Name: שימוש ב-Caenorhabditis elegans כמערכת מודל לחקר הומאוסטזיס חלבון באורגניזם רב-תאי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-18T14:15:00.000+00:00
Duration: 12 min 38 s
Description: חקור הומאוסטזיס חלבון באמצעות Caenorhabditis elegans כמודל רב-תאי. למדו לנטר קיפול לקוי ברמות האורגניזם, התא והחלבון באמצעות מבחני התנהגות ומיקרוסקופיה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

כל זני הנמטודות ששימשו בעבודה זו סופקו על ידי המרכז לגנטיקה של Caenorhabditis, הממומן על ידי המרכז הלאומי למשאבי מחקר של ה-NIH (NCRR). הנוגדנים החד-שבטיים שפותחו על ידי ה.פ. אפשטיין התקבלו מבנק ההיברידומה למחקרים התפתחותיים שפותח בחסות ה-NICHD ומתוחזק על ידי המחלקה לביולוגיה באוניברסיטת איווה. נ. שמש נתמך על ידי פרס פיי וברט הארבור. א.ב.-ז. נתמך על ידי מלגת אלון של המועצה הישראלית להשכלה גבוהה, על ידי מענק מארי קירי בינלאומי לשילוב מחדש, ועל ידי מענקים מהקרן הדו-לאומית למדע והקרן הלאומית למדע (מענק מס' 91/11).

