ליישום של גישה ניסויית זה כדי להעריך את ההשפעה של המצור על קולטנים מעכבים בדגימות אנושיות. בעת ביצוע התערבויות נוגדן של מסלולים מעכבים בגירוי 6 או 12 שעות במבחנה (בדרך כלל במקרה של דגימות אנושיות), המצור על קולטנים מעכבים ברוב המקרים אינו משנה את התדירות של תגובת תאי T אנטיגן הספציפי כפי שהיא נמדדת על ידי מבחני סטנדרטיים ICS 6, 7. מדידות של ייצור ציטוקינים לכל תא כפי שהיא נמדדת על ידי עוצמת הקרינה ממוצעת או החציוני נתנו תוצאות לא עקביות 6, 7, 10. מצד השני, כאשר ICS מתבצע בנקודת זמן מאוחר לאחר גירוי (כלומר שישה ימים), שינויים במספר ג מפרישי ציטוקיניםניתן לצפות אמות. ההבדלים הם השפעה משולבת של התפשטות שהשתנתה, הישרדות, ושינויים בתפקוד מפעיל המצטברים על פני תקופת הזמן המוגדרת 6. דרך אחת להתגבר באופן חלקי על המגבלות האלה היא כדי לדגור במשך תקופות זמן ארוכות יותר (36 שעה למשל, 60 שעה, וכו &#39;.) עם האנטיגן לפני התוספת של חוסם הפרשת ציטוקינים מבלי להמתין ללהתרחש התפשטות. אנחנו השתמשנו בהצלחה בשיטה זו כדי לקבוע את קינטיקה של הפרשת ציטוקינים על ידי תאי CD4 ו CD8 T-HIV הספציפיים 11,12, עם זאת, גישה זו אינה מסוגלת לזהות את תגובות קטנות ולא תיתן תוצאה משולבת של סך הפרשת ציטוקינים המתרחשת מאז גירוי. לכן, ICS הוא לא מספיק שיטה רגישה כדי לזהות את ההשפעה של מצור של מסלולים מעכבים על הכמות של ציטוקינים המיוצרת על ידי תאי T מופעלים לעומת quantitation ציטוקינים mRNA או מדידות של הפרשת ציטוקינים בsupernatanלא באותן נקודות הזמן. בנוסף, רוב ציטוקינים המיוצרים על ידי תאי T מופעלים לפעול באופנה autocrine על ידי תרומה למשוב חיובי או שלילי לולאות באמצעות אינטראקציה עם תאי המציגים אנטיגנים. לכן, תוספת של Brefeldin או Monensin במהלך assay ICS מונעת הפרשת ציטוקינים וכך הגירוי של תאי T הוא לא אופטימלי. לבסוף, זיהוי של ציטוקינים מרובים עם ICS הוא מוגבל על ידי זמינה והרגישות של נוגדנים לזיהוי של ציטוקינים עם cytometry זרימה, כמו גם מאילוצים במספר fluorochromes, שניתן להשתמש בו זמנית בכל פנל נתון. פיתחנו במבחנה גישה ניסויית רגישה מאוד כדי להעריך את ההשפעה של מסלולי immunoregulatory בויסות הפרשת ציטוקינים על ידי תאי T מסוג CD4 HIV-ספציפיים ולאחר מכן עזרה CD4 לאנטיגן הצגת תאים (נגמ&quot;שים) ותאי הרג טבעי (תאי NK). גם בשיטה זו ניתן להשתמש כדי להעריך את סבלנותct של מצור של מולקולות מעכבות על תפקוד תאי CD8 T על ידי depleting תאי T מסוג CD4 מPBMCs או על ידי גירוי עם פפטידים אופטימליים שמוכרים רק על ידי תאי CD8 T. בניגוד למבחני מכתים ציטוקינים תאיים, החלטנו שלא להתערב בהפרשת ציטוקינים על ידי תאי T מסוג CD4 HIV-ספציפיים על מנת להיות מסוגל: 1) לבצע כימות מדויק יותר של רמות ציטוקינים המיוצרים; 2) לחקור פנל רחב יותר של ציטוקינים או מולקולות מפעיל: 3) להעריך את ההשפעה של ציטוקינים המיוצרים על ידי תאי T מסוג CD4 HIV-ספציפיים על תת תא אחר. אנו לעורר PBMCs המדולדלת CD8 עם בריכת פפטיד Gag-HIV-1 בנוכחות חסימת נוגדנים למסלול immunoregulatory של עניין. לאחר הזמן הרצוי של דגירה, בדרך כלל 48 שעות, אנו אוספים supernatants למדוד הפרשת ציטוקינים עם מערכי חרוז ולאסוף את כדורי תא או לניתוח פנוטיפי של תת תא אחר או לניתוח תעתיק. של לב, בזמן t48 נקודת זמן שעות שלו, אנחנו לא לזהות אוכלוסייה משמעותית של תאים מתרבים T 12. זוהי גישה גמישה וכמה עיבודים של עיצוב זה יכול להיות מיושמים לטיפול בהשערות שונות. לדוגמא, תת תאים הבודדים (כגון תאי HIV-ספציפיים T מסוג CD4 או PD-1 תאי T מסוג CD4 גבוהים, וכו &#39;.) ניתן למיין לאחר 12 שעות של דגירה לפני דגירה נוספת ל36 שעה אחריו אוסף של supernatants וכדורי תא כדי לחקור באופן ספציפי יותר את ההשפעה של התערבויות מצור על הפרשת ציטוקינים על ידי אוכלוסיות מוגדרות של PBMCs.

