שימוש ב-Caenorhabditis elegans כמערכת מודל לחקר הומאוסטזיס חלבון באורגניזם רב-תאי

המטרה הכוללת של הניסויים הבאים באלגנטיות CENO R הניתנת למעקב גנטי היא לנטר קיפול שגוי של חלבון בשלוש רמות, האורגניזם, התאים והחלבונים. פנוטיפים התנהגותיים כגון תנועתיות או התנגדות תרמית, מתפקדים כקריאות של שינויים בהומאוסטזיס חלבון ברמה האורגניזמית, רגישים לטמפרטורה או מתרחשים באופן טבעי. חלבונים יציבים מטא משמשים למעקב אחר מיקום שגוי של חלבון, שיכול להיות קשור לקיפול שגוי של חלבון.

בדיקת עיכול חלקי ex vivo עוקבת אחר יציבות החלבון ישירות. התוצאות יכולות להראות שינויים ביכולת הפרוטאוסטזיס בטמפרטורות גידול שונות בהתבסס על בדיקת ההתנגדות התרמו, מיקרוסקופיה אימונופלואורסצנטית וניתוח דם מערבי. נהלים אלה יודגמו על ידי סטודנטים לתארים מתקדמים במעבדה שלי.

הבדיקה ההתנהגותית תודגם על ידי איש עידו ושי ידגים את הצביעה החיסונית ו-ANA flunking ו-sheron ידגימו את העיכול החלקי. פרוטוקול זה למדידת סבילות לטמפרטורה מלווה בשלבי הכנה לסנכרון בעלי החיים ובדיקת תנועה. שניהם מתוארים בפרוטוקול הטקסט מתחילים באיסוף שכפולים המכילים לפחות 20 בעלי חיים מסונכרנים.

ב-24, בארות ששיחקו היטב המכילות 450 מיקרוליטר של מאגר הלם חום. הוסיפו לכל באר תשעה מיקרוליטרים של ציטוקסין. כעת העבירו את הצלחת לאמבטיה מחוממת.

הלם החום, הטמפרטורה ומשך הזמן תלויים מאוד בתנאי הגידול. בפרט, טמפרטורת הגידול מדרגת את הישרדות החיה על ידי ניטור ספיגת הקוביות שלה. באמצעות סטריאוסקופ פלואורסצנטי עם מסנן TXR, החיות שתופסות את הקובייה מתות.

היתרון העיקרי של טכניקה זו של שיטות קיימות כמו קין, הסובלנות על ידי ניקוד ידני הוא השימוש בקריאה חזותית של תמותת בעלי חיים, מה שהופך את החיבור הזה להרבה יותר מהיר וניתן לשחזור. בשלב הנדרש, העבירו לפחות 30 בעלי חיים לתוך צינור מיקרו צנטריפוגה המכיל מאגר M nine. שטפו את החיות כמה פעמים עם M 9 על ידי ביצוע צעדי צנטריפוגה קצרים במהירות נמוכה ו-Resus השעיית אותם ב-M 9.

לאחר מכן הניחו את הצינורות על קרח למשך מספר דקות להתקררות. לאחר שהתקרר, הסר את עודפי הנוזלים ודגר את הצינורות. ב -500 מיקרוליטר קר כקרח, 4% אלדהיד PARAFORM.

יש לכייל את זמן הדגירה עבור כל חלבון שנבדק וצריך להיות בסביבות חמש עד 30 דקות בטמפרטורת החדר. כעת, שטפו את בעלי החיים הקבועים שלוש פעמים עם PBS tween ב-pH 7.2 על ידי צנטריפוגה. צנטריפוגות מבוצעות תמיד ב-3000 סל"ד למשך דקה או שתיים, אלא אם צוין אחרת.

