Name: התפוקה microinjections גבוה של zygotes קיפודי הים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-21T21:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 40 s
Description: למד מיקרו-הזרקה בקצב גבוה בזיגוטות של קיפודי ים לחקר ביולוגיה התפתחותית. שיטה זו מאפשרת ניתוח יעיל של ביטוי RNA וחלבונים בעוברים ותורמת להבנת תפקוד גנים בהתפתחות מוקדמת.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לסנטיאגו סוארז לקריאה ביקורתית של כתב היד ובטי קאוגיל לסיוע בצילום. אנו מודים גם מבקרים האנונימיים על המשוב הביקורתי שלהם. עבודה זו נתמכת על ידי קרן המחקר לאוניברסיטת דלאוור.

1. הכנת protamine סולפט (PS) מצופה צלחות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון 1% מסולפט protamine (PS) על ידי הוספת 0.5 גרם של PS ל50 מיליליטר מים deionized, מזוקקים (DDH 2 O) בצינור חרוטי 50 מיליליטר. לנער היטב במהירות גבוהה על שייקר ספסל בטמפרטורת חדר למשך 1-2 שעות כדי להבטיח פירוק של PS מלא. פתרון זה יכול להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס למשך לפחות 3 חודשים (הקפד לפזר משקע כמו ג&#39;ל לגמרי לפני כל שימוש) 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את השרוול של צלחות פטרי קלקר x 15 מ&quot;מ 60 מ&quot;מ ולהניח את שני מכסים ובתחתית על הספסל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים 1% פתרון נ.ב. בכל מנה (יכולים לשמש גם תחתית ומכסים) רק מספיק כדי לכסות את פני השטח, להשאיר למשך לפחות 2 דקות. פתרון PS השאריות ניתן לעשות שימוש חוזר פעמים רבות תוך 3 חודשים, כאשר הם מאוחסנים ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום שטופלה PS מנות בכוס מלאה במים מזוקקים (DH 2 O). השאר את הכוס תחת זרם DH 2 O לפחות10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתן להשתמש בו מנות מצופים נ.ב. מייד או אוויר יבש לאחסון. לכסות אותם כדי למנוע הצטברות אבק. הם יכולים להיות מאוחסנים בטמפרטורת חדר למשך 1 חודש 3. </li></ol> 2. השג תאי המין של קיפוד ים ולשתק את הביצים על צלחת מצופה נ.ב. לMicroinjection <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קיפודי ים שרצים על ידי טלטול או הזרקת intracoelomic של עד 1 מיליליטר של .0.5% KCl כדי לגרום להתכווצות של שרירים חלקים כדי לשחרר תאי רבייה 3 (איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם בעל החיים הוא גברי, כפי שצוין על ידי הזרע בצבע הלבן, לאסוף יבש זרע מפני שטח של בעלי חיים לתוך צינור 1.5 מיליליטר. זרע יבש יכול להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס במשך שבוע ללא אובדן משמעותי של תפקוד ביולוגי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם בעל החיים הוא נקבה, כפי שצוינה על ידי הצבע הצהוב בשל תוכן חלמון הביצה, לאסוף תאי הרבייה שלה על ידי טבילת gonopores בכוס מלאה במי ים. הביצים תשוחרר מgonopores ולהתיישב על ידי כוח הכבידה. &lt;/ Li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> סנן את הביצים מפסולת כגון עמוד השדרה של בעלי חיים באמצעות 80 מסנן רשת ניילון מיקרומטר. התוצאות הטובות ביותר מושגות אם הביצים נמצאות בשימוש בתוך 5-7 שעות לאחר ההשרצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Dejelly ביצים: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן מי ים חומצי 100 מיליליטר כ 1 מיליליטר של ביצה. השתמש בחומצת לימון 0.5 M כדי להתאים את pH של מי ים מpH 8.0 ל5.1-5.2. נמוך מדי של pH יקטן הפריה וגבוהה מדי של ה-pH לא יאפשר ביצים לצרף צלחות נ.ב. מצופים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיף את הביצים (יותר מ 1 מיליליטר לא) למים ים חומצי ולאפשר את הביצים להתיישב על קרח דק 10. לחלופין, הסרת מעיל הריבה ניתן להקל על ידי מתערבל עדין של הביצים בזמן הטיפול. אחד יכול למעשה dejelly ביצי purpuratus ס ב3-4 דק &#39;בדרך זו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצק בזהירות את מים לים חומצי, מוסיף מים ים טריים ולתת את הביצים להתיישב על קרח שוב. ניתן לאחסן ביצי Dejellied על קרח לתקופה של עד 6 שעות ללא בעיות הפריה </li></ol></li&gt; </ol> 3. בשורה הביצים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 1 פתרון M המניה של 3-aminotriazole (3-AT, MW = 84.08) על ידי המסת 0.84 גרם של 3-AT ב10 מיליליטר של DDH 2 O. פתרון זה יכול להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס למשך עד 6 חודשים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 1 פתרון עובד מ&quot;מ של 3-AT ידי הוספת 50 μl של פתרון M המניה 1 50 מיליליטר של מי ים prechilled. שמור את הפתרון על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הפה פיפטה (איור 3) לטיפול עדין של הביצים: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קצה פיפטה הוא משך באופן ידני מmicropipettes הזכוכית (100 x OD 1.09 מ&quot;מ). החזק את micropipette בשתי הידיים מעל הלהבה הפתוחה. כזכוכית מתחילה להתמוסס, למשוך בזהירות את הקצוות של פיפטה בכיוונים מנוגדים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את אחד משך את פיפטה לצינורות פלסטיק (מ&quot;מ 1.14 ID), חותם חזק עם Parafilm. אורכו של הצינור צריך להיות כ 50-70 סנטימטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס קצה P20 או P200 מסונן סטרילי בסוף ההפך הצינור לצינור הזכוכית כדילשמש כחתיכת הפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קליפ סוף micropipette הזכוכית עם מספריים כדי להתאים את הקוטר של הקצה. הקוטר האופטימלי מעט עולה על הקוטר של הביצה (80 מיקרומטר). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים 4 מיליליטר של מ&quot;מ המים ים 3-AT 1 לכל מנה מצופה PS (תחתון או מכסה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את פיפטה בפה, לשים את קצה P20/P200 בפה ולאבטח אותו עם השיניים. כדי לשאוב את הביצים, לשאוב ראשון כמות קטנה של מי ים. על ידי בעל טור של נוזל לפני טעינת הביצים, תהיה אחד שליטה מקסימלי על טכניקת pipetting פה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם את קצה micropipette ליד הביצים ולשאוב בעדינות בכמה מאות ביצים בפיפטה. להגביל את הביצים בתוך micropipette הזכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שורת dejellied ביצים בקו ישר על צלחת בעדינות על ידי נושבת אותם מחוץ לפיפטה הפה תוך כדי התנועה את הקצה בקו ישר. בשורה הביצים ממש לפני הזריקות, בגלל בעיות הפריה עלולות להתרחש בשל prolonged חשיפה למים ים 3-AT 3. יתר על כן, דבקי קטיוני כמו PS יכולים להיות רעילים לביצים, וזה לא מומלץ לחשוף את העוברים לריאגנטים אלה לתקופות ארוכות, במיוחד אם את מעטפות ההפריה הוסרו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך שריטה על הצלחת ליד הקו של ביצים חתרו באמצעות פיפטה מזכוכית. שריטה זה תהיה חשוב כדי לשבור את מחט הזריקה כדי להתאים את הזרימה של פתרון בהתאם לצורך. לחלופין, השריטות יכולות להתבצע לפני מזיגת מים לים 3-AT למנה. </li></ol> 4. Microinjection של zygotes קיפודי הים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל תחנת microinjection. כאן אנו מתארים את השימוש במערכת הזרקת Femtojet. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוך נימי הזרקה באמצעות חולץ מחט. דוגמא של מחט טובה מתוארת באיור 4. הערה: לקבלת זריקות RNA, צריכים להיות pretreated נימי הזרקה כדי למנוע זיהום RNAase יום 31: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח נימי הזרקה לתוך 50 חרוטי מיליליטרצינורות ולהוסיף 50 מיליליטר של מסונן מתנול / HCl (09:01). לנער היטב ולהשאיר למשך הלילה לא יותר מ10 שעה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים את מתנול / HCl ולשטוף את הנימים 2x עם מתנול המסונן באותו הצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסננים מתנול ככל האפשר וLyophilize נימי לילה על מנת להבטיח הסרת מלאה מתנול. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר בזהירות את נימי מחט על בעל טעינת מחט ולטעון אותו עם &lt;0.5 μl של פתרון מדגם באמצעות טיפים microloader. פתרונות לדוגמא בדרך כלל מכילים גליצרול 20%, תלוי בחומר המוזרק 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצלחת עם ביצים חתרו על הבמה מיקרוסקופ (צריכים להיות מיושרות ביצים אנכית כאשר נצפים מבעד עיניות) ולהתמקד בביצים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר בזהירות את המחט הועמסה על בעל microinjecting המחט ולהתאים את המיקום של המחט ליש קצה בצורה מושלמת ממוקד באמצע השדה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ללחוץ על הלחצן כדי להחיל את הלחץ המקסימאלי עבורr ניקוי מחט. פתרון צריך לבוא מתוך המחט. התאם את הלחץ במידת צורך: לחץ הזרקה צריך להיות בטווח של 90-360 hPa, עם לחץ הפיצוי על כ 1/3 מלחץ ההזרקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתאים את זרימת הפתרון על ידי הזרקה לתוך ביצית מופרה. באמצעות micromanipulator ג&#39;ויסטיק, לכוון את קצה המחט להזרקה לביצית מופרה. כדי להקל על כניסת מחט, ליצור רעידות קלות על ידי הקשה עדינה של הבמה עם חפץ קשה כגון מברג. בולוס הזרקה להרכיב בתוך הביצה יש לראות (איור 5). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם בולוס ההזרקה אינו גלוי, מעט להעלות את קצה המחט מעל הביצים, לאתר את השריטה על הצלחת ולהתאים אותו להיות ממוקם באמצע השדה. לטפוח בעדינות את קצה המחט לסימן השריטה לשבור את קצה מחט הזריקה. התאם את לחצי הזרקה ופיצוי על מנת להבטיח כי בולוס ההזרקה אינו עולה על 1/5 של tהוא הקוטר של הביצה (1-2 בערב). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שבולוס ההזרקה מכויל, להפרות את הביצים על ידי הוספת זרע מדולל (1:1,000) או 1-2 μl של זרע. מערבבים היטב בזהירות כדי למנוע פירוק השורה של ביצים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתחיל זריקות מייד לאחר מעטפת ההפריה הופכת לגלויה (איור 5). תנוע לאורך הקו של ביצים חתרו שימוש בבקר הבמה ולהזריק zygotes רבים ככל האפשר על ידי תוקע אותם עם המחט נשלטת על ידי micromanipulator ג&#39;ויסטיק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי 10-15 דקות, הביצים המופרות החדש תהפוך קשוחות ולא ניתן להזריק יותר. מוציא את המאפה מהבמה ובזהירות לשאוב את הזרע במי ים 3-AT באמצעות פיפטה פסטר מפלסטיק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אל תתנו zygotes יבש. להוסיף במהירות במי ים prechilled טריים כדי לכסות את המנה. דגירה את העוברים ב15 ° C. </li></ol>

