פורסים תרבות השיטה למעקב אחר ההתפתחות של חיידקים בשיני explant תרבות

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לעקוב אחר התפתחות השיניים במשך מספר ימים. בתרבית אקספלורציה במבחנה, זה מושג על ידי ניתוח הלסת התחתונה המתפתחת של עכברים עובריים לפרוסות חיות כדי לחשוף את חיידקי השיניים המתפתחים כשלב שני. הפרוסות נבחרות, מונחות על פילטרים מעל מדיום תרבית ומודגרות כדי לאפשר התפתחות.

הפרוסות הבאות מסומנות עם עוקב שושלת על מנת לעקוב אחר תנועת התאים במהלך תקופת התרבית, מתקבלות תוצאות המראות את האופי הדינמי של רקמות השיניים בזמן שהן מתפתחות במהלך תרבית אקספלן. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני תרבית אקספלנט קונבנציונלית הוא שניתן לצפות באיברים המתפתחים פנימית כמו אבני חן שיניים לאורך כל התפתחותם בהקשר של הרקמה שמסביב. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית מכיוון ששלבי הקיצוץ והבחירה יכולים להיות קשים אם הגדרת המכונה או כיוון הרקמה אינם מדויקים.

ראשית, הכינו את מדיום הדיסקציה והתרבית לאיברים העובריים על ידי הוספת 1% גלוטמט ו-1% פטרפטומיצין פניצילין ל-500 מיליליטר של מדיום נשר מתקדם שהשתנה ב-ECCO F 12. לאחר מכן, כפי שמתואר במאמר הווידיאו של טקהאשי, סומי מנתח עוברי עכברים בין שלבי ההתפתחות E 11.5 ו-E 15.5 ומניח אותם בצלחת פטרי המכילה מדיום טרי. לאחר מכן, ערפו את ראשי העוברים באמצעות מחט טונגסטן סטרילית מושחזת והעבירו את הראשים לכלי טרי של מדיום מקורר מראש על קרח.

לאחר מכן בודד את הלסת התחתונה מהראשים על ידי הכנסת מחט לחלל הפה וחיתוך לכיוון החלק האחורי של הראש באופן זמני. אחסן את הלסתות התחתונות המבודדות במדיום מקורר מראש על קרח לפני החיתוך. לפני חיתוך רקמת הלסת התחתונה, נקה את דיסק ההרכבה והלהב של קוצץ הרקמות עם 70% אתנול, וודא שהלהב מונח בסמוך לדיסק ההרכבה.

כאשר הוא נופל, יהיה צורך להחליף את הלהב לאחר חיתוך של כ-200 לסתות תחתונות, להגדיר את מרחק החיתוך בין 200 ל-400 מיקרומטר בהתאם לגיל הדגימה, ובהתאם לשאלה האם כל נבט השן נדרש לעובר E 14.5 בו נדרש בידוד של נבט השן, נעשה שימוש במרחק חיתוך של 250 מיקרומטר. לאחר מכן, העבירו לסת תחתונה לדיסק ההרכבה מפלסטיק וסדרו אותה כך שהלשון המתפתחת תהיה בכיוון רוחבי קדמי. כאשר מנתחים טוחנות לבידוד חותכות, קח פרוסות סגיטליות דרך הלסת התחתונה.

לאחר הכוונה נכונה, הסר את המדיום העודף מסביב לרקמה. בעזרת נייר פילטר, זה יניע מעט לסת תחתונה שתקבע אותה למקומה על דיסק ההרכבה. מיד לאחר הייבוש עם נייר המסנן, הנח את הדיסק על שולחן הנירוסטה העגול של המסוק.

לאחר מכן הגדר את כוח הלהב על מקסימום, הפעל את המכונה ולחץ על התחל. השולחן עובר אוטומטית משמאל לימין ובמקביל זרוע החיתוך הנושאת את הלהב מורמת ויורדת במהירות של עד 200 פעימות לדקה. לאחר שהרקמה נחתכה לחלוטין, כבה את המכונה.

ודא שזרוע הלהב נמצאת במצב מורם ולאחר מכן הסר את הדיסק. הקפד לא להניח אצבעות מתחת לזרוע הלהב או להשאיר את המכונה ללא השגחה. בעת קיצוץ רקמות, קח את דיסק ההרכבה והוסף מיד מדיום לפרוסות על הדיסק על מנת למנוע ייבוש יתר.