במכסה המנוע, הסר את רוב הסופרנטנט והשהה מחדש את הגלולה במיליליטר אחד של תמיסת מרקפטואתנול קרן. לאחר מכן דגרו על החיות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה עם נדנוד עדין למחרת במכסה המנוע. שטפו את בעלי החיים שלוש פעמים עם PBST על ידי צנטריפוגה ו-Resus.

סיים את הכביסה עם 50 עד 100 מיקרוליטר PBST והסר את רוב ה-PBST הזה לאחר צנטריפוגה נוספת. לאחר מכן, הוסיפו 100 עד 150 מיקרוליטר של תמיסת קולגנאז ודגרו על בעלי החיים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בתסיסה חזקה. השתמש במיקסר תרמו או בחממה רועדת.

לאחר חמש דקות, התחל לבצע בדיקות תקופתיות תחת מיקרוסקופ סטריאו. כאשר חמישית מבעלי החיים נשברים, עצרו את התגובה על ידי הנחת הצינור על קרח. שלב זה רגיש ביותר.

משך הטיפול תלוי בתנאי הקיבוע, ויכול להשתנות מאוד בין הזנים. דגירה ממושכת עלולה לגרום להשפלה מוחלטת של בעלי החיים. יש לכייל את התנאים לפני כל אצווה של אנזים ולעקוב בקפידה אחר הפירוק.

לאחר מכן, שטפו את בעלי החיים פעמיים ב- PBST. אוספים את החיות על ידי צנטריפוגה ומסירים את רוב ה-PBST. לאחר מכן מוסיפים מיליליטר אחד של תמיסת BA ואחריה דגירה עם נדנוד עדין למשך שעה בטמפרטורת החדר, אוספים את החיות על ידי צנטריפוגה ומשעות אותן מחדש ב-200 מיקרוליטר של b, A.כעת מוסיפים את הנוגדן הראשוני ומתחילים דגירה של לילה עם נדנוד עדין בטמפרטורת החדר.

פרמטרים אלה אכן צריכים להיות מכוילים. לאחר מכן, שטפו את בעלי החיים באמצעות צנטריפוגה. השעו אותם מחדש במיליליטר של b, A ודגרו אותם בערבוב עדין למשך 15 דקות עד שעה בטמפרטורת החדר.

בשלב זה ניתן להוסיף תוספת אופציונלית של צבע פלורסנט. לאחר מכן, חזור על שטיפת חיץ BA שלוש פעמים נוספות וסיים את השטיפות על ידי השעיית Resus ב-100 מיקרוליטר של BA עם הנוגדן המשני המתאים המתויג פלואורסצנטי בדילול של 1 עד 100. דגרו את הדגימות עם נדנוד במשך מספר שעות בטמפרטורת החדר מוגנת מאור כדי לנקות את המשני.

בצע שלוש שטיפות עם a, b, a. לאחר מכן הרכיבו בעלי חיים על שקופיות על ידי Resus תחילה, תלו אותם ב-10 מיקרוליטר של b, a, ולאחר מכן השתמשו בפיפטה עם קדח רחב כדי להעביר מיקרוליטר אחד או שניים מהדגימה לכל שקופית, הוסיפו נפח שווה של אמצעי הרכבה וכסו את השקופית. אטום בעדינות את השקופית עם לק.

ניתן לאחסן את השקופיות בטמפרטורה שלילית של 20 מעלות צלזיוס לתקופות ממושכות. בדרך כלל, אנשים חדשים בפרוטוקול זה יתקשו מכיוון שהפרוטוקול ארוך וכולל שלבים רבים שיכולים להשפיע על יעילותו ולהקשות על פתרון בעיות. התחל באיסוף החיות מלוחות של כ-1560 מילימטר למיליליטר אחד או שניים של מאגר M nine.

אסור לצפוף את בעלי החיים. שטפו את החיות כמה פעמים עם חיץ M 9 על ידי צנטריפוגה והחייאה, השעיית החיות. לאחר הסיבוב האחרון, החייאה השעתה את החיות ב-100 מיקרוליטר של מאגר M nine.