<ol><li>Muramatsu, T., Mizutani, Y., Ohmori, Y., Okumura, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+three+nonviral+transfection+methods+for+foreign+gene+expression+in+early+chicken+embryos+in+ovo%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Comparison of three nonviral transfection methods for foreign gene expression in early chicken embryos in ovo.</a> Biochem. Biophys.Res. Commun. 230, 376-380 (1997).</li>
<li>Peng, H., Wu, Y. Y., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+Delivery+of+DNA+and+Morpholinos+into+Mouse+Preimplantation+Embryos+by+Electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Efficient Delivery of DNA and Morpholinos into Mouse Preimplantation Embryos by Electroporation.</a> Plos One. 7, 13 (2012).</li>
<li>Ettensohn, C. A., Wray, G. A., Wessel, G. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aEttensohn%2C+CA+%22eds.+Development+of+sea+urchins%2C+ascidians%2C+and+other+invertebrate+deuterostomes%3A+experimental+approaches%22">eds. Development of sea urchins, ascidians, and other invertebrate deuterostomes: experimental approaches</a>. 74, Elsevier Academic Press. (2004).</li>
<li>Franks, R. R., Houghevans, B. R., Britten, R. J., Davidson, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+introduction+of+cloned+DNA+into+the+sea+urchin+zygote+nucleus%2C+and+fate+of+injected+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Direct introduction of cloned DNA into the sea urchin zygote nucleus, and fate of injected DNA.</a> Development. 102, 287-299 (1988).</li>
<li>Kinsey, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+signaling+pathways+in+zebrafish+development+by+microinjection%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of signaling pathways in zebrafish development by microinjection.</a> Methods Mol. Biol. 518, 67-76 (2009).</li>
<li>Kola, I., Sumarsono, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+in+vitro+transcribed+RNA+and+antisense+oligonucleotides+in+mouse+oocytes+and+early+embryos+to+study+the+gain-+and+loss-of-function+of+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Microinjection of in vitro transcribed RNA and antisense oligonucleotides in mouse oocytes and early embryos to study the gain- and loss-of-function of genes.</a> Mol. Biotechnol. 6, 191-199 (1996).</li>
<li>Mishina, T., Fuchimukai, K., Igarashi, K., Tashiro, K., Shiokawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modification+of+secondary+head-forming+activity+of+microinjected+a+dagger+beta-catenin+mRNA+by+co-injected+spermine+and+spermidine+in+Xenopus+early+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Amino+Acids%22%5BJournal%5D)">Modification of secondary head-forming activity of microinjected a dagger beta-catenin mRNA by co-injected spermine and spermidine in Xenopus early embryos.</a> Amino Acids. 42, 791-801 (2012).</li>
<li>O'Meara, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+silencing+in+bovine+zygotes%3A+siRNA+transfection+versus+microinjection%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod.+Fertil.+Dev%22%5BJournal%5D)">Gene silencing in bovine zygotes: siRNA transfection versus microinjection.</a> Reprod. Fertil. Dev. 23, 534-543 (2011).</li>
<li>Dean, D. A., Gasiorowski, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonviral+gene+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Nonviral gene delivery.</a> Cold Spring Harb. Protoc. , (2011).</li>
<li>Hiramoto, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+division+without+mitotic+apparatus+in+sea+urchin+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Cell division without mitotic apparatus in sea urchin eggs.</a> Exp. Cell Res. 11, 630-636 (1956).</li>
<li>Wilson, L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWilson%2C+L+%22Methods+in+Cell+Biology%22">Methods in Cell Biology</a>. 25, Elsevier. (1982).</li>
<li>Gross, J. M., McClay, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+Brachyury+%28T%29+during+gastrulation+movements+in+the+sea+urchin+Lytechinus+variegatus%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">The role of Brachyury (T) during gastrulation movements in the sea urchin Lytechinus variegatus.</a> Dev. Biol. 239, 132-147 (2001).</li>
<li>Yajima M, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autonomy+in+specification+of+primordial+germ+cells+and+their+passive+translocation+in+the+sea+urchin%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Autonomy in specification of primordial germ cells and their passive translocation in the sea urchin.</a> Development. 139, 3786-3794 (2012).</li>
<li>Duboc, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nodal+and+BMP2%2F4+pattern+the+mesoderm+and+endoderm+during+development+of+the+sea+urchin+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Nodal and BMP2/4 pattern the mesoderm and endoderm during development of the sea urchin embryo.</a> Development. 137, 223-235 (2010).</li>
<li>Ernst, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Offerings+from+an+Urchin%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Offerings from an Urchin.</a> Dev. Biol. 358, 285-294 (2011).</li>