שימוש במבחנים התנהגותיים לניטור קיפול חלבון באורגניזם חי
1. סנכרון בעלי חיים לבדיקות התנהגותיות
<ol>
	<li>עקוב אחר השיטות הסטנדרטיות לתחזוקה של C. elegans36, כולל הכנת מדיה וצלחות, הכנת מזון ותנאי גידול בעלי חיים. שליטה קפדנית בתנאי הגידול, כולל טמפרטורה (15-25 מעלות צלזיוס), גודל האוכלוסייה וזמינות המזון. השליכו כל צלחת שמראה זיהום חיידקי או פטרייתי.</li>
	<li>בוחרים 15-30 עוברים, מעבירים אותם לצלחות חדשות וגדלים בטמפרטורה הרצויה (15-25 מעלות צלזיוס) למשך הניסוי. לחלופין, הניחו 10-20 מבוגרים על צלחת, הניחו להם להטיל ביצים במשך 30-60 דקות ואז הוציאו אותם מהצלחת. גם קטיף ישיר של עוברים וגם קביעת בוגרים גרבידיים יתנו שונות מסוימת בגיל (±6 שעות). כדי להפחית את השונות הזו, בחר עוברים בשלב מסוים, למשל שלב פסיק, או קבע 10-20 בוגרים שרק מתחילים להטיל ביצים (יום 2 לבגרות). הימנע מסנכרון על ידי הלבנה במידת האפשר, בהתחשב בכך שטיפול זה מלחיץ ויכול להשפיע על פרוטאוסטזיס.</li>
	<li>בחרו בעלי חיים מסונכרנים, העבירו ללוחית בדיקה לניקוד ואז זרקו.</li>
</ol>
2. בדיקת תנועה
בחר בעלי חיים מסונכרנים והעביר לצלחת נקייה בטמפרטורת הרצון לניקוד תנועה (15-25 מעלות צלזיוס). עבור כל שכפול ביולוגי, ציין >20 בעלי חיים וחזור על הבדיקה לפחות פי 3 לכל תנאי ניסוי. השתמש במבחן סכום הדירוג של Wilcoxon Mann-Whitney כדי להשוות בין שני תנאי ניסוי בלתי תלויים.
<ol>
	<li>כדי לבדוק ליקוי תנועה קל, הצב 5-7 בעלי חיים במרכז מדשאה חיידקית נקייה ואפשר לבעלי החיים לנוע על הצלחת למשך 2 דקות. מרווח זמן זה נקבע על סמך הזמן שלקח ל-90% מחיות הבר לפנות עיגול של 1 ס"מ.</li>
	<li>ספרו את מספר בעלי החיים שלא פינו עיגול של 1 ס"מ (למשל שנשארו ברדיוס של 1 ס"מ מהנקודה שבה הם נקבעו) תוך 2 דקות כלא מתואמים.</li>
	<li>כדי לבדוק אם יש ליקוי תנועה חמור, הניחו את בעלי החיים על מדשאה חיידקית נקייה.</li>
	<li>צלמו כמה בעלי חיים בזמן אפס (t=0) ושוב כעבור 5 דקות (t=5). ציון בעלי חיים שלא זזו אורך גוף אחד לאחר 5 דקות כמשותקים.</li>
</ol>
3. התנגדות תרמית
<ol>
	<li>בחרו >20 בעלי חיים מסונכרנים והעבירו לצלחת של 24 בארות המכילה מאגר הלם חום (HS) של 450 מיקרוליטר (טבלה 1). עבור כל שכפול ביולוגי, ציין >20 בעלי חיים וחזור על הבדיקה לפחות פי 4 לכל תנאי ניסוי.</li>
	<li>מעבירים צלחת 24 באר לאמבטיה מחוממת. טמפרטורת HS ומשך הזמן תלויים מאוד בתנאי הגידול, בפרט בטמפרטורת הגידול.</li>
	<li>השלם את מאגר ה-HS עם 9 מיקרוליטר SYTOX כתום.</li>
	<li>ציון הישרדות בעלי חיים על ידי ניטור ספיגת הצבע, באמצעות סטריאוסקופ פלואורסצנטי עם מסנן TXR. בעלי חיים שלקחו את הצבע מתים. השתמש במבחן סכום הדירוג של Wilcoxon Mann-Whitney כדי להשוות בין שני תנאי ניסוי בלתי תלויים.</li>
</ol>
שימוש בצביעה חיסונית וחלבונים מתויגים לניטור קיפול חלבונים בתאים ספציפיים
4. עקוב אחר לוקליזציה של חלבונים על ידי צביעה חיסונית
<ol>
	<li>בשלב הנדרש, העבירו לפחות 30 בעלי חיים לצינור אפנדורף המכיל מאגר M936.</li>
	<li>שטפו את בעלי החיים מספר פעמים עם מאגר M9 על ידי ביצוע שלב צנטריפוגה קצר במהירות נמוכה (3,000 סל"ד/900 x גרם, 2 דקות) והשעיה מחדש.</li>
	<li>הניחו את הצינורות על קרח למשך מספר דקות להתקררות.</li>
	<li>הסר עודפי נוזלים ודגר עם תמיסת פרפורמלדהיד 4% קרה כקרח של 500 מיקרוליטר (טבלה 2). יש לכייל את זמן הדגירה עבור כל חלבון שנבדק וצריך להיות בסביבות 5-30 דקות בטמפרטורת החדר. ניתן לבצע גם דגירה ממושכת ב-4 מעלות צלזיוס, אך הדבר עלול לפגוע בחדירות הדגימה.</li>
	<li>שטפו בעלי חיים קבועים פי 3 עם מאגר PBS-Tween (pH 7.2) על ידי צנטריפוגה (3,000 סל"ד, 1-2 דקות). ניתן לאחסן את בעלי החיים בשלב זה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך מספר שבועות.</li>
	<li>אוספים את החיות בצנטריפוגה (3,000 סל"ד, 1-2 דקות).</li>
	<li>במכסה המנוע, הסר את רוב הסופרנטנט והשהה מחדש את הגלולה בתמיסת β-מרקפטואתנול (β-ME) של 1 מ"ל (טבלה 2).</li>
	<li>דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה עם נדנוד עדין על נוטר.</li>
	<li>במכסה המנוע, שטפו בעלי חיים פי 3 עם מאגר PBS-Tween (pH 7.2).</li>
	<li>השעו מחדש את בעלי החיים ב-50-100 מיקרוליטר של PBS-Tween (pH 7.2). ניתן לאחסן את בעלי החיים בשלב זה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך מספר שבועות.</li>
	<li>אסוף את החיות בצנטריפוגה (3,000 סל"ד, 1-2 דקות) והסר את רוב מאגר PBS-Tween.</li>
	<li>מוסיפים 100-150 מיקרוליטר תמיסת קולגנאז לכל צינור ודוגרים ב-37 מעלות צלזיוס בערבול חזק (באמצעות תרמו-מיקסר או אינקובטור רועד).</li>
	<li>בדוק את בעלי החיים לעתים קרובות תחת סטריאומיקרוסקופ, החל מ-5 דקות של דגירה. כאשר 20% מבעלי החיים נשברים, עצרו את התגובה על ידי הנחת הצינור על קרח. שלב זה רגיש ביותר! משך הטיפול תלוי בתנאי הקיבוע ויכול להשתנות מאוד בין הזנים. דגירה ממושכת עלולה לגרום להשפלה מוחלטת של בעלי החיים. יש לכייל את התנאים עבור כל אצווה אנזימטית המשמשת ולעקוב בקפידה אחר הפירוק</li>.
	<li>שטפו את החיות פעמיים ב-PBS-Tween (pH 7.2) ולאחר מכן אספו את החיות על ידי צנטריפוגה (3,000 סל"ד, 1-2 דקות) והסירו את רוב המאגר PBS-Tween.</li>
	<li>יש להוסיף 1 מ"ל תמיסת AbA (טבלה 2) ולדגור עם נדנדה עדינה למשך שעה בטמפרטורת החדר. ניתן לאחסן את בעלי החיים בשלב זה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך מספר שבועות.</li>
