בדיקת רגישות אנטיביוטית הנגרמת על ידי מתח על שבב

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לקבוע במהירות את הרגישות של חיידקים לאנטיביוטיקה המעניינת. זה מושג על ידי קיבוע חיידקי שלב העץ לתחתית תעלה מיקרופלואידית. בשלב השני, חומר המכיל את האנטיביוטיקה וכתם פלואורסצנטי מת חי נדחף דרך התעלה בקצב זרימה גבוה, מלחיץ את החיידקים ומפעיל את המסלולים הביוכימיים הממוקדים של האנטיביוטיקה שלהם.

תמונות ניגודיות ופלואורסצנטיות בשלב הבא נאספות אוטומטית כל שתי דקות למשך שעה כדי לנטר את כדאיות החיידקים, אחוזי תמותה חיידקים מנורמלים מחושבים מהתמונות שנרכשו בכל נקודת זמן של הניסוי. בסופו של דבר, פנוטיפ הרגישות לאנטיביוטיקה של החיידק נקבע מעלייה באחוז תמותת התאים המנורמל לאורך זמן. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות בדיקת רגישות פנוטיפיות קיימות כגון מרק, דילול או מיקרו-תרבית, הוא שהשיטה שלנו אינה דורשת ניטור של חלוקת חיידקים.

במקום זאת, אנו יכולים לגשת לפרופיל הרגישות שלהם ישירות מהאוכלוסייה הקטנה הקיימת. ההשלכות של טכניקה זו מגיעות לאבחון זיהומים חיידקיים עמידים מכיוון שהשיטה מהירה, ניתנת לריבוב ואוטומטי בקלות כדי ליצור את שכבת ה-PDMS התחל בהסרת גז של תערובת צמיגה PDMS שהוכנה טרייה בתא ואקום בטמפרטורת החדר לאחר שעה, השתמש בסולם כדי למלא את תבנית האלומיניום במסה מוגדרת מראש של תערובת PDMS DGAs. יוצקים את ה-PDMS לאט על מרכז התבנית, דואגים לשמור על התבנית מפולסת והסיכות חשופות.

רפאו את ה-PDMS למשך הלילה בתנור של 37 מעלות צלזיוס. למחרת בבוקר, שחרר את לוחית התבנית העליונה והסר בזהירות את ה-PDMS הנרפא מהתבנית כדי להרכיב את תא הזרימה. ראשית, הנח את חלון הזכוכית בכיס תא הזרימה.

לאחר מכן הנח מגלשת זכוכית מצופה מעל חלון הזכוכית בתוך כיס תא הזרימה כשהצד הפעיל כלפי מעלה. שכבת ה-PDMS הטרייה שנוצרה כשהתעלות פונות כלפי מטה מעליה כך שכניסות הערוץ מתיישרות עם החורים העוברים בלוחית המתכת. דחוף בעדינות את האוויר החוצה מבין השכבות ולאחר מכן הפוך את מכלול שקופיות הזכוכית PDMS כך שה-PDMS יפנה לחלון הזכוכית.

חפפו את כניסות ערוץ ה-PDMS עם החורים העוברים בלוחית המתכת, ולאחר מכן הניחו את לוחית הלחץ מעל והדקו את הברגים. כעת הנח את תא הזרימה המורכב מתחת למיקרוסקופ, הגדר את הגדלת המיקרוסקופ ל-60 x ויישר מראש את מיקומי התעלה כדי להכין חיידקי שלב לוג להעמסה לתא הזרימה מעורבב 50 מיקרוליטר של מושבת החיידקים המתורבתת הלילה המעניינת לתוך 50 מיליליטר של מרק MH שני טרי. דגירה במשך שלוש שעות עם טלטול ב -250 סל"ד ו -37 מעלות צלזיוס לאחר צנטריפוגת תת-התרבות 10 מיליליטר של התרבות למשך שתי דקות ב -1, 650 פעמים G וטמפרטורת החדר.