<table><tbody><tr><td>תמיסת מלח מאוזנת של הנקס ללא Ca2+ או Mg2+</td><td>Sigma</td><td>H9394</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Sigma</td><td>R0883</td><td></td></tr><tr><td>Histopaque-1077</td><td>Sigma</td><td>10771</td><td></td></tr><tr><td>סרום אנושי AB</td><td>Gemini BioProducts</td><td>100-512</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין/סטרפטומיצין</td><td>Mediatech</td><td>30 001 CI</td><td></td></tr><tr><td>L-גלוטמין</td><td>Mediatech</td><td>25 005 CI</td><td></td></tr><tr><td>HEPES מאגר</td><td>Mediatech</td><td>25060CI</td><td></td></tr><tr><td>FcR מגיב חוסם, אנושי</td><td>Miltenyi</td><td>130-059-901</td><td></td></tr><tr><td>RosetteSep Human CD8 + דלדול קוקטייל </td><td>תאי גזע</td><td>15663</td><td></td></tr><tr><td>LIVE / DEAD ערכת כתמי תאים מתים לתיקון, עבור עירור UV</td><td>Invitrogen</td><td>L23105</td><td></td></tr><tr><td>Rneasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>Improm-II מערכת תמלול הפוך</td><td>Promega</td><td>A3800</td><td></td></tr><tr><td>Brilliant II SYBR qPCR Low Rox Master Mix</td><td>Agilent</td><td>600830</td><td></td></tr><tr><td>BD Cytofix/Cytoperm קיבוע/פרמיביליזציה ערכת פתרון</td><td>BD</td><td>554714</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Fisher</td><td>BP337100</td><td></td></tr><tr><td>IFN-&#947; פריימר</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>FOR: CGAGATGACTTCGAAAAGCTGA REV: TCTTCGACCTCGAAACAGCA</td></tr><tr><td>GAPDH פריימר</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>עבור: TCATCATCTCTGCCCCCTCTCT rev: AGTGATGGCATGGACTGTGG</td></tr></tbody></table>

במבחנה assay כדי להעריך את ההשפעה של immunoregulatory מסלולים על פונקצית effector הנייד hiv-ספציפית t מסוג cd4

In Vitro Assay to Evaluate the Impact of Immunoregulatory Pathways on HIV-specific CD4 T Cell Effector Function