	<li>אוספים את החיות על ידי צנטריפוגה (3,000 סל"ד, 1-2 דקות) ומשהים מחדש ב-200 מיקרוליטר AbA.</li>
	<li>הוסיפו את הנוגדן העיקרי המדולל ל-1:100-1:1,000 בתמיסת AbA ודגרו עם נדנוד עדין. הטמפרטורה ומשך הדגירה יכולים להשתנות בין נוגדנים ויש לכייל אותם עבור כל חלבון שנבדק. אנו מתחילים בדגירה של לילה בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>שוטפים את בעלי החיים בצנטריפוגה (3,000 סל"ד, 1-2 דקות).</li>
	<li>יש להוסיף חוצץ AbA (1 מ"ל) ולדגור בערבוב עדין למשך 15-60 דקות בטמפרטורת החדר. ניתן לאחסן את בעלי החיים בשלב זה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך מספר שבועות.</li>
	<li>אופציונלי: ניתן להכתים את הדגימה גם בצבעי פלורסנט. לשם כך, הוסיפו את הצבע (למשל DAPI (2 מ"ג/מ"ל) או פלואידין (1:100)) ל-200 מיקרוליטר AbA ודגרו עם נדנוד עדין עד שעה. ניתן לבצע שלב זה במהלך אחד השלבים לשטיפת הנוגדן המשני.</li>
	<li>שטפו את בעלי החיים פי 3 על ידי חזרה על שלבים 4.18-4.19.</li>
	<li>הוסף 100 מיקרוליטר AbA עם הנוגדן המשני המתאים המתויג פלואורסצנטי, מדולל 1:100.</li>
	<li>שמרו על הדגימות מכוסות (או בצינור כהה) ודגרו עם נדנדה במשך מספר שעות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>שטפו את בעלי החיים 3 פעמים על ידי דגירה במאגר AbA (1 מ"ל) עם ערבוב עדין במשך 15-60 דקות בטמפרטורת החדר ואחריו צנטריפוגה (3,000 סל"ד, 1-2 דקות). ניתן לאחסן את בעלי החיים בשלב זה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך מספר שבועות.</li>
	<li>כדי להרכיב בעלי חיים על מגלשות, הסר את כל הנוזלים והשהה מחדש ב-10 מיקרוליטר מאותו מאגר.</li>
	<li>חותכים את קצה קצה הפיפטה כדי למנוע שיפוע של בעלי החיים ומעבירים 1-2 מיקרוליטר מהדגימה לשקופית.</li>
	<li>הוסף אמצעי הרכבה ביחס של 1:1.</li>
	<li>מכסים את השקופית בעדינות עם כיסוי ואוטמים עם לק. אם השקופית אינה מנוטרת באופן מיידי, ניתן לאחסן את השקופיות בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס לפרק זמן ממושך.</li>
</ol>
5. עקוב אחר לוקליזציה של חלבונים מתויגים
<ol>
	<li>בשלב הנדרש, אספו לפחות 15 בעלי חיים לטיפה של 10 מ"ל של מאגר M9 על מגלשה.</li>
	<li>בעזרת "קיסם תולעים", העבירו את החיות לטיפה של 10 מ"ל של תמיסת פרפורמלדהיד (4%) (טבלה 2) והמתינו עד שכל החיות יפסיקו לזוז (כ-5 דקות).</li>
	<li>בעזרת "קיסם תולעים", העבירו את החיות לטיפה של 2 מ"ל של מאגר M9 ומדיום הרכבה (1:1) (טבלה 2).</li>
	<li>מכסים בעדינות את בעלי החיים בכיסוי ואוטמים בלק.</li>
</ol>
שימוש במבחני ex vivo לניטור קיפול ויציבות החלבון
6. עיכול חלקי
<ol>
	<li>שטפו בעלי חיים מ-15 צלחות (60 מ"מ) באמצעות מאגר M9 של 1-2 מ"ל בצינור מיקרופוגה. שימו לב שבעלי חיים לא צריכים להיות צפופים וצריך להיות מספיק מזון זמין לאורך כל הניסוי.</li>
	<li>שטפו את החיות כמה פעמים עם חיץ M9 על ידי צנטריפוגה (3,000 סל"ד, 2 דקות) והשעיית בעלי חיים.</li>
	<li>לאחר הסיבוב האחרון, השעו מחדש בעלי חיים במאגר M9 של 100 מיקרוליטר.</li>
	<li>הקפאת בזק בנוזל N2. ניתן לאחסן דגימות בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>בעזרת עלי צונן ומקדחה ממונעת (ניתן להשתמש גם במקדחה ידנית לתרבית רקמות), טוחנים את הדגימה. שמור את הדגימה על קרח והימנע מהתחממות יתר.</li>
	<li>בדוק את בעלי החיים לעתים קרובות תחת מיקרוסקופ סטריאומיקרוסקופ כדי לקבוע אם הטחינה הושלמה. אם נותרו בעלי חיים שלמים, חזור על ההליך.</li>
	<li>הערך את הנפח על ידי פיפטינג של תמצית התולעת.</li>
	<li>הוסף יחס של 1:1 של תמיסת ליזיס תולעים (פי 2) (טבלה 3). אין להשתמש במעכבי פרוטאז מכל סוג שהוא.</li>
	<li>דגירה על קרח למשך 15 דקות.</li>
	<li>הסר פסולת על ידי צנטריפוגה (1,000 x גרם למשך 2 דקות) בצנטריפוגה מקוררת מראש (4 מעלות צלזיוס).</li>
	<li>העבירו את הסופרנטנט לצינור מיקרופוגה נקי. ניתן להשתמש בדגימות ישירות או לאחסן בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>הכן תמיסת כימוטריפסין (טבלה 3) ושמור על קרח עד לשימוש.</li>
	<li>קבע את ריכוז החלבון הכולל באמצעות מבחן ברדפורד.</li>
	<li>יש לדלל את הדגימה במידת הצורך כך שריכוז החלבון הכולל יהיה 3-3.5 מ"ג/מ"ל.</li>
	<li>הוסף תמיסת כימוטריפסין לליזאט החלבון הכולל (1:1,200).</li>
	<li>כדי לקבוע את זמן הדגירה, דגרו את הדגימה עם כימוטריפסין למשך 60 דקות. הסירו 20 מיקרוליטר מהדגימה בנקודות זמן שונות (למשל 0, 5, 20, 40 ו-60 דקות), ערבבו מיד עם מאגר דגימת SDS והרתיחו במשך 5 דקות ב-96 מעלות צלזיוס. *לחלופין, דגרו את הדגימה בריכוזים שונים של כימוטריפסין והפסקו את התגובה לאחר זמן מסוים על ידי הוספת מאגר דגימת SDS והרתחה למשך 5 דקות ב-96 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>הפעל דוגמאות על ג'ל SDS-PAGE.</li>
	<li>בצע ניתוח כתמים מערביים באמצעות נוגדנים מתאימים כדי לקבוע את היציבות היחסית של החלבון.</li>
	<li>לקבוע את התנאים האופטימליים (ריכוז כימוטריפסין וזמן עיכול) המראים שינוי משמעותי בין הדגימות ולהשתמש בתנאים אלה לניסויים עתידיים.</li>
	<li>קבע את העוצמה של תוצרי עיכול שונים (שברי משקל מולקולרי נמוכים יותר) באמצעות תוכנת דנסיטומטריה, כגון מודול ג'ל התמונה של NIH.</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

