Name: פורסים תרבות השיטה למעקב אחר ההתפתחות של חיידקים בשיני explant תרבות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-13T20:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 47 s
Description: למד שיטת תרבית explant לעקוב אחר התפתחות ניצני שיניים בעכברים עובריים באמצעות חיתוך לסלי מנדיבולה חיות. שיטה זו מאפשרת מעקב תאי בזמן אמת ותצפית ישירה בתהליכי ההתתחות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

שרה א Alfaqeeh ממומן על ידי Kind סעוד מכללת אוניברסיטה לרפואת שיניים, משרד להשכלה גבוהה, ממלכת ערב הסעודית.

1. להקים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חידוד המכשירים לנתיחה (באמצעות אבן השחזה משומנת עם שמן מינרלים) ולעקר לפני השימוש לתרבות איבר באמצעות 70% תרסיס אתנול ועיקור יבש חום. לחדד את המחטים לנתיחה באמצעות אלקטרוליזה ב2 M נתרן הידרוקסידי באמצעות הספקה 12V. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את מדיום התרבות המשמש לנתיחה והתרבות של איברים עובריים, בהיקף של F12 של מתקדם השתנה Dulbecco נשר בינוני (F12 DMEM) בתוספת 1% Glutamax ו -1% פניצילין, סטרפטומיצין. </li></ol> 2. Dissection עובר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לברור נקבה בהריון הזדווגו מתוזמן באמצעות שיטת לוח זמנים אחד כפי שאושר על ידי משרד הפנים או גוף מנהל אחר. משם לנתח את העור באזור הבטן התחתון, וחתך את הבטן באמצעות מספריים. אתר את שתי קרנות הרחם, אשר מתחברות יחד על קו האמצע התחתון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את הרחם ואת המקום בצינור מלא בינוני על קרח. When על קרח, הרקמה ניתן להשאיר לכמה שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הרחם ומניחים בצלחת פטרי במדיום מתחת למיקרוסקופ. איפה יש לבצע ניתוחי עובר אפשריים במינרית זרימת מכסה המנוע כדי למזער את הזיהום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את העוברים מהרחם ולשחרר אותם מרקמות extraembryonic. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לערוף את העוברים באמצעות מחט טונגסטן ולהעביר את הראשים לתוך צלחת טרי של מדיום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבודד את הלסתות מראשי על ידי הצבת מחט לתוך חלל הפה ולחתוך לכיוון החלק האחורי של הראש (איורים 1 א ו 1 ב &#39;). לסתות מבודדות יכולות להיות מאוחסנות באופן זמני במדיום על קרח בעת שהמתינו לקיצוץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפרוסות לסת תחתונה כל שלבי E11.5-E15.5 הם אידיאלי עבור תרבות נבט שן. לאחר E15.5 העצם מתפתח בלסת התחתונה הוא קשה מדי לקיצוץ. פרוסות שיניים עדיין יכולות להתבצע אך העצם (עצם מכתשיים dentary ויוצרים) חייב להיות ראשון הוסר על ידינתיחה לפני קיצוץ 9. הסרת עצם בזהירות באמצעות מחטי טונגסטן ומלקחיים. </li></ol> 3. חיתוך עובר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את פרוסות רקמת הלסת התחתונה באמצעות מסוק רקמת שולחן סטנדרטי (איור 1 ג). השתמש בלהב חדש לאחר כ 200 לסתות, ולוודא שהוא נמצא מיושר עם דיסק ההתקנה כאשר הוא נופל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקה את תקליטור ההתקנה ולהב עם אתנול 70% לפני השימוש. יש לנקוט זהירות בעת שימוש במכונה, כפי שהלהב הוא חד מאוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את המסוק במרחק חיתוך של בין 200-400 מיקרומטר בהתאם לגיל של הדגימה, ותלויים אם נדרש כל נבט השן. הגדר את כוח הלהב על מקסימום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את לסת תחתונה לדיסק הרכבת הפלסטיק באמצעות פיפטה או מלקחיים. מסדרים את הלסת התחתונה על הדיסק כדי לוודא את הכיוון הוא עדיין ברור. לשון הפיתוח יכולה לשמש ציון דרך שימושית לקביעת כיוון. לaf שימוש טוחנותrontal / נטייה רוחבית (ראה מטוס של קיצוץ באיור 1 ב &#39;), ואילו לחותכות להשתמש פרוסה sagittal דרך הלסת התחתונה על מנת לשקף את הכיוון של שיניים אלה שונים כאשר הם גדלים (ראו מטוס של קיצוץ באיור 2 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המדיום העודף מרחבי