לאחר מכן הסר את הסופרנטנט והשהה מחדש את הגלולה במיליליטר אחד של MH Two מדיה טרייה. לאחר מכן, חבר אורך קצר של צינור למזרק מיליליטר אחד ושטוף את הצינור במיליליטר אחד של מדיה, והשאיר כמות קטנה של מדיה בצינור כדי למנוע בועות אוויר בעת משיכת תרחיף החיידקים. לאחר מכן טען 0.7 מיליליטר של החיידקים לתוך המזרק ומלא שתי תעלות של תא הזרימה בתרבית תאי החיידקים.

שקיפות הערוץ משתנה כשהוא מתמלא בחיידקים. לאחר מכן דגרו את תא הזרימה למשך 45 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס כדי לאפשר לחיידקים להיצמד למשטח המגלשה. להכין את הפתרונות לניסוי.

ראשית, מלאו שני מזרקים של 60 מיליליטר בתמיסת בקרה טרייה שהוכנה ושני מזרקים של 60 מיליליטר בתמיסת אנטיביוטיקה טרייה. החלק את המזרקים כדי להסיר בועות אוויר ולאחר מכן חבר את צינור הקלט ודחף את התמיסות המתאימות דרך קצה הצינור. שמור את התמיסות עטופות בנייר אלומיניום כדי למנוע השפלה קלה של הריאגנטים.

כעת הרכיבו את המזרקים עם תמיסה ניסיונית על המשאבה, אחד בכל פעם. סחטו את הבוכנות שלהם לפי הצורך כדי להתאים אותם למשאבה. נעל את המזרקים במקומם כשהמזרק מחזיק את המשקוף.

הגדר את מהירות המשאבה למיליליטר לדקה ואת נפח המשאבה ל-60 מיליליטר ושטוף את המשאבה עד לזרימת נוזלים קבועה מכל המזרקים. כעת התחל את הניסוי על ידי הוצאת תא הזרימה מהאינקובטור והרכבתו על שלב המיקרוסקופ הפגום מראש. לאחר מכן, חבר צינור קלט אחד המגיע ממזרק וצינור פלט אחד העובר לבקבוק פסולת לכל אחד מתעלות תאי הזרימה.

בשלב זה, הניסוי מוכן במלואו ומוכן להתחיל. הגדר את זמן רכישת ניגודיות הפאזה ל-10 מילישניות ואת זמן רכישת הקרינה ל-1600 אלפיות השנייה, ולאחר מכן קבל תמונות ניגודיות פאזה ופלואורסצנטיות עבור כל מיקום לפני התחלת הזרימה. שימו לב שלפני תחילת תמונת הזרימה, התמקדות בתחתית הערוץ עשויה להיות בלתי ניתנת להשגה בגלל הצפיפות הגבוהה של חיידקים טעונים בתוך התעלה.

כעת התחל את זרימת הנוזל. בדוק מיד שהמיקרוסקופ ממוקד בתחתית הערוצים. לאחר מכן צלם תמונות ניגודיות פאזה ופלואורסצנטיות של אזורי המטרה בדקה הראשונה של הזרימה.

רכוש תמונות כל שתי דקות לאחר סט התמונות הראשון עד להתרחשות 60 דקות של זרימה. התמקדות מחדש לפי הצורך כדי להבטיח שהניסוי מתקדם כראוי, ניתן לבחון נתוני ניגודיות פאזה ופלואורסצנציה נרכשים. במדגם נתונים זה, מתח רגיש הועמס לערוצים 1 ו-2, בעוד שמתח התנגדות היה בערוצים 3 ו-4.

בסוף הניסוי, הפעל מחזור ניקוי עם מריחה רציפה של אקונומיקה ומים. מלאו ארבעה מזרקים של 20 מיליליטר ב-10 מיליליטר של תמיסת אקונומיקה של 10% וארבעה מזרקים של 60 מיליליטר במים. לאחר הבעבוע, חבר את המזרקים המלאים באקונומיקה לתא הזרימה והגדר את מהירות המשאבה למיליליטר אחד לדקה ואת נפח המשאבה לשלושה מיליליטר.