בדיקות של יכולת הפרוטאוסטזיס התאית חייבות להיות רגישות מאוד לשינויים בסביבת הקיפול ולהיות מנוטרות בקלות כדי לספק הערכה בזמן אמת של יכולות בקרת איכות קיפול החלבון. באמצעות חלבונים יציבים כבדיקות של יכולת פרוטאוסטזיס, עקבנו אחר שינויים בפנוטיפ, לוקליזציה של חלבון תת-תאי וקונפורמציה של חלבון. הפרוטוקולים המוצגים כאן מתמקדים בפנוטיפים הקשורים לחלבון השריר, כולל תנועתיות, ארגון חוטי שריר ויציבות מיוזין. עם זאת, ניתן לשנות פרוטוקולים אלה לניטור חיישנים מתקפלים אחרים. עבור פנוטיפים התנהגותיים, חשוב לתכנן בדיקה פשוטה וחזקה לקביע...

יחסי הגומלין בין השלבים השונים של ביוסינתזה של חלבונים, כגון שעתוק, עיבוד ותרגום mRNA, כמו גם קיפול חלבונים, טרנסלוקציה והרכבה/פירוק, קובע את העומס של חלבונים יציבים התלויים במנגנוני בקרת איכות החלבון התאיים לתפקודם1. היעדר או תקלה במכונות בקרת איכות חלבון עלול, אם כן, לגרום לירידה תפקודית של סוגים שונים של מכונות תאיות ולהופעת מחלות קיפול חלבונים2-7. כאשר היכולת של מכונות קיפול ופינוי חלבונים מאוזנת עם העומס של חלבונים יציבים, מושג הומאוסטזיס חלבון (פרוטאוסטזיס), מצב שבסופו של דבר מונע הצטברות של חלבונים לא מקופלים והצטברות בתוך תאים6. הצטברות של חלבונים לא מקופלים נחשבת לאות המפעיל גורמי שעתוק המעוררים מתח, כגון גורם הלם חום (HSF-1), ומביא להפעלת תגובות מתח מגן ציטו6,8.
הבנתנו את הפונקציות של רשתות פרוטאוסטזיס במטזואנים נגזרה בעיקר ממחקרי בנייה מחדש במבחנה ומתצפיות שנעשו עם תאי תרבית רקמות ואורגניזמים חד-תאיים9. לדוגמה, מחקר על מלווים מולקולריים המונעים ופותרים נזק לחלבון התמקד במחקרים ביוכימיים וביולוגיים תאיים של מנגנוני קיפול חלבון בתיווך צ'פרון, פירוק וטרנסלוקציה10-13. לשם השוואה, רק מידע מוגבל זמין על התפקוד המשולב של רכיבי פרוטאוסטזיס שונים בתאים וברקמות השונות של מטזואנים בתנאי גידול "נורמליים" ובתגובה למתח11. התגלית כי ב-C. elegans, בקרת איכות חלבון תאית יכולה להיות מווסתת גם באופן לא אוטונומי, כפי שבא לידי ביטוי בניסויים המראים כי מוטציות בשני הנוירונים התופסים טמפרטורה יכולות לחסום את הפעלת תגובת הלם החום ולהפחית את הסבילות לחום, הדגימה את הצורך לחקור ויסות פרוטאוסטזיס באורגניזם רב-תאי14-17. מה שחסר, עם זאת, הוא תמונה מגובשת של האופן שבו רשתות פרוטאוסטזיס, כגון משפחות המלווים המולקולריות השונות, מתפקדות ברקמות של מטזואן שלם ועד כמה דינמיות רשתות אלה במהלך ההתפתחות וההזדקנות. כדי לעמוד ביעד זה, יש צורך בחיישנים אמינים לניטור תחזוקת פרוטאום בבעלי חיים כדי לקבוע את הקיבולת הפרוטאוסטטית של תאים שונים באורגניזם רב-תאי במהלך ההתפתחות וההזדקנות.
כדי שחלבון נתון יתפקד כחיישן של פרוטאוסטזיס תאי, עליו להגיב לשינויים בסביבת הקיפול התאית, תוך הפרעה מינימלית בלבד לקיפול של חלבונים לא קשורים בתא. כדי לחקור את התחזוקה וההתאוששות של פרוטאוסטזיס תאי באורגניזם חי, ניתן לנקוט בשתי גישות משלימות התלויות בחיישנים מתקפלים. הראשון מסתמך על חיישנים מתקפלים מתוכננים, המבוססים על חלבונים מטה-יציבים שזוהו בניסוי וידועים כתלויים במכונות פרוטאוסטזיס, כגון גחלילית לוציפראז18-20 או GFP המתויג עם דגרון21-24. בגישה השנייה, חלבונים אנדוגניים מטה-יציבים, כגון חלבונים רגישים לטמפרטורה או חלבונים מצטברים תלויי גיל המגיבים לשינויים מצטברים בסביבה התאית, עוקבים25-27. חיישנים מתקפלים מעוצבים אינם משרתים פונקציה ביולוגית חיונית אך מציעים את היתרון בכך שהם ניתנים לזיהוי על ידי מבחני דיווח רבי עוצמה, כגון חלבונים מתויגים GFP, וניתן להשתמש בהם עם מודלים תאיים ובעלי חיים רבים ושונים18. עם זאת, מכיוון שהכנסת חלבון זר בודד יכולה להשפיע על סביבת הקיפול27, פוליפפטידים כאלה יכולים להעמיס על מנגנון הפרוטאוסטזיס התאי. לחלופין, חיישני קיפול מעוצבים שאינם מקוריים בתא עליו הם מדווחים עשויים שלא להיות מושפעים משינויים ביכולת הפרוטאאוסטזיס של התא. לדוגמה, מצע מדווח פרוטאזום אחד מתויג GFP דרש עיכוב של ~90% מהפרוטאזום לפני שניתן היה לזהות פנוטיפ23. לעומת זאת, חלבונים אנדוגניים מטה-יציבים המסתמכים על מנגנוני הפרוטאוסטזיס של התא מציעים את היתרון של היותם בטווח הרגישות התאית. עם זאת, אובדן התפקוד הקשור לקיפול שגוי של חלבונים כאלה יכול גם להשפיע על תפקוד התאים ועל כדאיות האורגניזם. כאן, נתמקד בשימוש בחיישני קיפול אנדוגניים של C. elegans.
C. elegans הוא מודל מטזואן מבוסס היטב לחקר התפתחות והזדקנות כאחד, המשתמש במסלולים ביולוגיים שמורים רבים וניתן להשתמש בו כדי לעקוב אחר קיפול חלבונים בתא, תוך שימוש בשילוב של ביולוגיה של התא, גישות ביוכימיות וגנטיות. השתמשנו בחלבונים מטה-יציבים כבדיקות של יכולת פרוטאוסטטית על ידי ניטור שינויים בפנוטיפ, בלוקליזציה וביציבות שלהם. יתר על כן, ניתן לחקור מגוון פונקציות חלבון על ידי ניתוח התנהגותי פשוט. כמו כן, מיקום שגוי משמעותי של חלבונים מתרחש כאשר רשתות בקרת איכות חלבון תאיות אינן מצליחות להתאים את עצמן לדרישות התאים. ניתן לדמיין בקלות חלבונים בתאים של בעלי חיים באמצעות חלבונים מתויגים פלואורסצנטיים או באמצעות צביעה חיסונית. לבסוף, באמצעות שיטות ex vivo, ניתן לעקוב אחר ביטוי החלבון ויציבותו. זה מאפשר סינון מהיר ופשוט של שינויים התנהגותיים ופיזיולוגיים, יחד עם ניתוח מעמיק של לוקליזציה ויציבות של חלבון, המאפשר ניטור של משנים פרוטאוסטזיס. על ידי שילוב שיטות שונות אלה, ניתן לקבל מבט רחב על סביבת קיפול החלבון של התא. ואכן, אסטרטגיה זו שימשה בהצלחה לניטור הפרעות פרוטאוסטזיס ב- C. elegans, שמרים, תרבית רקמות וחיידקים15,25-35.