הרקמות באמצעות נייר סינון על מנת לייבש את הלסת התחתונה על דיסק ההרכבה מעט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד לאחר ייבוש, הנח את הדיסק על שולחן הנירוסטה העגול של המסוק. הדלק את המכשיר ולחץ להתחיל. השולחן עובר באופן אוטומטי משמאל לימין ואילו באותו הזמן זרוע ביצוע קיצוץ הלהב עולה וירד במהירות של עד 200 משיכות / דקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כבה את המחשב ברגע שהרקמה כבר פרוסות לחלוטין. ודא זרוע הלהב היא במצב המורם ולהסיר את הדיסק. אל תניח את אצבעות מתחת לזרוע הלהב או להשאיר את המכונה ללא השגחה כאשר קיצוץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את דיסק ההרכבה ולהוסיף t הבינוני באופן מיידיo את הפרוסות על הדיסק על מנת למנוע ייבוש מוגזם. לעקור בזהירות את הרקמה הפרוס מהחלק התחתון של הדיסק באמצעות מחט טונגסטן ולאחר מכן טפטפת לתוך צלחת פטרי קטנה של מדיום (איור 2 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפרד את הפרוסות באמצעות מחט ולאחר מכן בחר את פרוסות רקמה המכילות הרקמות של עניין תחת סטראו (1D דמויות, 1E, ו2B). מניחים פרוסות נבחרות בתרבות מנות טריות עם מדיום. </li></ol> 4. פורסים תרבות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן מנות התרבות מרכזיות היטב איבר מוכנות לתרבות על ידי הוספה כ 2 מיליליטר של מים autoclaved אל הבאר החיצונית על מנת למנוע התייבשות, ועל ידי מיצוב רשת מתכת על פני מרכז הצלחת (3A דמויות ו3B). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את רשתות מתכת על ידי חיתוך רצועות כ 4 סנטימטר x 1.5 סנטימטר מיריעות של רשת הנירוסטה. השתמש ניקוב חורים לעשות חור במרכז ולכופףהצדדים כדי ליצור סוף מעד. הרשת צריכה להתאים שטוחה על פני הבאר המרכזית, שוכבת במקביל לתחתית הצלחת (3A דמויות ו3B). החיטוי הרשתות לעקר לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכי חתיכת קרום (PET) (גודל נקבובית 0.4 מיקרומטר) גדול מספיק כדי לכסות את החור ברשת של terephthalate פוליאתילן השקוף. מניחים את הקרום לחתוך לתוך הצלחת עם הפרוסה שנבחרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הפרוסה על גבי הקרום ולאחר מכן הרם בזהירות את הקרום מבינוני, עם פרוסה שיטחה במרכז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את המסנן על הרשת מעל החור העגול במרכז, ולהוסיף כ 1 מיליליטר של מדיום תרבות היטב, עד לרמה של הממברנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למניפולציות להוסיף חלבונים או מעכבי מולקולה קטנים לבינוניות (לדוגמא 8). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצלם את הפרוסה לשיא של מורפולוגיה ביום 0 של התרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הכלים באווירת humidified של 5% CO <sUB&gt; 2 על 37 מעלות צלזיוס בחממה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצלם את התרבויות במרווחי זמן קבועים בממוצע 7 ימים. לשנות את התרבות בינונית בכל שעה 48-72. לצילום להציג את הפרוסות עם מקור אור מלמטה (איורים 2C-E). </li></ol> 5. איתור שושלת אם נדרש איתור שושלת, ניתן להזריק לתוך נבט שן צבעי lipophilic כגון DiI או Dio לפני שלב 4, התרבות הפרוסה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוך מחטי זכוכית נימים באמצעות חולץ מחט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשבור את קצה המחט באמצעות מלקחיים ומניח את הקצה למטה לתוך תמיסת הצבע. השאר לכמה דקות בזמן שהצבע ממלא את הקצה על ידי פעולת נימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את המחט מלאה לבעל ולצרף דרך צינורות אל aspirator מזרק או פה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם את קצה המחט במדיום תרבות נגיעה באזור של הפרוסה בשל להיות מתויגים. החל לחץ אוויר כדי לתפוס כמות קטנה של צבע מתוך המחטד על גבי הרקמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המחט ולבדוק לתיוג תחת הקרינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתן להעביר פרוסות כותרתו בהצלחה למסננים ותרבותיים כפי שמתואר בשלב 4. </li></ol>