הפעל את המשאבה למשך שלוש דקות, עקוב אחר ניקוי הערוץ על המסך. לאחר שלוש דקות, החלף את מזרקי האקונומיקה במזרקי מים והפעל במשך 30 דקות במיליליטר אחד לדקה. לבסוף, ספרו את מספר החיידקים בכל תמונה באמצעות תוכנת עיבוד תמונה.

חשב את אחוז המוות של תאי חיידקים מנורמל כפונקציה של זמן באמצעות נוסחה זו שבה NF שווה למספר החיידקים המתים כפי שנספר בספירת תמונות הקרינה. ו-NP שווה למספר הכולל של חיידקים כפי שנקבע מתמונת ניגודיות הפאזה. התמונות המוצגות כאן ממחישות את התגובה תלוית הזמן של זן סטפילוקוקוס אריה רגיש לאוקסאצילין בתוך תא זרימה מיקרופלואידי.

רבעים אלה מציגים תמונות ניגודיות פאזה שנרכשו דקה לאחר תחילת הניסוי ובשעה אחת עם תמונות הקרינה המתאימות המוצגות כאן. עלייה משמעותית במספר החיידקים הפלואורסצנטיים נצפתה בסוף הניסוי המצביעה על מוות תאים בתוך התעלה ועל רגישות הזן לאנטיביוטיקה עקב חוסר אחידות סטוכסטית של שקופיות מצופות אפוקסי בודדות. יתכן אובדן תאי חיידקים לאורך כל הניסוי תחת לחץ מוחלט מתמשך כדי להסביר את השונות הזו, כל תמונת פלואורסצנטיות של אוכלוסיית תאים מתים מנורמלת עם תמונת ניגודיות הפאזה הנרכשת במשותף נותנת לאוכלוסיית התאים הכוללת תוך שנייה אחת מאותה נקודת זמן.

הגדלות אלו מדגימות כי אלגוריתם הספירה מצליח יותר בספירה מדויקת של חיידקים בודדים בתמונות פלואורסצנטיות מאשר בתמונות ניגודיות פאזה מאוכלסות בצפיפות. כתם התא המת נותן ניגודיות פלואורסצנטית גבוהה עבור חיידקים מתים בודדים. מאחר שמספר החיידקים הפלואורסצנטיים לעיתים רחוקות עולה על 5% מהמספר הכולל, כל חיידק בהיר מאוד בהשוואה לרקע.

לכן, ניתן לספור בקלות את החיידקים הפלואורסצנטיים ברמת דיוק גבוהה. לדוגמה, בניסוי זה של 5,828 חיידקים בסך הכל שזוהו, שהודגשו באדום 174 נקבעו כמתים כאן. נתוני MSSA ו-Mr.RSA מנורמלים עבור שלושה ניסויים שונים מומחשים כצפוי עבור זנים עמידים, מוות התאים המנורמל נמוך בגודלו פחות מ-0.5% ואינו משתנה במהלך הניסוי.

זנים רגישים, לעומת זאת, מראים עלייה מתמדת במוות התאים וערך גבוה יותר של 1% עד סוף הניסוי. התחלת מוות תאי עבור זנים רגישים משתנה מעט בין הניסויים, אך מתרחשת בדרך כלל בין 10 ל-30 דקות. אל תשכח שעבודה עם פתוגנים עמידים לאנטיביוטיקה עלולה להיות מסוכנת ביותר, ותמיד יש לנקוט באמצעי זהירות כגון טכניקת ספיגה בעת ביצוע הליך זה.

טכניקה זו תסלול את הדרך לחוקרים לחקור כיצד חיידקים מגיבים ללחץ ותשפיע על פיתוח אבחון מהיר חדש וגילוי תרופות חדשות.