<li>McClay, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+crossroads+in+developmental+biology%3A+sea+urchins%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Evolutionary crossroads in developmental biology: sea urchins.</a> Development. 138, 2639-2648 (2011).</li>
<li>Sodergren, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Research+article+-+The+genome+of+the+sea+urchin+Strongylocentrotus+purpuratus%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Research article - The genome of the sea urchin Strongylocentrotus purpuratus.</a> Science. 314, 941-952 (2006).</li>
<li>Roux, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functional+genomic+and+proteomic+perspective+of+sea+urchin+calcium+signaling+and+egg+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">A functional genomic and proteomic perspective of sea urchin calcium signaling and egg activation.</a> Dev. Biol. 300, 416-433 (2006).</li>
<li>Turner, P. R., Sheetz, M. P., Jaffe, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fertilization+increases+the+polyphosphoinositide+content+of+sea+urchin+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Fertilization increases the polyphosphoinositide content of sea urchin eggs.</a> Nature. 310, 414-415 (1984).</li>
<li>Voronina, E., Marzluff, W. F., Wessel, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclin+B+synthesis+is+required+for+sea+urchin+oocyte+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Cyclin B synthesis is required for sea urchin oocyte maturation.</a> Dev. Biol. 256, 258-275 (2003).</li>
<li>Wong, J. L., Wessel, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+modifications+at+fertilization%3A+regulation+of+dityrosine+crosslinking+by+transamidation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix modifications at fertilization: regulation of dityrosine crosslinking by transamidation.</a> Development. 136, 1835-1847 (2009).</li>
<li>Shuster, C. B., Burgess, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transitions+regulating+the+timing+of+cytokinesis+in+embryonic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Transitions regulating the timing of cytokinesis in embryonic cells.</a> Curr. Biol. 12, 854-858 (2002).</li>
<li>Morris, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+cytoskeletal+and+motility+proteins+in+the+sea+urchin+genome+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of cytoskeletal and motility proteins in the sea urchin genome assembly.</a> Dev. Biol. 300, 219-237 (2006).</li>
<li>Minc, N., Burgess, D., Chang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+Cell+Geometry+on+Division-Plane+Positioning%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Influence of Cell Geometry on Division-Plane Positioning.</a> Cell. 144, 414-426 (2011).</li>
<li>Davidson, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genomic+regulatory+network+for+development%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A genomic regulatory network for development.</a> Science. 295, 1669-1678 (2002).</li>
<li>Oliveri, P., Tu, Q., Davidson, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+regulatory+logic+for+specification+of+an+embryonic+cell+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Global regulatory logic for specification of an embryonic cell lineage.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 5955-5962 (2008).</li>
<li>Peter, I. S., Davidson, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gene+regulatory+network+controlling+the+embryonic+specification+of+endoderm%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A gene regulatory network controlling the embryonic specification of endoderm.</a> Nature. 474, (2011).</li>
<li>Nam, J. M., Dong, P., Tarpine, R., Istrail, S., Davidson, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+cis-regulatory+genomics+for+systems+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Functional cis-regulatory genomics for systems biology.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 3930-3935 (2010).</li>
<li>Showman, R. M., Foerder, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Removal+of+the+fertilization+membrane+of+sea-urchin+embryos+employing+aminotriazole%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Removal of the fertilization membrane of sea-urchin embryos employing aminotriazole.</a> Exp. Cell Res. 120, 253-255 (1979).</li>
<li>Lepage, T., Sardet, C., Gache, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+expression+of+the+hatching+enzyme+gene+in+the+sea-urchin+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Spatial expression of the hatching enzyme gene in the sea-urchin embryo.</a> Dev. Biol. 150, 23-32 (1992).</li>
<li>Jaffe, L. A., Terasaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+microinjection+of+oocytes%2C+eggs%2C+and+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Development+of+Sea+Urchins%2C+Ascidians%2C+and+Other+Invertebrate+Deuterostomes%3A+Experimental+Approaches%22%5BJournal%5D)">Quantitative microinjection of oocytes, eggs, and embryos.</a> Development of Sea Urchins, Ascidians, and Other Invertebrate Deuterostomes: Experimental Approaches. 74, 219-242 (2004).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שום אינטרסים כלכליים מתחרים או סכסוכים אחרים של עניין.