<ol><li>Rothova, M., Peterkova, R., Tucker, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fate+map+of+the+dental+mesenchyme%3A+dynamic+development+of+the+dental+papilla+and+follicle%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Fate map of the dental mesenchyme: dynamic development of the dental papilla and follicle.</a> Developmental biology. 366, 244-254 (2012).</li>
<li>Ferguson, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activin+is+an+essential+early+mesenchymal+signal+in+tooth+development+that+is+required+for+patterning+of+the+murine+dentition%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+development%22%5BJournal%5D)">Activin is an essential early mesenchymal signal in tooth development that is required for patterning of the murine dentition.</a> Genes & development. 12, 2636-2649 (1998).</li>
<li>Trowell, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+culture+of+mature+organs+in+a+synthetic+medium%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+cell+research%22%5BJournal%5D)">The culture of mature organs in a synthetic medium.</a> Experimental cell research. 16, 118-147 (1959).</li>
<li>Matalova, E., Antonarakis, G. S., Sharpe, P. T., Tucker, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+lineage+of+primary+and+secondary+enamel+knots%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+dynamics+%3A+an+official+publication+of+the+American+Association+of+Anatomists%22%5BJournal%5D)">Cell lineage of primary and secondary enamel knots.</a> Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 233, 754-759 (2005).</li>
<li>Mitsiadis, T. A., Tucker, A. S., De Bari, C., Cobourne, M. T., Rice, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+regulatory+relationship+between+Tbx1+and+FGF+signaling+during+tooth+morphogenesis+and+ameloblast+lineage+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">A regulatory relationship between Tbx1 and FGF signaling during tooth morphogenesis and ameloblast lineage determination.</a> Developmental biology. 320, 39-48 (2008).</li>
<li>Diep, L., Matalova, E., Mitsiadis, T. A., Tucker, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+the+tooth+bud+mesenchyme+to+alveolar+bone%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+experimental+zoology.+Part+B%2C+Molecular%22%5BJournal%5D)">Contribution of the tooth bud mesenchyme to alveolar bone.</a> Journal of experimental zoology. Part B, Molecular. 312B, 510-517 (2009).</li>
<li>Rothova, M., Feng, J., Sharpe, P. T., Peterkova, R., Tucker, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+mesoderm+to+the+developing+dental+papilla%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+journal+of+developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Contribution of mesoderm to the developing dental papilla.</a> The International journal of developmental biology. 55, 59-64 (2011).</li>
<li>Buchtova, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initiation+and+patterning+of+the+snake+dentition+are+dependent+on+Sonic+hedgehog+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Initiation and patterning of the snake dentition are dependent on Sonic hedgehog signaling.</a> Developmental biology. 319, 132-145 (2008).</li>
<li>Buchtova, M., Stembirek, J., Glocova, K., Matalova, E., Tucker, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+regression+of+the+dental+lamina+underlies+the+development+of+diphyodont+dentitions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+dental+research%22%5BJournal%5D)">Early regression of the dental lamina underlies the development of diphyodont dentitions.</a> Journal of dental research. 91, 491-498 (2012).</li>
<li>Cho, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+primary+enamel+knot+determines+the+position+of+the+first+buccal+cusp+in+developing+mice+molars%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%3B+research+in+biological+diversity%22%5BJournal%5D)">The primary enamel knot determines the position of the first buccal cusp in developing mice molars.</a> Differentiation; research in biological diversity. 75, 441-451 (2007).</li>
<li>Sakano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+dynamics+in+cervical+loop+epithelium+during+transition+from+crown+to+root%3A+implications+for+Hertwig%27s+epithelial+root+sheath+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+periodontal+research%22%5BJournal%5D)">Cell dynamics in cervical loop epithelium during transition from crown to root: implications for Hertwig's epithelial root sheath formation.</a> Journal of periodontal research. , (2012).</li>
<li>Fisher, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+development+in+vitro+of+the+whole+and+halved+lower+molar+tooth+germ+of+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+oral+biology%22%5BJournal%5D)">Morphological development in vitro of the whole and halved lower molar tooth germ of the mouse.</a> Archives of oral biology. 16, 1481-1496 (1971).</li>
<li>Coin, R., Schmitt, R., Lesot, H., Vonesch, J. L., Ruch, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+halved+embryonic+lower+first+mouse+molars%3A+correlation+with+the+distribution+pattern+of+non+dividing+IDE+cells%2C+the+putative+organizers+of+morphogenetic+units%2C+the+cusps%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+journal+of+developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Regeneration of halved embryonic lower first mouse molars: correlation with the distribution pattern of non dividing IDE cells, the putative organizers of morphogenetic units, the cusps.</a> The International journal of developmental biology. 44, 289-295 (2000).</li>
<li>Kavanagh, K. D., Evans, A. R., Jernvall, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predicting+evolutionary+patterns+of+mammalian+teeth+from+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Predicting evolutionary patterns of mammalian teeth from development.</a> Nature. 449, 427-432 (2007).</li>
<li>Munne, P. M., Tummers, M., Jarvinen, E., Thesleff, I., Jernvall, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tinkering+with+the+inductive+mesenchyme%3A+Sostdc1+uncovers+the+role+of+dental+mesenchyme+in+limiting+tooth+induction%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Tinkering with the inductive mesenchyme: Sostdc1 uncovers the role of dental mesenchyme in limiting tooth induction.</a> Development. 136, 393-402 (2009).</li>
</ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