לאחר מכן הקפיא את בעלי החיים ובעזרת עלי צונן וקדח, טוחן את הדגימה בעודו על קרח. מושהה לעתים קרובות כדי לבדוק אם בעלי החיים טחונים מספיק. לאחר שבעלי החיים נמעכים במלואם, העריכו את נפח תמצית התולעת.

לאחר מכן הוסף נפח שווה של שתי תמיסות ליזה של תולעת x ודגר את הדגימה על קרח למשך 15 דקות. לאחר מכן, הסר את הפסולת על ידי מחזור צנטריפוגה מקורר והעביר את הסופרנטנט לצינור מיקרו פוגה נקי. לאחר בדיקת ברדפורד יש לדלל את הדגימה לשלושה עד 3.5 מיליגרם חלבון למיליליטר.

לאחר מכן מוסיפים תמיסת טריפסין הסוואה צוננת טרייה שהוכנה ביחס של אחד ל -1200. בשלב זה, הגדר את הדגימה לדגירה למשך שעה. במהלך הדגירה, קח מעת לעת 20 מיקרוליטר אליקוטים וערבב אותם מיד עם מאגר SDS, ולאחר מכן חמש דקות ב-96 מעלות צלזיוס.

יש להוציא את הדגימות ולבצע ניתוח דם מערבי כדי לקבוע את היציבות היחסית של החלבון. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לא להוסיף קוקטייל מעכב פרוטאז לדגימת העיכול ובמקום זאת נשמור במהירות את הדגימות על קרח. המוטציה E 781 K ts במלווה השריר ב-45 משפיעה מאוד על קיפול והרכבה של מיוזין ולכן משפיעה על תנועתיות בעלי החיים.

כאשר המוטאנטים הללו גודלו בטמפרטורות מעל 20 מעלות צלזיוס, הם היו משותקים לחלוטין, אך לא ב-15 מעלות צלזיוס. כאשר חיות בר שגודלו בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס היו נתונות להלם חום ממושך, רובן שרדו. בעוד שרק 30% שרדו אם העלו את הטמפרטורה ב-15 עד 20 מעלות צלזיוס כדי לנטר את השינויים היעילים בתגובת הלם החום, תנאי הלחץ הבקרה עלו לשיעור הישרדות של 70% עבור חיות בר.

בעלי חיים נחשפו למכת חום של 37 מעלות צלזיוס במשך שש שעות. ביום הראשון לבגרות, ההישרדות נבדקה על ידי מבחן ספיגת התפוזים של ציט. חיות מתות מסומנות על ידי חיצים לבנים וחיות חיות על ידי חיצים צהובים.

הלוקליזציה של מספר חלבונים מטא-יציבים הודגמה באמצעות נוגדנים ספציפיים. לדוגמה, פרמינים לא ממוקמים במכלולים רב-גבישיים במקום לסרקומר שרירים בתנאים מגבילים. באופן דומה, מיוזין TS יוצר חוטים לא מאורגנים במקום המבנים החוטים המסודרים ביותר בטמפרטורה המגבילה.

בעלי חיים המבטאים חלבונים מוטנטיים שונים של TS המתבטאים במשותף עם מיו שלוש. GFP הראה הידרדרות מהירה בארגון חוטי השריר כפי שזוהה על ידי ניטור GFP שינויים באישור המיוזין יכולים לשקף שינויים ביכולת הקיפול של תאי השריר. דפוס הפיצול הפרוטאוליטי של השרשרת הכבדה של המיוזין, המתבטא במשותף עם UNC 45 Ts, מראה מאפיינים מובהקים בהשוואה לפרופיל העיכול של מיוזין מחיות בר התומכות בטענה שקיפול המיוזין מושפע מ-UNC 45.

אובדן תפקוד. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי ויסות פרוטאוסטזיס באלגנטיות הים, ניתן ליישם אותה גם במערכות אחרות כגון אורגניזמים מודלים שונים.