Microinjection הוא טכניקה רבת עוצמה להעברת טיפולים שונים כגון DNA, mRNA, חלבונים רקומביננטיים, אובדן התפקוד ורווח של חומרים כימיים פונקציה, צבעים ושילובים שלהם לביציות, עובר, ותאים של אורגניזמים שונים 1-7. עם זאת, צריכים להיות כל הזמן כמה שיקולים בחשבון בעת ​​תכנון ניסוי microinjection. זה חשוב מאוד לקחת בחשבון את המסיסות של הטיפול נמסר ואת עוצמת הזריקה. אם פתרון microinjected נוטה ליצור אפילו משקע קל,...

משלוח טיפול יעיל לשחזור הוא אחד האתגרים מתודולוגיים העיקריים לחוקרים. מספר שיטות הוקמו כדי לספק transiently פתרונות טיפול לביצים, עוברים, ותאים. שיטות אלה כוללות electroporation (המבוסס על הנקבוביות חולפות הניבו בקרום באמצעות פולסים חשמליים קצרים) 1,2, lipofection (משלוח באמצעות השילוב של יפוזומים המכיל טיפול עם הקרום) 1, הפגזת microparticle 1 (DNA הוא זירז במיקרון חלקיקים בגודל מתכת המשמשים לאחר מכן לחדור לתאים במהירות גבוהה), ותמרה (וירוס משמש ככלי מסירה של transgenes). כרגע, microinjection הוא הגישה היחידה שמחזיקה את היתרון של מתן כל פתרון עם יעילות 100% עם ריאגנטים מינימאליים. יתר על כן, פתרון זריקה אחת יכול להיות מורכב מקוקטייל מורכב של טיפולים. טכניקה זו נעשתה שימוש כדי להצליחly microinject הביצים ועוברים ממספר רב של מינים כמו קיפודי ים 3,4, דגי זברה 5, עכבר 6, צפרדע 7, ובקר 8, כמו גם תאים בודדים בתרבית רקמת 9. זריקות לסטומרים יחיד בשלבי התפתחותיים מאוחרים יותר גם נערכו 10-12. השיטות הנוכחיות של microinjections מבוססות על שיטת לחץ ההזרקה שהיה בתחילה שתוארה על ידי Hiramoto 10, עם זאת, התקדמות רבה נעשתה לקראת אופטימיזציה של התהליך הזה. טכניקות microinjection מצוינות כבר תיארו במקום אחר 11, וכאן אנו מתארים באחת מהשיטות הספציפיות המשמשת כיום לmicroinject קיפודי ים (purpuratus Strongylocentrotus) ביצים מופרות חדש. במשך יותר ממאה, קיפודי ים היו 15,16 מודל ניסיון יקר ערך. קיפודי ים קשורים באופן הדוק לאבולוציונית chordates (כולל אותנו) וניתוח שלהגנום שלהם גילה כי הם מכילים את כל משפחות גנים גדולות כ17 האנושיים. הם מייצרים מספר גדול של סינכרוני פיתוח עוברים שקופים שניתן להשפיע בקלות. השימוש בקיפוד ים כאורגניזם מודל, קהילת קיפודי הים תרמה להבנתנו את תהליך ההפריה 18-21, תהליכים ביולוגיים תא 22-24, ורשתות גנים רגולטוריים (GRNs) 25-28. Microinjection לzygotes קיפודי הים דורש מספר שלבים. ראשית, את הביצים צריכה להיות משותקת לפני זריקות (שיפורט להלן). מנות Microinjection הם מצופים סולפט protamine (PS), אשר יוצר משטח חיובי טיעונים שלביצים טעונות השלילי יכולה לדבוק 3. הביצים dejellied על ידי דגירה במי ים חומצי (pH 5.15) עבור 10 דקות, ואחרי שתי שטיפות במי ים טבעיים או מים מלאכותיים ים (pH 8.0). ביצי dejellied הם חתרו בזהירות בקו ישרבאמצע הצלחת מצופה נ.ב. בנוכחות 1 מ&quot;מ 3-aminotriazole (3-AT), אשר נדרש כדי לעכב את הפעילות של ovoperoxidase שמופרש מהגרגרים בקליפת המוח של הביצה כתוצאה מההפריה 29. שלב זה חשוב כדי למנוע התקשות של מעטפת ההפריה וכדי להקל על כניסת מחט microinjection. כחלופה ל1 מ&quot;מ 3-AT, חומצת 10 מ&quot;מ paraminobenzoic (PABA) יכולה לשמש. פתרון ההזרקה הוא נטען לתוך מחט microinjection באמצעות פיפטה קצה microloading מיוחד ורכוב על בעל המצורף לmicromanipulator ויחידת לחץ (איור 1). כל מחט יכולה לשמש כדי microinject zygotes הבודד בניסויים מרובים בימים נפרדים. Microinjection יכול להתבצע ל10-15 דקות, עד zygotes להתקשות. אז zygotes נשטפים עם מי הים ותרבותי ב15 ° C. כאשר העוברים להגיע בקיעת blastula במה, הם משחררים אנזים בקיעה שמעכל רכיבים של ferמעטפת tilization 30 ולאפשר להם להתנתק באופן טבעי מהצלחת המצופה PS. במידת צורך, את העוברים ניתן עדינות מנותקת מהצלחת בעזרת פיפטה פה או פיפטה פסטר בעדינות על ידי נושבת מי ים על העוברים. השיטה המתוארת מאפשרת microinjection יעיל ואמין של 100-400 ביצים מופרות חדש על צלחת אחת, ומספקת שיטת תפוקה גבוהה עבור ניתוחים במורד הזרם.