שיטה זו של תרבות שן יש את היתרון שהגישה לניבט השן הוא מצוין, המאפשר ייחוס מדויק באיתור מיקום של חרוזים בתוך האפיתל או mesenchyme. באזורים מוגדרים של נבט השן המתפתח יכולים להיות ממוקדים ולכן באופן ספציפי. במהלך תרבות המורפולוגיה המשתנות של נבט השן יכולה להיות אחריו, ואת ההשפעה של מניפולציות העריכה במהירות. השיטה, לעומת זאת, מתאימה רק לחיידקי שן צעירים לפני היווצרות משמעותית של רקמות קשות, כגון הדנטין ואמייל, שכן א...

עבור מספר הניסויים חשוב להיות מסוגלים רקמות תרבות vivo לשעבר לעקוב אחר התפתחות. תרבות של פיתוח רקמה מספקת גישה בתקופות מוגדרות של פיתוח ומאפשרת מניפולציה של גנים על ידי התוספת של גורמים למדיום התרבות, או בחרוזים טעונים, ועל ידי השימוש בtransfection electroporation ו1. בניסויים רבים, חשוב להיות מסוגל לדמיין את הרקמה ככל שהוא גדל, לדוגמא, כדי לעקוב אחר גורלם של תאי שושלת מתויגת כרקמה עוברת המורפוגנזה. זה יכול להיות בעייתי במיוחד לרקמות המתפתחות עמוק בתוך העובר, שאינן ברורים כאשר בלוק של רקמות מן העובר הוא תרבותי. שיניים הן דוגמאות טובות לכך, כפי שהם מפתחים בתוך תהליך האף הלסת התחתונה, הלסת העליונה וקדמי. כאשר כל הלסת התחתונה היא בתרבית ניתן לראות המבנים השטחיים של השן אך ניתן לנתח שינויים במורפולוגיה רק ​​לאחר חתך של רקמה קבועה <sעד&gt; 2. יש לנו להתאים טכניקת תרבות פרוסה חיות ומאפשרת לנו לעקוב אחר התפתחות חיידקים בשיניים ובמתן גישה לחלקים השונים של השן במהלך פיתוח. תרבויות טכניקת פרוסות נבט שן בממשק גז הנוזלי, באמצעות שיטת Trowell שונה 3. תרבויות הפרוסה אלה היו מאוד שימושיות באופן ישיר הבא המורפוגנזה של השן, ומאפשר איתור שושלת של רכיבים שונים, כגון קשר האמייל ואת הגבשושיות וזקיק 1,4-7 שיניים. הטכניקה אינה מוגבלת לעוברי עכברים והצלחה כבר בשימוש לפרוסות תרבות חיות של חזיר ו8,9 רקמות שיניים נחש. בנוסף ליתרון של להיות מסוגל לדמיין התפתחות שן, שיטת פרוסה גם יש את היתרון שהפרוסות הדקיקות של רקמה הגדילו את הגישה לחומרים מזינים מבינונית ואוויר מהחממה. התוצאה היא צמיחה משופרת של חיידקי השן, אשר תואם את פיתוח in vivo, וinvas המופעיון של תאי האנדותל לפטמית 7. לעומת זאת, חיידקי שן בתרבויות לסת תחתונה כולו לפתח איטיים יותר מאלה in vivo ומרכז התרבות הוא לעתים קרובות נמקים בתרבויות לטווח ארוך. בתרבות הפרוסה, השן מתפתחת בתוך פרוסה של הלסת, והאינטראקציה שלה עם העצם מתפתח סביב ורקמות אחרות יכולה להיות במעקב. בשיטה שלנו הרקמה קצוצה ישר אחרי נתיחה ללא צורך להטביע במדיום תמיכת 10,11 ואין צורך בכל מערכת לצרף את הרקמה לקרש החיתוך. השיטה היא לכן לא פולשנית ומהירה, המאפשרת ללסתות רבות להיות מחולקים בפגישה אחת.