<table><tbody><tr><td>סטנינג נוגדנים ופיאקסטיון</td><td>פרפורמלדהיד</td><td>Merc</td><td>8187151000</td></tr><tr><td>Tween-20&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1706531</td><td></td></tr><tr><td>קולגנאז</td><td>סיגמא</td><td>C5138-100MG</td><td></td></tr><tr><td>DABCO</td><td>Merc</td><td>8034560100</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Alfa</td><td>Aesar A16046</td><td></td></tr><tr><td>&beta; -ME</td><td>Sigma</td><td>8057400250</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Di Cam</td><td>000-40-100</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; תקציר חלקי&nbsp;</td><td>כימוטריפסין</td><td>סיגמא</td><td>C4129-250MG</td></tr><tr><td>עמידות תרמית</td><td>SYTOX כתום</td><td>Invitrogen</td><td>S11368</td></tr><tr><td>כולסטרול</td><td>אמרסקו</td><td>0433-250G</td><td></td></tr><tr><td>ציוד</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>M165 FC סטריאוסקופ פלואורסצנטי</td><td>Leica</td><td></td><td>TXR מסנן</td></tr><tr><td>EXi כחול פלואורסצנטי מיקרוסקופיה מצלמה</td><td>QImaging</td><td>EXI-BLU-R-F-M-14-C</td><td></td></tr><tr><td>ConfoCor 3/510 META מיקרוסקופ קונפוקלי</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>עלי גלולה</td><td>Sigma</td><td>Z359947-100EA</td><td></td></tr><tr><td>גלולה עלי מנוע אלחוטי</td><td>Kontes</td><td>K749540-0000</td><td></td></tr><tr><td>MicroCL 17 Microcentrifuge סדרת</td><td>תרמו</td><td>75002455</td><td>קירור, 230 וולט 50/60 הרץ, כולל רוטור 24x 1.5/2.0 מ"ל עם מכסה ClickSeal Biocontainment</td></tr></tbody></table>

שימוש ב-caenorhabditis elegans כמערכת מודל לחקר הומאוסטזיס חלבון באורגניזם רב-תאי

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

קיפול והרכבה של חלבונים חיוניים לתפקוד החלבון, לבריאות התא לטווח הארוך ולאריכות ימים של האורגניזם. מבחינה היסטורית, התפקוד והוויסות של קיפול חלבונים נחקרו במבחנה, בתאי תרבית רקמה מבודדים ובאורגניזמים חד-תאיים. מחקרים אחרונים חשפו קשרים בין הומאוסטזיס חלבון (פרוטאוסטזיס), חילוף חומרים, התפתחות, הזדקנות וחישת טמפרטורה. ממצאים אלה הובילו לפיתוח כלים חדשים לניטור קיפול חלבונים באורגניזם המטזואן המודל Caenorhabditis elegans. במעבדה שלנו, אנו משלבים מבחנים התנהגותיים, הדמיה וגישות ביוכימיות תוך שימוש בחלבונים רגישים לטמפרטורה או מטא-יציבים המופיעים באופן טבעי כחיישנים של הסביבה המתקפלת כדי לנטר קיפול שגוי של חלבונים. מבחנים התנהגותיים הקשורים לקיפול שגוי של חלבון ספציפי מספקים קריאה פשוטה ועוצמתית לקיפול חלבון, ומאפשרים סינון מהיר של גנים ומצבים המווסתים את הקיפול. כמו כן, קיפול שגוי כזה יכול להיות קשור למיקום שגוי של חלבון בתא. ניטור לוקליזציה של חלבונים יכול, אם כן, להדגיש שינויים ביכולת הקיפול התאית המתרחשים ברקמות שונות, בשלבי התפתחות שונים ולנוכח תנאים משתנים. לבסוף, באמצעות כלים ביוכימיים ex vivo, אנו יכולים לנטר ישירות את יציבות החלבון והקונפורמציה. לפיכך, על ידי שילוב של מבחנים התנהגותיים, הדמיה וטכניקות ביוכימיות, אנו מסוגלים לנטר קיפול שגוי של חלבון ברזולוציה של האורגניזם, התא והחלבון, בהתאמה.