תשישות תא T היא גורם מרכזי בסילוק הפתוגן נכשל במהלך זיהומים נגיפיים כרוניים. מסלולי immunoregulatory, כגון PD-1 ו-IL-10, הם שהוגברו בחשיפה אנטיגן המתמשכת הזה ולתרום לירידה של התפשטות, פונקצית cytolytic מופחתת, ולקויי ייצור ציטוקינים על ידי תאי CD4 ו CD8 T. במודל העכברי של זיהום LCMV, מנהלה של חסימת נוגדנים כנגד שני מסלולים אלה בתוספת תגובות תא T. עם זאת, אין כיום assay במבחנה כדי למדוד את ההשפעה של מצור כזה על הפרשת ציטוקינים בתאים מדגימות אנושיות. הפרוטוקול והגישה ניסויית שלנו מאפשרים לנו באופן מדויק ויעיל לכמת את השיקום של ייצור ציטוקינים על ידי תאי T מסוג CD4 HIV-ספציפיים מנבדקים נגועים ב-HIV. כאן, אנו מתארים במבחנה עיצוב ניסיוני המאפשר מדידות של הפרשת ציטוקינים על ידי תאי T מסוג CD4 HIV-ספציפיים ואת השפעתן על cel האחרתת ליטר. תאי CD8 T היו מתרוקנים מכל הדם וPBMCs שנותרה היו מבודדות באמצעות שיטת הפרדת Ficoll. PBMCs המדולדלת CD8 אז הודגרו עם חסימת נוגדנים כנגד PD-L1 ו / או IL-10Rα, ולאחר גירוי עם בריכת פפטיד Gag-HIV-1, תאים הודגרו על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. לאחר 48 שעה, supernatant נאסף לניתוח ציטוקינים על ידי מערכי חרוזים וכדורי תא נאספו גם עבור ניתוח פנוטיפי באמצעות cytometry זרימה או ניתוח תעתיק באמצעות qRT-PCR. לניתוח מפורט יותר, אוכלוסיות תאים שונות התקבלו על ידי דלדול משנה סלקטיבית מPBMCs או על ידי מיון באמצעות cytometry זרימה לפני שהוערך באותה מבחני. שיטות אלה מספקות גישה רגישה וספציפית מאוד על מנת לקבוע את האפנון של ייצור ציטוקינים על ידי תאי T-helper אנטיגן הספציפי ולקבוע יחסי גומלין פונקציונליים בין אוכלוסיות השונות של תאים חיסוניים.

בעת ביצוע מדידות ציטוקינים באמצעות מערכת זו במבחנה, זה הכרחי כדי להיות מסוגל להבחין בין תגובות אנטיגן הספציפי בהשוואה לשום שליטת גירוי. באופן כללי, אנחנו נחשבים לתגובות חיוביות כמו כל ערכים של גירוי אנטיגני שנותנות עלייה לפחות פי שלוש ברמות ציטוקינים בהשוואה לשום שליטת הגירוי ושהיו בתוך הטווח ליניארי של assay. אנחנו משתמשים במבחני רגישות גבוהים מערך חרוז שיכול לזהות ריכוזים של ציטוקינים נמוכים כמו 0.16 pg / ml, מה שמאפשר לנו להתבונן בתגובות אנטיגן הספציפי חלשות T מסוג CD4...

פיתחנו assay במבחנה כדי לחקור את התפקיד של מסלולי immunoregulatory בויסות הפרשת ציטוקינים על ידי תאי T מסוג CD4 HIV-ספציפיים.