<table><tbody><tr><td>אתנול</td><td>VWR</td><td>101077Y</td><td>100% אתנול דולל ב-H2O מזוקק ל-70%.</td></tr><tr><td>DMEM F12</td><td>Gibco</td><td>12634-010</td><td>Advanced Dulbecco's Modified Eagle Medium F12</td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין</td><td>Sigma</td><td>P0781</td><td></td></tr><tr><td>DiI (בדיקות מולקולריות)</td> <td>Vybrant</td><td>V-22885</td><td>פתרון</td></tr><tr><td></td> תיוג תאים <td>Invitrogen</td><td></td><td>Cell Tracker CM-DiI, C-7000</td></tr><tr><td>DiO ( בדיקות מולקולריות)</td><td>Vybrant</td><td>V22886</td><td></td></tr><tr><td>Geminator 500</td><td>תומאס</td><td>תומאס מס' 3885A20</td><td>עיקור בחום יבש</td></tr><tr><td>מסוק רקמות McIlwain</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>10180</td> צלחת תרבית איברים <td>בטבלה סטנדרטית</td></tr><tr><td>(צלחת תרבית איברים במרכז באר)</td><td>ממברנות 353037</td><td></td><td></td>פלקון</tr><tr><td>(מוסיף תרבית תאים, 0.4 &mu; גודל נקבוביות מ')</td> <td>BD Falcon</td><td>353090</td><td>PET קרום חרוט מסלול, פורמט 6 בארות</td></tr><tr><td>רשתות מתכת (נירוסטה - AISI 304 - רשת)</td> <td>Goodfellow</td><td>FE228710</td> <td>(Fe / Cr18 / Ni10)</td></tr> <tr><td>AutoFlow Direct Heat CO2 חממה</td><td>Nuaire</td><td>NU-5500</td><td></td></tr><tr><td>Picospritzer III</td><td>Intracel Ltd</td><td>051-0500-900 0-100 psi</td><td>חד ערוץ פיקוספריצר III</td></tr><tr><td>נימי זכוכית עם נימה 1 מ"מ</td><td>WPI</td><td>TW100F-4</td><td></td></tr><tr><td>חוט טונגסטן 0.1 מ"מ</td> חוט <td></td> טונגסטן <td>Goodfellow</td> W005138 <td></td></tr><tr><td>0.38 מ"מ</td> צינורות שואב <td>W005155</td><td></td><td>Goodfellow</td></tr><tr><td></td><td>Sigma</td><td>A5177</td><td>משמש לעוקבי שושלת שאיבת פה</td></tr></tbody></table>

פורסים תרבות השיטה למעקב אחר ההתפתחות של חיידקים בשיני explant תרבות

The Slice Culture Method for Following Development of Tooth Germs In Explant Culture

תרבות explant מאפשרת מניפולציה של פיתוח איברים בנקודות זמן ספציפי ולכן שיטה חשובה לביולוג התפתחותי. לאיברים רבים שקשה לגשת לפיתוח רקמות על מנת לאפשר ניטור בזמן vivo התרבות לשעבר. שיטת התרבות הפרוסה מאפשרת גישה לרקמה, כך שיכולות להיות אחרי תנועות morphogenetic ואוכלוסיות תאים ספציפיות יכולות להיות ממוקדות עבור מניפולציה או התחקות שושלת. במאמר זה אנו מתארים שיטה של ​​התרבות הפרוסה שהייתה מוצלח מאוד לתרבות של חיידקי שן במגוון מינים. השיטה מספקת גישה מצוינת לחיידקי השן, אשר לפתח בקצב דומה לזה שנצפה בvivo, מוקף ברקמות לסת האחרות. זה מאפשר אינטראקציות רקמות בין השן והרקמה שמסביב כדי להיות במעקב. למרות שמאמר זה מתמקד בחיידקי שן, באותו הפרוטוקול ניתן ליישם כדי לעקוב אחר התפתחותם של מספרשל איברים אחרים, כגון בלוטות רוק, סחוס של מקל, בלוטות באף, בלשון, ובאוזן.

על מנת לעקוב אחר התנועה של זקיק השיניים טוחנת הראשון, נלקחו 250 מיקרומטר פרוסות קדמיות דרך לסת תחתונה בשיטה שתוארה לעיל. זקיק השיניים הוא השכבה של mesenchyme שמקיף את האפיתל האמייל החיצוני (OEE) של השן המתפתחת, ובעבר הוכח לקחת חלק בהיווצרות של רקמה של periodontium 6. לסתות נותחו בE14.5, שלב הכובע של התפתחות שן. בפרוסה את קווי המתאר של אפיתל השיניים היו ברור, וmesenchyme השיניים העיבוי יכול להיות מזוהה כטבעת כהה מסביב (איור 4 א) אפיתל השן. DiI הוזרק בmes...

כאן אנו פירוט שיטה לחיידקים שן תרבות בפרוסות לסת תחתונה באמצעות מסוק רקמות. שיטה זו מאפשרת גישה ייחודית לשן במהלך פיתוח, מתן הזדמנות מצוינת למניפולציה ושושלת מעקב, אינו זמין בשיטות תרבות מסורתיות יותר.

Explant culture allows manipulation of developing organs at specific time points&#160;and is therefore an important method for the developmental ...