סביבת קיפול פגועה עלולה להוביל לקיפול שגוי של חלבונים ולהצטברותם (aggregation). קיפול שגוי של חלבונים קשור לשינוי בקונופורמציה וגורם לאובדן תפקוד החלבון. אנו משתמשים בגישות משלימות כדי לנטר את קיפול החלבונים ותפקודם בבעלי חיים שלמים, בתאים ספציפיים ובתמריתי חלבון. בחירה מושכלת של חיישן קיפול, המבוססת על פנוטיפים התנהגותיים ותאיים חזקים הקשורים למוטציה דסטביליזבית ידועה, יכולה לשמש לאחר מכן לניטור שינויים בסביבת קיפול החלבון. דוגמה לחלבון מוטנטי אנדוגני רגיש לטמפרטורה היא המוטציה L799F בחלבון פילמנט השריר העבה, פאראמיוזין...

כדי לחקור את הקשר בין הומאוסטזיס חלבון, מתח והזדקנות, עקבנו אחר שינויים בקיפול החלבון על ידי מעקב אחר תפקוד לקוי של חלבון, לוקליזציה של חלבון בתא ויציבות החלבון ברמת האורגניזם, התא והחלבון, תוך שימוש במטזואן Caenorhabditis elegans הניתן לטיפול גנטי כמערכת מודל.

שימוש ב-Caenorhabditis elegans כמערכת מודל לחקר הומאוסטזיס חלבון באורגניזם רב-תאי

