קוולנטיים עקידת BMP-2 על משטחים באמצעות גישה חד שכבתי התאסף עצמית

המטרה הכוללת של הליך זה היא לקשור קוולנטית שתי מולקולות BMP למשטחים מבלי לאבד את הפעילות הביולוגית שלהן. זה מושג על ידי יצירת שכבת זהב על מצע על ידי שקיעת אדים פיזית. השלב השני הוא ליצור שכבה חד-שכבתית בהרכבה עצמית של מקשר NHS Thiol דו-פונקציונלי של ה-NHSA.

לאחר מכן, RH BMP 2 קשור קוולנטית למקשר. השלב האחרון הוא להסיר את ה-BMP הלא קשור שניים על ידי סוניקציה. בסופו של דבר, נעשה שימוש בבדיקת קשירת נוגדנים כדי להראות את הקישור המוצלח של BMP 2 על פני השטח והפעילות הביולוגית של BMP 2 הקשור למשטח נקבעת בתאים על ידי ניתוח זרחון SMA 1 5 8.

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה של גורמי גדילה, כגון אם הקישור הראשוני של גורמי גדילה לקולטנים שלהם על פני התא מספיק כדי לעורר תגובות איתות. המדגימות את ההליך יהיו שתי חברות במעבדה שלי, תרזה פול ואליזבת שוואב. כדי להתחיל בהליך זה, יש לנקות את כיסוי הזכוכית עם מגבונים מדויקים ולהפוך אותם לסוניקציה למשך חמש דקות בתערובת אחד לאחד של אתיל אצטט ומתנול.

לאחר סוניקציה יש לשטוף את המצעים במתנול ולייבש אותם בזרימת חנקן. הניחו את המצעים הנקיים במכשיר ציפוי מקרטע ופנו את החדר. הסר את שכבת תחמוצת הכרום העליונה ממטרת הכרום על ידי התזה למשך 60 שניות.

לאחר מכן מצפים את המצע בשכבת כרום של 10 ננומטר ואחריה ציפוי בשכבת זהב של 40 ננומטר. בסיום, הסר את מצעי הזהב מהתא והניח אותם בצד. העבירו את מצעי הזהב לבקבוק תחתון עגול עם שני צווארים ודגרו אותם במילימולרית אחת M-U-N-H-S ב-DMF בטמפרטורת החדר למשך ארבע שעות תחת אטמוספירת חנקן.

לאחר הדגירה, סוניקציה של המצעים ב-DMF למשך שתי דקות. שטפו אותם עם DMF ומתנול וייבשו אותם בזרימת חנקן. יש לדלל את תמיסת ה-RHB MP Two Stock עם נתרן כלורי מולארי אחד ב-PBS כדי לתת ריכוז סופי של 3.5 מיקרוגרם למיליליטר.

התאם את תמיסת העבודה הזו ל-pH 8.5 עם אשלגן הידרוקסיד סטרילי של 10 מילי-מולרי מיד לפני השימוש. הנח טבעת A-P-D-M-S על גבי הדגימה. העבירו את המצע לצלחת שש בארות כדי להבטיח שרק משטחי המצע חשופים לתמיסת הדגירה.

לאחר מכן דגרו את מצעי ה-M-U-N-H-S הפונקציונליים עם פתרון העבודה RHB MP Two בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה. לאחר הסרת הסופרנטנט הדגירה, הוסף נתרן כלורי מולארי אחד ב-PBS ועשה סוניקציה של המצעים למשך שתי דקות. בסיום, שטפו את המצעים שלוש פעמים עם נתרן כלורי מולארי אחד סטרילי ב-PBS כדי לחסום ספיגה לא ספציפית של נוגדנים.

דגרו את המצעים ב-5% BSA ב-PBS למשך שעה בטמפרטורת החדר. לאחר מכן דגרו את המצעים עם תמיסת נוגדנים נגד BMP למשך שעה בטמפרטורת החדר בסיום, שטפו את המצעים פעמיים עם PBS והפכו אותם לסוניקציה למשך 30 שניות. לאחר מכן, דגרו את המצעים בתמיסת נוגדנים משנית מצומדת HRP למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר ולאחר מכן שטפו אותם פעמיים עם PBS.