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לעקוב אחר התפתחות השיניים במשך מספר ימים. בתרבית אקספלורציה במבחנה, זה מושג על ידי ניתוח הלסת התחתונה המתפתחת של עכברים עובריים לפרוסות חיות כדי לחשוף את חיידקי השיניים המתפתחים כשלב שני. הפרוסות נבחרות, מונחות על פילטרים מעל מדיום תרבית ומודגרות כדי לאפשר התפתחות.הפרוסות הבאות מסומנות עם עוקב שושלת על מנת לעקוב אחר תנועת התאים במהלך תקופת התרבית, מתקבלות תוצאות המראות את האופי הדינמי של רקמות השיניים בזמן שהן מתפתחות במהלך תרבית אקספלן. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני תרבית אקספלנט קונבנציונלית הוא שניתן לצפות באיברים המתפתחים פנימית כמו אבני חן שיניים לאורך כל התפתחותם בהקשר של הרקמה שמסביב. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית מכיוון ששלבי הקיצוץ והבחירה יכולים להיות קשים אם הגדרת המכונה או כיוון הרקמה אינם מדויקים.ראשית, הכינו את מדיום הדיסקציה והתרבית לאיברים העובריים על ידי הוספת 1% גלוטמט ו-1% פטרפטומיצין פניצילין ל-500 מיליליטר של מדיום נשר מתקדם שהשתנה ב-ECCO F 12. לאחר מכן, כפי שמתואר במאמר הווידיאו של טקהאשי, סומי מנתח עוברי עכברים בין שלבי ההתפתחות E 11.5 ו-E 15.5 ומניח אותם בצלחת פטרי המכילה מדיום טרי. לאחר מכן, ערפו את ראשי העוברים באמצעות מחט טונגסטן סטרילית מושחזת והעבירו את הראשים לכלי טרי של מדיום מקורר מראש על קרח.לאחר מכן בודד את הלסת התחתונה מהראשים על ידי הכנסת מחט לחלל הפה וחיתוך לכיוון החלק האחורי של הראש באופן זמני. אחסן את הלסתות התחתונות המבודדות במדיום מקורר מראש על קרח לפני החיתוך. לפני חיתוך רקמת הלסת התחתונה, נקה את דיסק ההרכבה והלהב של קוצץ הרקמות עם 70% אתנול, וודא שהלהב מונח בסמוך לדיסק ההרכבה.כאשר הוא נופל, יהיה צורך להחליף את הלהב לאחר חיתוך של כ-200 לסתות תחתונות, להגדיר את מרחק החיתוך בין 200 ל-400 מיקרומטר בהתאם לגיל הדגימה, ובהתאם לשאלה האם כל נבט השן נדרש לעובר E 14.5 בו נדרש בידוד של נבט השן, נעשה שימוש במרחק חיתוך של 250 מיקרומטר. לאחר מכן, העבירו לסת תחתונה לדיסק ההרכבה מפלסטיק וסדרו אותה כך שהלשון המתפתחת תהיה בכיוון רוחבי קדמי. כאשר מנתחים טוחנות לבידוד חותכות, קח פרוסות סגיטליות דרך הלסת התחתונה.לאחר הכוונה נכונה, הסר את המדיום העודף מסביב לרקמה. בעזרת נייר פילטר, זה יניע מעט לסת תחתונה שתקבע אותה למקומה על דיסק ההרכבה. מיד לאחר הייבוש עם נייר המסנן, הנח את הדיסק על שולחן הנירוסטה העגול של המסוק.לאחר מכן הגדר את כוח הלהב על מקסימום, הפעל את המכונה ולחץ על התחל. השולחן עובר אוטומטית משמאל לימין ובמקביל זרוע החיתוך הנושאת את הלהב מורמת ויורדת במהירות של עד 200 פעימות לדקה. לאחר שהרקמה נחתכה לחלוטין, כבה את המכונה.ודא שזרוע הלהב נמצאת במצב מורם ולאחר מכן הסר את הדיסק. הקפד לא להניח אצבעות מתחת לזרוע הלהב או להשאיר את המכונה ללא השגחה. בעת קיצוץ רקמות, קח את דיסק ההרכבה והוסף מיד מדיום לפרוסות על הדיסק על מנת למנוע ייבוש יתר.לאחר מכן עקרו בזהירות את רקמת הפרוסה מתחתית הדיסק באמצעות מחט טונגסטן או פיפטה ופיפטה אותם לצלחת פטרי קטנה של בינוני. לאחר מכן, הפרד את הפרוסות הבודדות באמצעות מחט ולאחר מכן בחר את פרוסות הרקמה המכילות את אזור העניין תחת מיקרוסקופ סטריאו. מניחים פרוסות נבחרות בכלי תרבות עם טריים ובינוניים, מכינים רשתות מתכת למערכת התרבות על ידי חיתוך רצועות, בגודל ארבעה סנטימטרים על 1.5 סנטימטרים מיריעות אריגה רגילה מנירוסטה.לאחר מכן נקב חור במרכז בעזרת אגרוף חור נייח רגיל וכופף את הצדדים כך שהרשת תתאים שטוחה על פני הבאר המרכזית ותשכב במקביל לתחתית המנה. לאחר שהרשתות מעוצבות כהלכה, יש לעקר אותן בחיטוי לפני השימוש. לאחר מכן, הכינו את כלי תרבית האיברים המרכזיים של הבאר לתרבית על ידי הוספת שני מיליליטר מי חיטוי לבאר החיצונית כדי למנוע התייבשות.לאחר מכן מקמו רשת מתכת סטרילית במרכז הכלי. חותכים חתיכת קרום פוליאתילן טרפתלט שקוף בגודל נקבוביות של 0.4 מיקרומטר כך שיהיה גדול מספיק כדי לכסות את החור ברשת. לאחר מכן מניחים את הממברנה החתוכה לתוך הכלי עם פרוסת לסת תחתונה שנבחרה אם רוצים מעקב אחר שושלת.ראשית הכינו מחט נימית מזכוכית על ידי ציור הזכוכית בעזרת מושך מחט. לאחר מכן שוברים את קצה המחט ומניחים אותו כלפי מטה לתמיסת צבע ליפופילית כגון dai eye או dai o, ומציירים חלק מתמיסת הצבע על ידי פעולה נימית. לאחר מספר דקות, הכניסו את המחט המלאה למחזיק והצמידו אותה לשואב פה.מקם את קצה המחט במדיום התרבית כך שהוא ייגע באזור שיש לסמן, כגון זקיק השיניים המוצג כאן. לאחר מכן העבירו כמות קטנה של צבע על הרקמה. לאחר מכן, העבירו את הפרוסה לשלב מיקרוסקופ פלואורסצנטי ובדקו שהפרוסה מסומנת בהצלחה.לאחר שסומן בהצלחה, הרם בזהירות את הפרוסה על גבי הממברנה ולאחר מכן העביר את הממברנה מהמדיום כשהפרוסה שטוחה במרכז. לאחר מכן הניחו את המסנן מעל החור העגול במרכז הרשת בערך מיליליטר אחד של מדיום תרבית לבאר עד שרמת המדיום תהיה בגובה הממברנה. בשלב זה, הוסף חלבונים או מעכבי מולקולות קטנות למדיום.כמו כן, דמיין את הפרוסה לתיעוד המורפולוגיה ביום האפס באמצעות מיקרוסקופ מנתח לצילום הטוב ביותר, צפה בפרוסות עם מקור אור מלמטה. שמרו על הכלים באווירה לחה של 5% פחמן דו חמצני ב-37 מעלות צלזיוס, והחליפו את המדיה כל יומיים-שלושה במרווחי זמן קבועים. המשיכו לדמיין את התרבויות כדי לעקוב אחר ההתקדמות.מוצגת כאן סדרה של תמונות המתעדות את התפתחות זקיק השיניים הטוחנת הראשון, המסומן בכתם פלואורסצנטי של עין צבע. הפרוסה היא פרוסה קדמית בעובי 250 מיקרון שנותחה מהלסת התחתונה של עכבר ב-E 14.5. השן, המתוארת בנקודות שחורות, מתחילה בשלב הכובע ביום האפס.ביום הרביעי, נבט השן הגיע לשלב הפעמון ותאי זקיקי השיניים נראים מתפשטים בקשת סביב האמייל החיצוני המתפתח. אפיתל לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שלוש שעות מהעובר ועד לתרבית הסופית. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לדמיין בהצלחה את התפתחות האיברים בתרבות.