<table><tbody><tr><td>פיפטות פסטר זכוכית</td><td>VWR</td><td>14673-043</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ הפוך&nbsp; אקסיובר 40 & deg; C</td><td>Zeiss</td><td>4109431007990000</td><td>מיקרוסקופ הזרקה</td></tr><tr><td>טיפים מיקרו-מטען</td><td>Eppendorf</td><td>5242 956.003</td><td>תמיסת הזרקת עומס</td></tr><tr><td>רשת מסנן ניילון 80&nbsp; &mu; m</td><td>Amazon.com</td><td>03-80-37</td><td>סינון ביצים כדי להיפטר מפסולת</td></tr><tr><td>P20 או P200 טיפים לצנרת מחסום אירוסול</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>02707432 או 02707430</td><td>חלק מפיפטה בפה</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Fisher Scientific</td><td>13 374 12</td><td>חלק מפיפטה פה</td></tr> צינורות <tr><td>פוליאתילן</td><td>Intramedic</td><td>PE-160</td><td>חלק מפיפטה פה</td></tr><tr><td>פרוטמין סולפט</td><td>MP Biomedicals, LLC</td><td>194729</td><td>הצמדת ביצים לכלי הזרקה</td></tr><tr><td>קיפודי ים S. purpuratus</td><td>Pt. Loma Marine Invertebrate Lab</td><td>N/A</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>מי ים</td><td>בכל חנות לחיות מחמד</td><td>Instant Ocean</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>סטרילי 60 מ"מ x 15 מ"מ פוליסטירן פטרי צלחת פישר</td><td>סיינטיפיק</td><td>0875713A</td><td>כלי הזרקה</td></tr><tr><td>תלת צירים גס מיקום מיקרומניפולטור MMN-1</td><td>Narishige</td><td>9124</td><td>מניפולציה מחט הזרקה</td></tr><tr><td>תלת צירית סוג ג'ויסטיק שמן הידראולי עדין מיקרומניפולטור MMO-202ND</td><td>Narishige</td><td>9212</td><td>מניפולציה מחט הזרקה</td></tr><tr><td>העברת פיפטות</td><td>פישר מדעי</td><td>13-711-9AM</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>אנכי&nbsp; חולץ מחט&nbsp;</td><td>Narishige</td><td>PC-10</td><td>משיכת מחטי הזרקה</td></tr></tbody></table>