במבחנה Assay כדי להעריך את ההשפעה של immunoregulatory מסלולים על פונקצית Effector הנייד HIV-ספציפית T מסוג CD4

T cell exhaustion is a major factor in failed pathogen clearance during chronic viral infections. Immunoregulatory pathways, such as PD-1 and IL-10, are ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא לנתח את הפרשת הציטוקינים, השעתוק וההשפעה המורפולוגית של תאי T מגורים. ראשית, השתמש בשיפוע קריאת FI כדי לבודד את ה-CD ההיקפי שמונה תאים חד-גרעיניים מדוללים בדם מהאנשים הנגועים ב-HIV דוגרים על התאים עם בקרת האיזוטיפ או הנוגדן החוסם המעניין. ואז לעורר את התאים עם האנטיגן המעניין.לאחר מכן, צנטריפוגה את תרביות התאים על מנת לאסוף סופרנטנטים למדידות ציטוקינים וכדורי תאים לניתוח פנוטיפי או ניתוח שעתוק אם רוצים. התאם פרוטוקול זה כך שיכלול מיון סוגי התאים הבודדים לפי זרימה ציטומטרית תוצאות על הפרשת ציטוקינים. ניתוח פנוטיפי או שעתוק יכול להראות את ההשפעה של חסימת נוגדנים של מסלולים מעכבים על שחזור תפקוד האפקטור של תאי CD 4 T ספציפיים ל- HIV.ניתן להשתמש ביעילות בבדיקת מבחנה זו כדי לכמת את רמות הציטוקינים המשוחזרות על ידי חסימת מסלולים מעכבים כדי לחקור פאנל רחב של מולקולות אפקטור וגם כדי להעריך את ההשפעה של ציטוקינים המיוצרים על ידי C ספציפי ל- HIV עבור תאי T על תת-קבוצות תאים אחרות. מייגן הארט, טכנאית מחקר מהמעבדה שלנו, תדגים כעת את ההליך הזה, לרוקן את ה-CD שמונה תאי T חיוביים על ידי הוספת קוקטייל הדלדול החיובי של CD אנושי ב-50 מיקרוליטר למיליליטר של דם מלא להתערבב היטב ולדגור במשך 20 דקות. בטמפרטורת החדר, מערבבים את כל הדם עם המאגר של האנק.כעת שכב בזהירות את הדם על חפיסתו, ואז צנטריפוגה את השיפוע ב-540 RCF למשך 30 דקות. אסוף את שכבת התאים החד-גרעיניים בדם ההיקפי. העבירו את התאים לצינור חרוטי חדש של 50 מיליליטר ושטפו פעמיים עם 45 מיליליטר RPMI 1640 מלא.השעו מחדש את התאים השטופים ב-RPMI 1640 מלא. לאחר מכן יש 500 מיקרוליטר של תרחיף תאים לכל שפופרת פקס. בהתאם למסלול שנחקר, הוסף את הנוגדנים החוסמים.הוסף גם את פקדי האיזוטיפ לצינורות המתאימים. דגרו את התאים למשך 15 דקות בחממת תרבית התאים. לאחר מכן, לעורר את התאים עם מאגר פפטידים של HIV אחד.כלול גם בקרת גירוי ללא גירוי עבור כל מצב חוסם. המשך לתרבית תאים למשך 48 שעות. גלולה את התאים על ידי צנטריפוגה ואז מבלי להפריע לגלולה.העבירו פעמיים 225 מיקרוליטר של סופרנטנט לתוך צינורות EOR עבור מערכי המהירות של לומינקס כדי לנטרל את הנגיף ב-25 מיקרוליטר של 0.5% PBS tween. לאחר מכן יש למדוד את ריכוזי הציטוקינים הרצויים באמצעות ערכת Millipore luminex על פי פרוטוקול היצרן. לאחר שטיפת התאים בשלושה מיליליטר של כתם PBS לצורך כדאיות, השעו מחדש את התאים ב-100 מיקרוליטר של PBS המכילים 1% FBS אם צובעים מונוציטים או תאים אחרים המציגים אנטיגן ב-1.4 מיקרוליטר של מערבולת ריאגנטים חוסמת FCR להתערבב ולדגור במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס.לאחר מכן, הוסיפו את מערבולת הנוגדנים על פני השטח ודגרו במשך 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס בחושך. לאחר שטיפה אחת ב -200 מיקרוליטר של 4% פרה פורמלדהיד ודגירה בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות בחושך. לאחר שטיפה אחת, אנו משעים את התאים ב-250 מיקרוליטר של 1% FBS לניתוח על ציטומטר זרימת לייזר מרובה עבור R-T-P-C-R כמותי את התאים ב-300 מיקרוליטר של מאגר קיוגן, RLT המכיל 1% Beamer keto ethanol RNA מבודד, באמצעות ערכת בידוד RNA בהתאם לפרוטוקול היצרן.