Microinjection מתא בודד לניתוח תקשורת נייד
February 26th, 2017
אנו מתארים כאן כיצד לבצע microinjection מתחיל מתא בודד הצהוב לוציפר לדמיין תקשורת סלולרית באמצעות-צומת פער בתאים חיים, ולספק כמה עצות שימושיות. אנו מצפים כי מסמך זה יעזור לכולם להעריך את מידת צימוד הסלולר בשל צומת פער פונקציונליים. הכל המתואר כאן יכול להיות, באופן עקרוני, מותאמי צבעי ניאון אחרים עם משקל מולקולרי להלן 1,000 Daltons.
היי, שמי ענאל. אני עובד בקרן אוסוולדו קרוז במעבדה לתקשורת סלולרית. אנו חוקרים כאן קולטני P2 והזרקת רווח בהקשר של מערכת החיסון והכבד.
היום אציג בפניכם את המיקרו-הזרקה של התא. זריקות פער ממלאות כמה תפקידים פיזיולוגיים כמו העברת סינפסות, התכווצויות לב ואחרים. עבור טכניקה זו, אנו יכולים לחקור אם זריקות הרווח מתפקדות או לא.
אוקיי, בואו נראה את מרכיבי הבסיס של מערך המיקרו-הזרקה. כאן יש לנו את המיקרוסקופ הקרינה ההפוך שבו נראה את התאים. זוהי מצלמת CCD לתיעוד התוצאות.
יש לנו כאן את הגנרטור הנוכחי שנכניס את הצבע לתא. בשלב הבא יש לנו את המחזיק בו מחוברת המיקרואלקטרודה. והמיקרו-מניפולטור שמחובר למחזיק ומאפשר את תנועת המיקרואלקטרודה בשלושת הצירים, Z, Y ו-X.לפני שנתחיל את הניסוי, עלינו ליצור את המיקרואלקטרודה.
אנו משתמשים בנימי זכוכית בורוסיליקט זה ובציוד זה בשם פולאר. אנו מחברים כאן את נימי הבורוסיליקט. את נימת הטונגסטן הזו נחמם כדי ליצור שתי מיקרואלקטרודות.
עכשיו החימום של חוט הטונגסטן והגל כאן נמשוך למטה כדי ליצור את שתי המיקרואלקטרודות. קל. הצעד הראשון שלנו הוא למלא את המיקרואלקטרודה בצבע. טיפ אחד כאן הוא שאתה צריך למלא רק את הקצה בכמה מיקרוליטרים כדי לבצע את הניסוי.
אין צורך למלא הכל. הערה עם פרטים נוספים. מלאו רק את הקצה.
בואו נתחיל בניסוי. יש לנו כאן את התאים בצלחת הפטרי, בתמיסת נתרן. חוט הכסף מחובר לגנרטור הנוכחי.
כעת עלינו לחבר את המיקרו-אלקטרודות בשלב הראש. כאן בשלב הראש יש לנו חוט כסף נוסף המחובר גם לגנרטור הנוכחי. ברגע שהמיקרואלקטרודה מחוברת, אנו יכולים להכניס אותה לאמבטיה.
שימו לב שקצה הפיפטה נוגע בזהירות באמבטיה. הליך זה נעשה בזהירות רבה כדי למנוע התרסקות של הקצה בתחתית צלחת הפטרי. ברגע שנכנסים לאמבטיה, אנו יכולים ללכת למיקרוסקופ כדי לחפש את הצל של המיקרופיפטה.
אנו ממליצים שנתחיל להסתכל בעדשת ההגדלה. כאשר אנו מוצאים את הצל של הפיפטה, אנו יכולים להזיז את המיקרואלקטרודה לכיוון התא באמצעות המיקרומניפולטור. ברגע שהיא קרובה מאוד לתא, אנו יכולים לבצע עמדת בדיקה כדי לוודא אם המיקרואלקטרודה אינה חסומה.
איך נראה בהמשך. כאן אנו רואים את המיקרופיפטה ואנו מכוונים את המיקרופיפטה קרוב מאוד לתא. אנו יכולים לראות תנועת תאים ימינה ושמאלה.