התפוקה microinjections גבוה של zygotes קיפודי הים

High Throughput Microinjections of Sea Urchin Zygotes

Microinjection לתוך תאים ועוברים הוא טכניקה נפוצה המשמשת ללמוד מגוון רחב של תהליכים ביולוגיים. בשיטה זו כמות קטנה של פתרון טיפול הוא נטען לתוך מחט microinjection המשמש להזריק פיזי תאים בודדים משותקים או עוברים. למרות הצורך בהכשרה ראשונית לביצוע הליך זה למסירת תפוקה גבוהה, microinjection מציע יעילות מרבית ומשלוח לשחזור של מגוון רחב של פתרונות לטיפול (כולל תערובות מורכבות של דגימות) לתאים, ביצים או עוברים. יישומים לmicroinjections כוללים משלוח של בונה DNA, mRNAs, חלבונים רקומביננטיים, רווח של פונקציה, ואובדן של חומרים כימיים פונקציה. צבע פלואורסצנטי או colorimetric מתווסף לפתרון המוזרק כדי לאפשר הדמיה מיידית של אספקה ​​יעילה, כמו גם כלי לנורמליזציה אמינה של כמות הפתרון נמסר. השיטה המתוארת מאפשרת microinjection של z קיפודי הים 100-400ygotes בתוך 10-15 דקות.

בונה כתב ה-GFP וmCherry היתה במבחנה עיבד וmicroinjected לביצים מופרים שזה עתה. עוברים הודגרו ב15 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות (עד שלב blastula) והדמיה באמצעות מיקרוסקופ Zeiss אובזרוור Z1. הזרקה של מבני כתב לא הביאה לכל ליקויים התפתחותיים (איור 6). לכימות של אותות ניאון, רכישת תמונה בוצעה בהגדלה נמוכה (100X) כדי ללכוד מקסימאלי פיקסלים ניאון (איורים 6D-F). אותות ניאון היו לכמת באמצעות AxioVision 4.8.2.0. סטיות ההתקן לעוצמת אותות ניאון בתוך האו...

Microinjection הוא טכניקה נפוצה בשימוש כדי לספק בונה DNA, mRNAs, אנטיסנס morpholino או טיפולים אחרים לביציות, עובר, ותאים של מינים שונים.

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבצע הזרקות מיקרו בתפוקה גבוהה של זיגוטות קיפודי ים. לשם כך, ההשרצה מושרית בקיפודי הים ונאספים גמטות זכרים ונקבות. לאחר מכן הביצים נעשות באמצעות מי ים חומציים ומשותקות בשורה על צלחות פטרי.לאחר מכן מוסיפים זרע לביציות כדי להפרות אותן והזרקת מיקרו של Mr.N.A הרצוי אובדן תפקוד, ריאגנטים או חלבונים מתבצעת לאחר מיקרו-הזרקה. שלושת מי ה-A T המכילים זרע מוחלפים במי ים מתוקים. ניתן לבחון עוברים אלה על המורפולוגיה שלהם ועל הביטוי הזמני והמרחבי של RNA וחלבונים ספציפיים.היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו אלקטרופורציה, שלמות שפתיים, מיקרו-חלקיקים, הפצצה והתמרה, הוא שהיא מאפשרת אספקת כל פתרון ביעילות של 100% תוך שימוש במינימום ריאגנטים. שיטה זו מאפשרת מיקרו-הזרקה יעילה ואמינה של 100 עד 400 x על צלחת אחת של אלפי X לכל ניסוי, ומספקת שיטת תפוקה גבוהה לניתוח במורד הזרם. לפני ביצוע ניסוי זה, הכינו את כל פתרונות המלאי והציוד הדרושים.עיין במסמך הנלווה למתכונים, יהיה צורך בפיפטה לפה לטיפול עדין בביצים. כדי להכין אחד התחל בהחזקת מיקרו פיפטה מזכוכית בשתי הידיים מעל להבה פתוחה כשהכוס מתחילה להימס, משוך בזהירות את קצות הפיפטה לכיוונים מנוגדים עד שהפיפטה נפרדת לשני חצאים. לאחר מכן, חבר פיפטה אחת משוכה לצינורות פלסטיק באורך 50 עד 70 סנטימטרים.החל פרפורם ליצירת אטימה

high-throughput-microinjections-of-sea-urchin-zygotes

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

Microinjection היא שיטה מבוססת ויעילה החדרת חומרים זרים לתוך עוברי דג הזברה מופרית. כאן, אנו להפגין טכניקה microinjection חזקים לביצוע overexpression mRNA, ואת הגן morpholino oligonucleotide מציאה מחקרים דג הזברה.