השתמש במבחן האדום של שפעת כדי למדוד את הפעילות האנזימטית של HRP ב-570 ננומטר עם זרע קורא צלחות, אחד כפול 10 לפה החמישי, C שני C, 12 מיובלסטים לבאר בשש צלחות באר במצע הגידול ודגירה עליהם למשך 24 שעות ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2. לאחר הוצאת הלוחות מהחממה, שאפו את המדיה מהבארות והרעיבו את התאים ב-DMEM חופשי בסרום במשך שלוש עד חמש שעות לפני הזריעה על ה-BMP הפונקציונלי שני משטחי מצע לחקירת אינדוקציה של איתות לטווח קצר. החלף את המדיום ב-200 מיקרוליטר של DMEM טרי ללא סרום והנח את ה-BMP המשותק שני מצעים מעל התאים באמצעות פינצטה עדינה לאחר הדגירה ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2.

הסר את המצעים בעדינות ושאף את המדיום בעזרת פיפטה. לאחר מכן שטפו את התאים פעמיים עם PBS והמשיכו לניתוח תגובות התאים באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל וכתמים מערביים לניתוח פעילות ביולוגית ארוכת טווח. צלחו את התאים על המשטחים כפי שתואר קודם לכן, ותרבו אותם בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 ב-2% FBS למשך שישה ימים.

לאחר הדגירה. דמו את התאים על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית כדי לאמת RH BMP, שני משטחי קישור המציגים RH BMP משותק, שניים הודגרו עם BMP, שני נוגדנים ספציפיים ונוגדנים משניים מצומדים עם HRP. ה-RH BMP המשותק על פני השטח שניים או I BMP שניים זוהה לפני ואחרי גירוי התאים.

מוצג כאן הקישור המוצלח של RH BMP 2 לפני השטח באישור המוכר על ידי האנטי BMP שני IgG. ה-RH BMP המשותק פני השטח השני כומת באמצעות הבדיקה המטרית של שפעת האמלי והנתונים מראים כי לאחר גירוי התאים, החלבון עדיין זוהה על פני השטח תגובות התאים למשטחים המציגים RHB MP משותק שניים הוערכו והושוו להשפעה של מצעי זהב לא מטופלים. כאן, שני תאי C 12 מגורים למשך 30 דקות על ידי RHB MP שני משטחים פונקציונליים המתקרבים מלמעלה.

במודל זה, BMP 2 מעכב את התמיינות התאים לצינורות מיו מרובי גרעינים וגורם לפנוטיפים של אוסטאובלסטים. ההפעלה של SMAD 1 5 8, שהם מדווחים במורד הזרם של מסלול האיתות BMP 2 מנותחת על ידי כתמים מערביים כפי שמוצג כאן. זרחון SM נצפה לאחר גירוי של 30 דקות על ידי I BMP 2, בעוד שלא מתרחשת זרחון של SMAD 1 58 בתאים שנחשפו לדגימות זהב לא מטופלות.

תוצאה זו מצביעה על כך שתהליך הקיבוע אינו משנה את הפעילות הקצרה של BMP לטווח הקצר ומפעיל שלבים מוקדמים באיתות smad כדי לקבוע אם I BM P 2 משפיע על התמיינות אוסטאוגנית לטווח ארוך. רמת הביטוי של פוספטאז אלקליין נחקרה על ידי מבחן מטרי של צ'ול. פעילות פוספטאז אלקליין של שני תאי C 12 נמדדה לאחר דגירה של התאים במשך שישה ימים על זהב רגיל ועל IBP שני משטחים.

פעילות פוספטאז אלקליין בליזטים של תאים שגודלו על שני משטחים I BM P הראתה ספיגה גבוהה משמעותית בהשוואה לביקורת. תוצאה זו מגלה כי IBMP 2 גורם לביטוי של פוספטאז אלקליין בתאי C 2 C 12 כדי לחקור את ההשפעה של IBP 2. במיוגנזה C שני תאי C 12 צופו ישירות על זהב או על משטחים פונקציונליים ותורבו בתנאי סרום נמוכים.

לאחר שישה ימים בוצעה צביעה של שרשרת כבדה של מיוזין כפי שמוצג כאן. C שני תאי C 12 לא הצליחו ליצור צינורות מיו חיוביים בעלי שרשרת כבדה של מיוזין בנוכחות I BM P 2 בניגוד לתאים על מצעי זהב. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו קיבוע BMP 2 על ננו-חלקיקי זהב כדי לענות על שאלות נוספות.

לדוגמה, כמה BMP 2 משותק דרוש באופן מקומי כדי להפעיל ביעילות תגובות איתות.