כעת מסנתז CD NA מה-RNA באמצעות ערכת סינתזה CD NA ובהתאם לפרוטוקול היצרן. לאחר מכן, צור תערובת פריימר לכל פריימר, כולל הגנים של משק הבית על ידי הוספת פריימרים למים נטולי נוקלאז ושמור על קרח. לכל תערובת מאסטר הגברה, הוסף 10.5 מיקרוליטר מים ללא נוקלאז, 12.5 מיקרוליטר ירוק סייבר ומיקרוליטר אחד של תערובת פריימר לכל צלחת.ובכן, עכשיו פיפטה 24 מיקרוליטר של תערובת מאסטר לכל תגובה. ובכן הוסף גם מיקרוליטר אחד של CD NA לכל אחד, היטב לפי התבנית. מכסים את הבארות וצנטריפוגה את הצלחת למשך שלוש דקות בטמפרטורה של 1500 RCF.לאחר מכן הפעל את הצלחת על מכונת QRT PCR R לצביעה על פני התא. הוסף את כתמי הפלדן והמונין כשש שעות לפני צביעת ציטוקינים תוך תאיים. לאחר מכן שטפו את התאים עם 1% FBS ב-PBS והכתים ציטוקינים תוך-תאיים באמצעות ערכת תמיסת חדירת קיבוע ופרוטוקול לאחר שטיפת התאים.לאחר שאנו משעים את הכדורים ב -250 מיקרוליטר של 1% FBS, הפעל את הדגימות על ציטומטר זרימת לייזר רב לייזר 16 שעות לאחר כתם הגירוי לצורך כדאיות באמצעות ערכת כתמי תאים מתים חיים הניתנת לתיקון. על פי פרוטוקול היצרן, לאחר שטיפת PBS אחת, אנו משעים את התאים ב-100 מיקרוליטר של 1% FBS על פני השטח מערבולת נוגדנים כדי לערבב ולדגור תאים על קרח בחושך למשך 20 דקות. שטפו את התאים פעם אחת והשעו את התאים ב -500 מיקרוליטר של RPMI 1640 משלים קר.לאחר מכן מדיה מסננת את התאים דרך מכסה מסננת תאים לתוך צינור תחתון עגול מפוליסטירן בנפח חמישה מיליליטר. הבא ב-200 מיקרוליטר של מדיה RPMI 1640 משלימה לכל צינור איסוף. שמירה על כל הצינורות על קרח במהלך המיון בשידור חי ממיין את תת-קבוצות התאים המעניינות במכשיר הממוקם במתקן המצויד לתרבית חומרים מסוכנים ביולוגית.התאים הממוינים למשך הזמן הרצוי. בעקבות ניתוח ניתוחי לומינקס ו-PCR בניסוי זה, גירוי PBMC מדולדל CD שמונה עם מאגר פפטידים של HIV V אחד מביא לעלייה חציונית של פי 800 בייצור אינטרפרון גמא. רמת תעתיקי הגמא של אינטרפרון הוגדלה בחציון של פי עשרה לאחר הגירוי.בניתוח זה, ניתוח מבחנה של CD ספציפי ל-HIV ארבע תוצאות תפקוד תאי T מצביעות על מתאם חזק בין הפרשת חלבון גמא אינטרפרון לרמות mRNA של אינטרפרון גמא. מעניין שגירוי על ידי מאגר פפטידי ה-HIV מביא להפרשת אינטרפרון גמא גדולה יותר מאשר האנטיגנים החיידקיים של טטנוס. תוצאות נוספות של טוקסואיד עם הפרשת IL 13 מצביעות על פרופילי הציטוקינים השונים של תגובות תאי CD 4 ספציפיות ל-HIV וטטנוס.לחסימה של מסלול PD One בדרך כלל אין השפעה משמעותית על הפרשת ציטוקינים ללא כל גירוי אנטיגן, אך מגבירה את הפרשת אינטרפרון גמא ו-IL 2. כאשר תאים מגורים עם HIV פפטיד אחד מתאגרף. כאשר תאי CD שלושה מתרוקנים מה-pbmc, אין אינטרפרון גמא או IL 2 המיוצרים בתגובה לגירוי אנטיגן.נתונים אלה מצביעים על כך שהפרשת אינטרפרון גמא ו-IL 2 נגרמת בתגובה לגירוי ספציפי של תאי T CD 4 ואנטיגן ספציפיים ל-HIV. ניסוי זה משתמש בזרימת העבודה המודגמת באמצעות תאי CD ארבעה T ממויינים עובדות כדי לבחון את ההשפעה של חסימת PD אחת על אינטרפרון גמא ו-IL 2. יתרון מרכזי של שיטה זו הוא היכולת להעריך כיצד מולקולות מווסתות את יחסי הגומלין של תאי CD 4 T ספציפיים ל- HIV עם תאים המציגים אנטיגן.כאן הפרוטוקול הותאם לביצוע צביעת ציטוקינים תוך תאית 48 שעות לאחר הגירוי. התוצאות מראות כי מונוציטים הם המקור העיקרי ל-IL 12 לאחר גירוי עם מאגרי פפטידים של HIV אחד. גישה ניסויית חוץ גופית זו מאפשרת לחוקרים בתחום האימונולוגיה של תאי T לחקור את ההשפעה של מסלולים אימונו-רגולטוריים בוויסות התפקוד היעיל של תאי אדיסון ספציפיים בדגימות אנושיות.