לאחר מכן אנו עוברים למסנן, מסנן הקרינה. אנו יכולים ליישם דופק היפרפולריזציה כדי לבדוק אם קצה הפיפטה אינו חסום. מאחר שהמיקרופיפטה נמצאת בתוך התא, אנו יכולים להפעיל פולס היפר-פולריזציה כדי להעמיס את התא עם הצבע.
אנו משתמשים כאן בצבע הצהוב החופשי הרופף. לאחר העמסת התא בצבע, אם התאים השכנים מחוברים על ידי זריקות רווח, אנו ממתינים מספר דקות ונראה תאים שכנים מתבהרים על ידי דיפוזיה של הצבע על ידי זריקות מרווח אלה. בניסוי שלנו אנו יכולים לראות חמישה תאים, מסומנים בכוכבים, שמראים פלואורסצנטיות.
כאן יש דוגמה טובה לניסוי של מיקרו-הזרקה בתאי אפיתל תימיים, ב-A ו-B.In באיורים C ו-D, מראה מיקרו-הזרקה בתא אינרטי תימי של צהוב חופשי רופף וצבע אחר, לא חדיר להזרקת רווח המוצגת בתוספת. קו תאי האפיתל התימיים של האיור E ו-F מוזרק במיקרו צהוב חופשי רופף ובתוספת צהוב חופשי רופף ובלוק הזרקת רווח. התוצאות מראות כי צהוב חופשי רופף לא התפשט לתאים השכנים.
לאחר מכן אנו רואים מיקרו-הזרקה בתאי אפיתל תימיים, בנוכחות דקסמתזון והכימות ב- B.דקסמתזון הגדיל את מידת הצימוד, כפי שמוצג באיור B.מתוך 100 זריקות, מספר שלושה או ארבעה תאים מחוברים היה שכיח יותר בנוכחות תרופה זו. אני מקווה שאוכל לעזור למתחילים לעשות את הטכניקה החשובה הזו לחקר תקשורת סלולרית. תודה וביי.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
סקירה
מאמר זה מתאר את הטכניקה של מיקרו-הזרקה של תא יחיד של Lucifer Yellow כדי להמחיש תקשורת תאית דרך חיבורי פער בתאים חיים. הוא מספק טיפים מעשיים לחוקרים כדי להעריך את הצמדה התאית עקב חיבורי פער פונקציונליים.
מרכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- תקשורת תאית
- נוירולוגיה
- אימונולוגיה
רקע
- חיבורי פער משחקים תפקידים קריטיים בתהליכים פיזיולוגיים.
- הם מעורבים בהעברה סינפטית והתכווצויות לב.
- הבנת הפונקציונליות שלהם חיונית למחקרים ביולוגיים שונים.
- Lucifer Yellow הוא צבע פלורסנטי המשמש להמחשה.
מטרת המחקר
- להדגים את טכניקת המיקרו-הזרקה לחקר חיבורי פער.
- להעריך את מידת הצמדה התאית בתאים חיים.
- לספק תובנות לגבי הפונקציונליות של חיבורי פער.
שיטות בשימוש
- מיקרו-הזרקה של תא יחיד של Lucifer Yellow.
- המחשת תקשורת תאית.
- הערכה של חיבורי פער פונקציונליים.
- התאמת הטכניקה לצבעים פלורסנטיים אחרים.
תוצאות עיקריות
- המחשה מוצלחת של תקשורת תאית דרך חיבורי פער.
- הוערכה של הצמדה תאית הוכחה.
- הטכניקה חלה על צבעים פלורסנטיים שונים מתחת ל-1,000 דלטון.
- תובנות על התפקידים הפיזיולוגיים של חיבורי פער סופקו.
מסקנות
- הטכניקה של המיקרו-הזרקה יעילה לחקר חיבורי פער.
- Lucifer Yellow משמש ככלי שימושי להמחשה.
- הממצאים תורמים להבנת התקשורת התאית במערכות חיות.