Microinjection של mRNA ו oligonucleotides Morpholino antisense עוברי דג הזברה.

וידאו זה מראה כיצד morpholino או mRNA יהיה ניתן להזריק לתוך עוברי דג הזברה בשלב אחד התא כדי להגדיל או להקטין את רמת המוצרים גן מסוים במהלך ההתפתחות הבאים.

Microinjection של עוברי דג הזברה לנתח פונקציה ג&#39;ין

אנו מדגימים את הגישה שלנו למציאת פוטנציאל משפר אלמנטים מן הגנים מוסדר מבחינה התפתחותית והערכה תפקידם דרך transgenesis דג הזברה פסיפס.

דג הזברה פסיפס Transgenesis להערכת רצפים Enhancer

סרטון זה מתאר טכניקה של מיקרו-הזרקה של עוברים כדי להעביר תרכובות לתוך שק החלמון של דג הזברה.

מיקרו-הזרקה עוברית: טכניקה להעברת תרכובת לחלמון דג הזברה

מקור: שי, ג', ואח', סקר וזיהוי מדכאי השתקת RNA מאפקטורים מופרשים של פתוגנים צמחיים. J. Vis. Exp. (2020)סרטון זה מדגים את ההליך להכנת תרבית Agrobacterium tumefaciens על ידי השראת ביטוי גנים של אלימות באמצעות אצטוסירינגון, ולאחר מכן הסרת אנטיביוטיקה באמצעות שטיפה והשעיה מחדש, ליצירת השעיה מוכנה לשינוי להעברת גנים לרקמות הצמח.

מיקרוהזרקה של חיידקים לווריד הזנב של עוברי דגי זברה

שיטות המייצרות עוברי morphant חיוניות ללמוד מנגנוני התפתחות ורשתות רגולציה גן. כוכב הים Patiria miniata הוא מערכת מודל מתעורר ללימודים אלה. כאן אנו מציגים פרוטוקול לקבלת תאי רבייה, בהפקת תרבויות של עוברים, וmicroinjection המהיר של zygotes ממין זה.

שיטה לMicroinjection של Minata Patiria Zygotes

מעקב חיה של אבות רשתית WT בודדים רקע גנטי מובהק מאפשר הערכה של תרומת איתות שאינו אוטונומי התא במהלך הנוירוגנזה. כאן, שילוב של מציאת גן, דור הכימרה באמצעות השתלה העובר בתחום הדמית confocal זמן לשגות vivo נוצל למטרה זו.

In vivo הדמיה של ביטוי מהונדס ג&#39;ין הפרט רשתית אבות ב Chimeric דג הזברה עוברים לחקר השפעות Cell Nonautonomous

Microinjection של דג זברה עוברי וזחלים היא טכניקה חיונית ומאתגרת המשמשים דגמים רבים של דג זברה. כאן, אנו מציגים מגוון רחב של כלים microscale כדי לסייע ייצוב והכיוון של דג זברה הן microinjection והן הדמיה.

Microstructured מכשירי Microinjection אופטימיזציה והדימות של הזחלים דג זברה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לחקור את התכונות המכניות התאיות של תאי זברה עובריים מבודדים בכליאה תלת מימדית עם מדידת כוח ישירה על ידי מלכודת אופטית.

מדידות כוח ישירות של מכניקה תת-תאית בכליאה באמצעות פינצטה אופטית

כדי למודל כיצד אותות דלקתיים משפיעים על התפתחות עצבית באורגניזמים רגישים גנטית, אנו מציגים פרוטוקול להזרקת IL-6 מיקרו לתעלה של הווריד הקרדינלי הנפוץ של זחלי דגי הזברה, המאפשר השראה מבוקרת של דלקת והערכת השפעתו ההתפתחותית בהקשר של קומפלקס טרשת השחפתות (TSC).

מיקרוהזרקה של אינטרלוקין-6 לזרם הדם של זחלי דגי זברה TSC כדי לחקור התנהגויות דמויות הפרעות נוירופסיכיאטריות

למד מיקרו-הזרקה בקצב גבוה בזיגוטות של קיפודי ים לחקר ביולוגיה התפתחותית. שיטה זו מאפשרת ניתוח יעיל של ביטוי RNA וחלבונים בעוברים ותורמת להבנת תפקוד גנים בהתפתחות מוקדמת.

התפוקה microinjections גבוה של zygotes קיפודי הים

גלה סרטונים נוספים