the-slice-culture-method-for-following-development-tooth-germs

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

פורסים תרבות Organotypic של E18 מוח החולדה

תרביות צמחי רקמה ראשוניים אורגנוטיפיים, הכוללות פרוסות חתוכות במדויק, מייצגות את ארכיטקטורת הרקמה התלת-ממדית (תלת-ממדית), כמו גם את האינטראקציות הרב-תאיות של רקמה טבעית. סרטון זה מתאר גידול של פרוסות רקמה שמקורן בגידול ריאות באמצעות יחידת דגירה מסתובבת, מערכת המאפשרת חשיפה לסירוגין של רקמות לחמצן ולחומרים מזינים. הפרוטוקול מתאר את המתודולוגיה ליצירת ותרבית חיתוך מדויק של פרוסות גידולי ריאה לצורך מחקרי תגובה תרופתית.

תרבית צמחי רקמת גידול ריאה: הליך ליצירה ותרבית של פרוסות גידול ריאה חתוכות במדויק

הסרטון מדגים יצירה ותחזוקה של תרביות פרוסות אורגנוטיפיות מרקמת גליובלסטומה. הרקמה המבודדת משובצת במטריצה אגרוזית, וחלקים דקים מתקבלים באמצעות ויברטום. חלקים אלה מונחים לאחר מכן על תוספות קרום חדירות בתוך צלחת מיקרו ומתורבת במצע תחזוקת תרבית פרוסה לתחזוקה לטווח ארוך.