in-vitro-assay-to-evaluate-impact-immunoregulatory-pathways-on-hiv

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

Tregs הם מדכאי עוצמה של מערכת החיסון. קיים מחסור של סמנים משטח ייחודי להגדיר אותם, ולכן, הגדרות של Tregs הם פונקציונליים בעיקר. כאן אנו מתארים...

אנושי במבחנה דיכוי ככלי מיון עבור הכרה של מדינת מוקדם של חוסר איזון החיסון

סרטון זה מציג בדיקת אפופטוזיס בתאי סרטן המושרה על ידי תאי T משפיעים שהופעלו מראש. על ידי תרבית משותפת של תאים אלה עם תאים סרטניים המסומנים בגרעינים פלואורסצנטיים, מתווסף מצע פלואורוגני הניתן לשבירה קספאזית. תאי סרטן אפופטוטיים יציגו צבע שונה בגרעין שלהם, מה שיוביל לפלואורסצנטיות כפולה. פלואורסצנטיות כפולה זו מעידה על תאים סרטניים העוברים אפופטוזיס.

בדיקת מבחנה לחקר ציטוטוקסיות של תאי T CD8+ מופעלים מראש נגד תאים סרטניים

CD4+ תאי T רגולטוריים הם מווסתת חיסונית רבת עוצמה וממלאים תפקידים חשובים בהומאוסטזיס של מערכת החיסון. המחסור בתאים אלה בדם היקפי הופך את המחקרים הפונקציונליים למאתגרים, במיוחד בהקשר של זיהום HIV-1. אנו מתארים כאן שיטה לבידוד והרחבה של CD4+ Tregs פונקציונליים מדם היקפי מאנשים נגועים ב-HIV-1.

כלים חדשים כדי להרחיב תאי T רגולטוריים מאנשים HIV-1 נגוע-

דורות רומן של מבחני פונקציונליים, כגון אינטרפרון גמא (IFN-γ) ELISPOT, אשר לזהות ייצור ציטוקינים ברמת התא הבודד ולספק גם אפיון כמוני ואיכותי של תגובות תא T יכולים לשמש כדי להעריך תגובה חיסונית בתיווך תא המכוון נגד אבעבועות רוח זוסטר וירוס (VZV).