לאחר מכן עקרו בזהירות את רקמת הפרוסה מתחתית הדיסק באמצעות מחט טונגסטן או פיפטה ופיפטה אותם לצלחת פטרי קטנה של בינוני. לאחר מכן, הפרד את הפרוסות הבודדות באמצעות מחט ולאחר מכן בחר את פרוסות הרקמה המכילות את אזור העניין תחת מיקרוסקופ סטריאו. מניחים פרוסות נבחרות בכלי תרבות עם טריים ובינוניים, מכינים רשתות מתכת למערכת התרבות על ידי חיתוך רצועות, בגודל ארבעה סנטימטרים על 1.5 סנטימטרים מיריעות אריגה רגילה מנירוסטה.

לאחר מכן נקב חור במרכז בעזרת אגרוף חור נייח רגיל וכופף את הצדדים כך שהרשת תתאים שטוחה על פני הבאר המרכזית ותשכב במקביל לתחתית המנה. לאחר שהרשתות מעוצבות כהלכה, יש לעקר אותן בחיטוי לפני השימוש. לאחר מכן, הכינו את כלי תרבית האיברים המרכזיים של הבאר לתרבית על ידי הוספת שני מיליליטר מי חיטוי לבאר החיצונית כדי למנוע התייבשות.

לאחר מכן מקמו רשת מתכת סטרילית במרכז הכלי. חותכים חתיכת קרום פוליאתילן טרפתלט שקוף בגודל נקבוביות של 0.4 מיקרומטר כך שיהיה גדול מספיק כדי לכסות את החור ברשת. לאחר מכן מניחים את הממברנה החתוכה לתוך הכלי עם פרוסת לסת תחתונה שנבחרה אם רוצים מעקב אחר שושלת.

ראשית הכינו מחט נימית מזכוכית על ידי ציור הזכוכית בעזרת מושך מחט. לאחר מכן שוברים את קצה המחט ומניחים אותו כלפי מטה לתמיסת צבע ליפופילית כגון dai eye או dai o, ומציירים חלק מתמיסת הצבע על ידי פעולה נימית. לאחר מספר דקות, הכניסו את המחט המלאה למחזיק והצמידו אותה לשואב פה.

מקם את קצה המחט במדיום התרבית כך שהוא ייגע באזור שיש לסמן, כגון זקיק השיניים המוצג כאן. לאחר מכן העבירו כמות קטנה של צבע על הרקמה. לאחר מכן, העבירו את הפרוסה לשלב מיקרוסקופ פלואורסצנטי ובדקו שהפרוסה מסומנת בהצלחה.

לאחר שסומן בהצלחה, הרם בזהירות את הפרוסה על גבי הממברנה ולאחר מכן העביר את הממברנה מהמדיום כשהפרוסה שטוחה במרכז. לאחר מכן הניחו את המסנן מעל החור העגול במרכז הרשת בערך מיליליטר אחד של מדיום תרבית לבאר עד שרמת המדיום תהיה בגובה הממברנה. בשלב זה, הוסף חלבונים או מעכבי מולקולות קטנות למדיום.

כמו כן, דמיין את הפרוסה לתיעוד המורפולוגיה ביום האפס באמצעות מיקרוסקופ מנתח לצילום הטוב ביותר, צפה בפרוסות עם מקור אור מלמטה. שמרו על הכלים באווירה לחה של 5% פחמן דו חמצני ב-37 מעלות צלזיוס, והחליפו את המדיה כל יומיים-שלושה במרווחי זמן קבועים. המשיכו לדמיין את התרבויות כדי לעקוב אחר ההתקדמות.

מוצגת כאן סדרה של תמונות המתעדות את התפתחות זקיק השיניים הטוחנת הראשון, המסומן בכתם פלואורסצנטי של עין צבע. הפרוסה היא פרוסה קדמית בעובי 250 מיקרון שנותחה מהלסת התחתונה של עכבר ב-E 14.5. השן, המתוארת בנקודות שחורות, מתחילה בשלב הכובע ביום האפס.

ביום הרביעי, נבט השן הגיע לשלב הפעמון ותאי זקיקי השיניים נראים מתפשטים בקשת סביב האמייל החיצוני המתפתח. אפיתל לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שלוש שעות מהעובר ועד לתרבית הסופית. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לדמיין בהצלחה את התפתחות האיברים בתרבות.