יצירה ותחזוקה של תרביות פרוסות מרקמת גליובלסטומה אנושית

סרטון זה מדגים את השימוש במכשיר מיקרופלואידי כדי לחקור את האינטראקציות בין מוך נבט השן לבין גרעינים טריגמינליים. הוא מציג את מיקום הרקמות בתוך המכשיר המיקרופלואידי ומספק הדמיה מפורטת של צמיחת עצבים טריגמינליים לכיוון נבט השן דרך המיקרו-חריצים של המכשיר. בנוסף, הוא מדגיש את תפקידם של גורמים מולקולריים שמקורם בשיניים בקידום או עיכוב הרחבת נוירויט למוך נבט השן, שהוא חיוני להבטחת עצבוב שיניים יעיל לאחר הלידה.

ניתוח אינטראקציות בין נבט שיניים וגרעינים טריגמינליים באמצעות מערכת תרבית משותפת מיקרופלואידית

תרביות משותפות מייצגות שיטה רבת ערך לחקר האינטראקציות בין עצבים לרקמות ואיברי מטרה. מערכות מיקרופלואידיות מאפשרות תרבית משותפת של גנגליונים ואיברים או רקמות מתפתחים שלמים במצעי תרבית שונים, ובכך מייצגות כלי רב ערך למחקר במבחנה של הדיבור בין נוירונים למטרותיהם.

ניתוח של פיתוח שיניים נבט עצבוב שימוש בהתקני Microfluidic משותף התרבות

מודלים vivo לשעבר של גליובלסטומה (GBM) אינם מותאמים למחקר רלוונטי מבחינה פיזיולוגית של הפלישה של הגידול האנושי. כאן, אנו מציגים פרוטוקול לייצור ותחזוקה של תרבויות פרוסה organotypic מרקמת GBM אדם טרי. תיאור של זמן לשגות מיקרוסקופיה ו כמותי תא הגירה טכניקות ניתוח מסופק.

A Glioblastoma האדם דגם תרבות פרוסה Organotypic לחקר גידול תאים סרטניים ואפקטים ספציפיים לחולה של תרופות אנטי פולשניות

אנו מספקים שיטה הדור, ניתוח שיטתי של פרוסות organotypic נגזר גידולים ריאות מאתר וטיפוח. אנו מתארים גם מיטוב עבור עובי הפרוסה, וכיצד לבחור ריכוזי התרופה לטיפול הגידול פרוסות.

הקמת וניתוח של הגידול פרוסה Explants כתנאי בדיקות אבחון

פרוטוקול להכין תרביות פרוסות חופשיות מן המוח האנושי המבוגר מוצג. הפרוטוקול הוא וריאציה של שיטת תרבות הפרוסה הנפוצה בשימוש באמצעות מוסיף ממברנה. זה פשוט, חסכוני, ומומלץ להפעלת בחני לטווח קצר שמטרתו לפענח מנגנונים של נוירוניוון מאחורי הגיל הקשורים מחלות המוח.

לטווח קצר-מתרבות פרוסה שצפה בחינם מהמוח האנושי המבוגר

שיטת תרבית האיברים מסוג טרוול שימשה לפענוח רשתות איתות מורכבות השולטות בהתפתחות השיניים, ולאחרונה לחקר הוויסות המעורב בתאי גזע של חותך העכבר הגדל ללא הרף. מודלים של בעלי חיים מדווחים פלואורסצנטיים ושיטות הדמיה חיה מאפשרים ניתוח מעמיק של תאי גזע דנטליים ושל המיקרו-סביבה הנישה הספציפית שלהם.

שימוש בתרבית איברים מסוג טרוול לחקר ויסות תאי גזע דנטליים

הדמיה חיה Ex vivo היא טכניקה רבת עוצמה לחקר התהליכים הדינמיים של תנועות תאים ואינטראקציות ברקמות חיות. כאן, אנו מציגים פרוטוקול המיישם מיקרוסקופ של שני פוטונים למעקב חי אחר תאי אפיתל דנטליים בחותכות עכבר בוגרות שלמות בתרבית.

שימוש בהדמיה חיה של Ex Vivo כדי לחקור חלוקות תאים ותנועות במהלך חידוש שיניים של עכבר

למד שיטת תרבית explant לעקוב אחר התפתחות ניצני שיניים בעכברים עובריים באמצעות חיתוך לסלי מנדיבולה חיות. שיטה זו מאפשרת מעקב תאי בזמן אמת ותצפית ישירה בתהליכי ההתתחות.

פורסים תרבות השיטה למעקב אחר ההתפתחות של חיידקים בשיני explant תרבות

גלה סרטונים נוספים