פיתוח של חסינות ELISPOT Assay להעריך γ-IFN אבעבועות רוח, זוסטר וירוס ספציפי לתא בתיווך לאחר השתלת דם טבורים

כאן אנו מתארים מבחן כרומטוגרפיה נוזלית-ספקטרומטריית מסה טנדם (HPLC-MS/MS) בעל ביצועים גבוהים לכימות הטקרולימוס המדכא את מערכת החיסון בכתמי דם מיובשים באמצעות שלב ידני פשוט של משקעי חלבון וחילוץ עמודות מקוון.

כימות של Tacrolimus לדיכוי מערכת החיסון בכתמי דם יבש באמצעות LC-MS / MS

פרוטוקול זה מתאר את השיטות לבניית מודל עכבר מח עצם/כבד/תימוס אנושי עם חסינות מהונדסת מבוססת תאי גזע נגד זיהום HIV.

תאי גזע מהונדסים חסינות בהתבסס נגד HIV זיהום במודל העכבר האנושי

כאן, אנו מתארים פרוטוקול לניתוח הפנוטיפ של תאי T רגולטוריים (Treg) שבודדו מעכברים נגועים בנגיף כוריומנינגטיס לימפוציטי נאיבי וכרוני. בנוסף, אנו מספקים תהליך להערכת הפעילות המדכאת של תאי ה-Treg.

פנוטיפי אנליזה פונקציונלית של תאים תקינה T הופעל מבודדת מן עכברים הנגועים בנגיף לימפוציטית כרונית Choriomeningitis

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לגרום סובלנות ב השתלת ולאחר להעריך חוץ גופית בתוך ויוו הקיבולת המדכא של תאים נפרדים קבוצות משנה של המטופל, את מצב המערכת החיסונית של המטופל כלפי התורם או אנטיגנים אקסוגני.

במבחנה In Vivo למזהמים סביבתיים T, B והתאים מיאלואידית פעילות מדכא ומענים ההורמונאלית מן המקבלים

אנו מתארים כאן הזרימה cyvivo try מבוסס בתוך שיטת ההרג המאפשרת לבדוק את החיסונית של האימונוטוקסיט T לימפוציטים (CTL) התגובות של הגידול מודל אנטיגן. אנו מספקים דוגמאות לאופן השימוש בבחינה אלגנטית זו למחקרים מכניסטיים ולבדיקת יעילות בסמים.

תפירה Vivo ציטורעילות Assays ללמוד אימונומימינינס ב-CD8 התגובות הספציפיות לגידול של תאים

אנו מתארים הליך להערכת היכולת של חומרים פרמקולוגיים לייצר תאים דנדריטיים טולרוגניים מתאים דנדריטיים נאיביים שמקורם במונוציטים במבחנה ולאמת את עוצמתם על ידי יצירת תאי T רגולטוריים אוטולוגיים.

שיטה פשוטה ויעילה לבדיקת חומרים אימונומודולטוריים ליצירת תאים דנדריטיים טולרוגניים ממונוציטים CD14+ אנושיים

פרוטוקול זה מספק אסטרטגיית קו-קולטורציה במבחנה לחקר השפעות תאי T רגולטוריים על התרבות והבדייל של תאי T אפקטוריים.

In-Vitro ניתוח פונקציונלי של תאי T רגולטוריים: התמקדות בהתרבות ובהתמיינות

חקור מסלולים אימונורגולטוריים המשפיעים על תאי T CD4 ספציפיים ל-HIV באמצעות בלוקדת נוגדנים. שיטה זו מאפשרת הערכת הפרשת ציטוקינים וניתוח פנוטיפי לחקר תפקוד תאי החיסון.

במבחנה Assay כדי להעריך את ההשפעה של immunoregulatory מסלולים על פונקצית Effector הנייד HIV-ספציפית T מסוג CD4

גלה סרטונים נוספים