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

המטרה הכוללת של הניסויים הבאים באלגנטיות CENO R הניתנת למעקב גנטי היא לנטר קיפול שגוי של חלבון בשלוש רמות, האורגניזם, התאים והחלבונים. פנוטיפים התנהגותיים כגון תנועתיות או התנגדות תרמית, מתפקדים כקריאות של שינויים בהומאוסטזיס חלבון ברמה האורגניזמית, רגישים לטמפרטורה או מתרחשים באופן טבעי. חלבונים יציבים מטא משמשים למעקב אחר מיקום שגוי של חלבון, שיכול להיות קשור לקיפול שגוי של חלבון.בדיקת עיכול חלקי ex vivo עוקבת אחר יציבות החלבון ישירות. התוצאות יכולות להראות שינויים ביכולת הפרוטאוסטזיס בטמפרטורות גידול שונות בהתבסס על בדיקת ההתנגדות התרמו, מיקרוסקופיה אימונופלואורסצנטית וניתוח דם מערבי. נהלים אלה יודגמו על ידי סטודנטים לתארים מתקדמים במעבדה שלי.הבדיקה ההתנהגותית תודגם על ידי איש עידו ושי ידגים את הצביעה החיסונית ו-ANA flunking ו-sheron ידגימו את העיכול החלקי. פרוטוקול זה למדידת סבילות לטמפרטורה מלווה בשלבי הכנה לסנכרון בעלי החיים ובדיקת תנועה. שניהם מתוארים בפרוטוקול הטקסט מתחילים באיסוף שכפולים המכילים לפחות 20 בעלי חיים מסונכרנים.ב-24, בארות ששיחקו היטב המכילות 450 מיקרוליטר של מאגר הלם חום. הוסיפו לכל באר תשעה מיקרוליטרים של ציטוקסין. כעת העבירו את הצלחת לאמבטיה מחוממת.הלם החום, הטמפרטורה ומשך הזמן תלויים מאוד בתנאי הגידול. בפרט, טמפרטורת הגידול מדרגת את הישרדות החיה על ידי ניטור ספיגת הקוביות שלה. באמצעות סטריאוסקופ פלואורסצנטי עם מסנן TXR, החיות שתופסות את הקובייה מתות.היתרון העיקרי של טכניקה זו של שיטות קיימות כמו קין, הסובלנות על ידי ניקוד ידני הוא השימוש בקריאה חזותית של תמותת בעלי חיים, מה שהופך את החיבור הזה להרבה יותר מהיר וניתן לשחזור. בשלב הנדרש, העבירו לפחות 30 בעלי חיים לתוך צינור מיקרו צנטריפוגה המכיל מאגר M nine. שטפו את החיות כמה פעמים עם M 9 על ידי ביצוע צעדי צנטריפוגה קצרים במהירות נמוכה ו-Resus השעיית אותם ב-M 9.לאחר מכן הניחו את הצינורות על קרח למשך מספר דקות להתקררות. לאחר שהתקרר, הסר את עודפי הנוזלים ודגר את הצינורות. ב -500 מיקרוליטר קר כקרח, 4% אלדהיד PARAFORM.יש לכייל את זמן הדגירה עבור כל חלבון שנבדק וצריך להיות בסביבות חמש עד 30 דקות בטמפרטורת החדר. כעת, שטפו את בעלי החיים הקבועים שלוש פעמים עם PBS tween ב-pH 7.2 על ידי צנטריפוגה. צנטריפוגות מבוצעות תמיד ב-3000 סל"ד למשך דקה או שתיים, אלא אם צוין אחרת.במכסה המנוע, הסר את רוב הסופרנטנט והשהה מחדש את הגלולה במיליליטר אחד של תמיסת מרקפטואתנול קרן. לאחר מכן דגרו על החיות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה עם נדנוד עדין למחרת במכסה המנוע. שטפו את בעלי החיים שלוש פעמים עם PBST על ידי צנטריפוגה ו-Resus.סיים את הכביסה עם 50 עד 100 מיקרוליטר PBST והסר את רוב ה-PBST הזה לאחר צנטריפוגה נוספת. לאחר מכן, הוסיפו 100 עד 150 מיקרוליטר של תמיסת קולגנאז ודגרו על בעלי החיים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בתסיסה חזקה. השתמש במיקסר תרמו או בחממה רועדת.לאחר חמש דקות, התחל לבצע בדיקות תקופתיות תחת מיקרוסקופ סטריאו. כאשר חמישית מבעלי החיים נשברים, עצרו את התגובה על ידי הנחת הצינור על קרח. שלב זה רגיש ביותר.משך הטיפול תלוי בתנאי הקיבוע, ויכול להשתנות מאוד בין הזנים. דגירה ממושכת עלולה לגרום להשפלה מוחלטת של בעלי החיים. יש לכייל את התנאים לפני כל אצווה של אנזים ולעקוב בקפידה אחר הפירוק.לאחר מכן, שטפו את בעלי החיים פעמיים ב- PBST. אוספים את החיות על ידי צנטריפוגה ומסירים את רוב ה-PBST. לאחר מכן מוסיפים מיליליטר אחד של תמיסת BA ואחריה דגירה עם נדנוד עדין למשך שעה בטמפרטורת החדר, אוספים את החיות על ידי צנטריפוגה ומשעות אותן מחדש ב-200 מיקרוליטר של b, A.כעת מוסיפים את הנוגדן הראשוני ומתחילים דגירה של לילה עם נדנוד עדין בטמפרטורת החדר.פרמטרים אלה אכן צריכים להיות מכוילים. לאחר מכן, שטפו את בעלי החיים באמצעות צנטריפוגה. השעו אותם מחדש במיליליטר של b, A ודגרו אותם בערבוב עדין למשך 15 דקות עד שעה בטמפרטורת החדר.בשלב זה ניתן להוסיף תוספת אופציונלית של צבע פלורסנט. לאחר מכן, חזור על שטיפת חיץ BA שלוש פעמים נוספות וסיים את השטיפות על ידי השעיית Resus ב-100 מיקרוליטר של BA עם הנוגדן המשני המתאים המתויג פלואורסצנטי בדילול של 1 עד 100. דגרו את הדגימות עם נדנוד במשך מספר שעות בטמפרטורת החדר מוגנת מאור כדי לנקות את המשני.בצע שלוש שטיפות עם a, b, a. לאחר מכן הרכיבו בעלי חיים על שקופיות על ידי Resus תחילה, תלו אותם ב-10 מיקרוליטר של b, a, ולאחר מכן השתמשו בפיפטה עם קדח רחב כדי להעביר מיקרוליטר אחד או שניים מהדגימה לכל שקופית, הוסיפו נפח שווה של אמצעי הרכבה וכסו את השקופית. אטום בעדינות את השקופית עם לק.ניתן לאחסן את השקופיות בטמפרטורה שלילית של 20 מעלות צלזיוס לתקופות ממושכות. בדרך כלל, אנשים חדשים בפרוטוקול זה יתקשו מכיוון שהפרוטוקול ארוך וכולל שלבים רבים שיכולים להשפיע על יעילותו ולהקשות על פתרון בעיות. התחל באיסוף החיות מלוחות של כ-1560 מילימטר למיליליטר אחד או שניים של מאגר M nine.אסור לצפוף את בעלי החיים. שטפו את החיות כמה פעמים עם חיץ M 9 על ידי צנטריפוגה והחייאה, השעיית החיות. לאחר הסיבוב האחרון, החייאה השעתה את החיות ב-100 מיקרוליטר של מאגר M nine.לאחר מכן הקפיא את בעלי החיים ובעזרת עלי צונן וקדח, טוחן את הדגימה בעודו על קרח. מושהה לעתים קרובות כדי לבדוק אם בעלי החיים טחונים מספיק. לאחר שבעלי החיים נמעכים במלואם, העריכו את נפח תמצית התולעת.לאחר מכן הוסף נפח שווה של שתי תמיסות ליזה של תולעת x ודגר את הדגימה על קרח למשך 15 דקות. לאחר מכן, הסר את הפסולת על ידי מחזור צנטריפוגה מקורר והעביר את הסופרנטנט לצינור מיקרו פוגה נקי. לאחר בדיקת ברדפורד יש לדלל את הדגימה לשלושה עד 3.5 מיליגרם חלבון למיליליטר.לאחר מכן מוסיפים תמיסת טריפסין הסוואה צוננת טרייה שהוכנה ביחס של אחד ל -1200. בשלב זה, הגדר את הדגימה לדגירה למשך שעה. במהלך הדגירה, קח מעת לעת 20 מיקרוליטר אליקוטים וערבב אותם מיד עם מאגר SDS, ולאחר מכן חמש דקות ב-96 מעלות צלזיוס.יש להוציא את הדגימות ולבצע ניתוח דם מערבי כדי לקבוע את היציבות היחסית של החלבון. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לא להוסיף קוקטייל מעכב פרוטאז לדגימת העיכול ובמקום זאת נשמור במהירות את הדגימות על קרח. המוטציה E 781 K ts במלווה השריר ב-45 משפיעה מאוד על קיפול והרכבה של מיוזין ולכן משפיעה על תנועתיות בעלי החיים.כאשר המוטאנטים הללו גודלו בטמפרטורות מעל 20 מעלות צלזיוס, הם היו משותקים לחלוטין, אך לא ב-15 מעלות צלזיוס. כאשר חיות בר שגודלו בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס היו נתונות להלם חום ממושך, רובן שרדו. בעוד שרק 30% שרדו אם העלו את הטמפרטורה ב-15 עד 20 מעלות צלזיוס כדי לנטר את השינויים היעילים בתגובת הלם החום, תנאי הלחץ הבקרה עלו לשיעור הישרדות של 70% עבור חיות בר.בעלי חיים נחשפו למכת חום של 37 מעלות צלזיוס במשך שש שעות. ביום הראשון לבגרות, ההישרדות נבדקה על ידי מבחן ספיגת התפוזים של ציט. חיות מתות מסומנות על ידי חיצים לבנים וחיות חיות על ידי חיצים צהובים.הלוקליזציה של מספר חלבונים מטא-יציבים הודגמה באמצעות נוגדנים ספציפיים. לדוגמה, פרמינים לא ממוקמים במכלולים רב-גבישיים במקום לסרקומר שרירים בתנאים מגבילים. באופן דומה, מיוזין TS יוצר חוטים לא מאורגנים במקום המבנים החוטים המסודרים ביותר בטמפרטורה המגבילה.בעלי חיים המבטאים חלבונים מוטנטיים שונים של TS המתבטאים במשותף עם מיו שלוש. GFP הראה הידרדרות מהירה בארגון חוטי השריר כפי שזוהה על ידי ניטור GFP שינויים באישור המיוזין יכולים לשקף שינויים ביכולת הקיפול של תאי השריר. דפוס הפיצול הפרוטאוליטי של השרשרת הכבדה של המיוזין, המתבטא במשותף עם UNC 45 Ts, מראה מאפיינים מובהקים בהשוואה לפרופיל העיכול של מיוזין מחיות בר התומכות בטענה שקיפול המיוזין מושפע מ-UNC 45.אובדן תפקוד. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי ויסות פרוטאוסטזיס באלגנטיות הים, ניתן ליישם אותה גם במערכות אחרות כגון אורגניזמים מודלים שונים.

using-caenorhabditis-elegans-as-model-system-to-study-protein

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

בסיסי<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; שיטות: סנכרון תצפית

אנו מתארים שיטות ללמוד היבטים של amylopathies...

<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em&gt; מערכת מודל לחקר Amylopathy

אנו מתארים כאן פרוטוקול מתוקן לתרבות בקנה מידה גדולה של ג העוברי elegans תאים. עוברי ג elegans תאים בתרבית במבחנה באמצעות שיטה זו, מופיעים כדי לבדל ולשחזר את הביטוי של גנים באופן ספציפי בתא. טכניקות הדורשות גישה ישירה לתאים או בידוד של סוגי תאים ספציפיים מרקמות האחרות יכולות להיות מיושמות על ג elegans תאים בתרבית.

שיטה לCulturing עוברי<em&gt; ג elegans</em&gt; תאים

כאן, אנו מציגים את תולעים נימיות Caenorhabditis elegans כמודל מארח רב-תכליתי ללמוד אינטראקציה מיקרוביאלי.

נמטודות. Caenorhabditis Elegans - מודל רב תכליתי In Vivo ללמוד אינטראקציות מארח-חיידק

מחקר זה מתאר את המידות הכמותיות של גודל ולוקליזציה, מורפולוגיה שרירים וצורה מיטוכונדרילית ב -C. אלגיה באמצעות כלים זמינים לעיבוד תמונות באופן חופשי. גישה זו מאפשרת לימודים עתידיים ב -C. אלגיה להשוות בין היקף רקמות ושינויים מבניים כתוצאה מוטציות גנטיות.

גישות כמותיים ללימוד מבנים סלולאריים ומורפולוגיה ארגונית בקנבאבדיוטיס

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבידוד פשוט של קבוצות מסוימות של תאים עצביים חיים המבטא חלבון פלורסנט ירוק מקווי האלגניים של הקווים. שיטה זו מאפשרת מגוון של מחקרים vivo ex התמקדו נוירונים ספציפיים ויש לו את היכולת לבודד תאים עבור לטווח קצר יותר culturing.

בידוד אוכלוסיות מסוימות של תא העצב מתוך האלאנים

כאן, אנו מאפיינים את התגובות הסלולר מדגיש התגובה התאית ב-נמטודות C. אלגיה על ידי מדידת ההפעלה של כתבים פלורסנט ההמרה ולומר רגישות ללחץ פיזיולוגי.

מדידות התגובות הפיזיולוגיות של הלחץ בג. אלגיה

ירידה פרוטאוסטלית היא סימן היכר של הזדקנות, להקל על תחילת מחלות ניווניות. אנו מתארים פרוטוקול כדי למדוד באופן כנותב פרוטאוסטזיס בשתי רקמות אלגנים שונים Caenorhabditis באמצעות ביטוי הטרולוגי של פוליגלוטמין חוזר התמזג לכתב פלואורסצנטי. מודל זה מאפשר ניתוח גנטי מהיר של פרוטאוסטזיס.

כימות ירידה פרוטאוסטטית ספציפית לרקמות ב elegans Caenorhabditis

כאן אנו מספקים הוראות לשימוש יעיל ב-SegElegans, מערכת למידה עמוקה שפיתחנו לפילוח אוטומטי של תולעים בודדות בתמונות מיקרוסקופיה רחבות, לשימוש מאוחר יותר בתוכנות ניתוח תמונות כגון ImageJ. אנו מספקים דרכים להשתמש במערכת הן באופן מקוון והן באופן לא מקוון.

ניתוח אוטומטי של תמונות פלואורסצנטיות של C. elegans באמצעות SegElegans

Vibrio cholerae: אורגניזם מודל לחקר פתוגנזה חיידקית - ראיון

חקור הומאוסטזיס חלבון באמצעות Caenorhabditis elegans כמודל רב-תאי. למדו לנטר קיפול לקוי ברמות האורגניזם, התא והחלבון באמצעות מבחני התנהגות ומיקרוסקופיה.

שימוש ב-Caenorhabditis elegans כמערכת מודל לחקר הומאוסטזיס חלבון באורגניזם רב-תאי

גלה סרטונים נוספים