Name: קוולנטיים עקידת BMP-2 על משטחים באמצעות גישה חד שכבתי התאסף עצמית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 23 s
Description: למד שיטה לקישור קוולנטי של BMP-2 למשטחים תוך שמירה על פעילות ביולוגית באמצעות שכבה עצמית מתאספת. טכניקה זו מאפשרת חקר אינטראקציות חלבונים ומסלולי סיגנלים בתאים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לפרופ &#39;JP פאץ (מחלקה לכימית Biophysical, אוניברסיטת היידלברג ומחלקת לחומרים חדשים וBiosystems, מכון מקס פלאנק למערכות נבונות, שטוטגרט) לתמיכה מהסוג שלו. התמיכה הכספית ממכון מקס פלנק-Gesellschaft וForschungsgemeinschaft דויטשה (DFG SFB/TR79 לEAC-.) גם הם הכירו באופן משמעותי.

1. סינתזה של 11-Mercaptoundecanoyl-N-hydroxysuccinimide אסתר (MU-NHS) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת dropwise פתרון של 500 מ&quot;ג N-hydroxysuccinimide ו30 מ&quot;ג 4 - פירידין (dimethylamino) ב10 מיליליטר אצטון (PA) עד 1 גרם חומצת 11-mercaptoundecanoic ב40 מיליליטר dichloromethane (PA) בטמפרטורת חדר (RT). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מגניב התגובה ל0 מעלות צלזיוס ולהוסיף N 1.1 גרם dropwise, N &#39;-dicyclohexylcarbodiimide ב10 מיליליטר dichloromethane (תחת אווירת חנקן). שמור את התגובה בטמפרטורה נמוכה במשך שעה 1 ולאחר מכן מערבבים ב RT הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סנן את המשקע ולייבש אותו תחת לחץ מופחת. לטהר את המוצר על ידי הבזק כרומטוגרפיה עם בנזין נפט ואתיל אצטט (PA) ביחס של 1:1. </li></ol> 2. הכנת שכבות זהב אחידה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> coverslips זכוכית נקי עם מגבוני דיוק וsonicate למשך 5 דקות בתמיסה המכילה תערובת 1:1 של אתיל אצטט (הרשות) ומתנול (PA). Rinsמצעי דואר עם מתנול ולהתנגב תחת זרם חנקן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את מצעים נקיים במכשיר ציפוי גמגום. לפנות את החדר. הסר את שכבת תחמוצת כרום העליונה מהיעד כרום ידי מקרטעת ל60 שניות. מניחים את הדגימות מתחת לקורת המתכת ומעיילם עם שכבת כרום 10 ננומטר, ואחריו על ידי ציפוי בשכבת זהב 40 ננומטר. </li></ol> 3. קיבוע פני השטח של BMP-2 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים MU-NHS בN, N-dimethlyformamide (DMF) לריכוז סופי של כ 1 מ&quot;מ ודגירת מצעי זהב בפתרון MU-NHS ב RT במשך 4 שעות תחת אווירת חנקן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משטחי Sonicate בDMF למשך 2 דקות, לשטוף עם DMF וMeOH ולהתנגב תחת זרם חנקן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון מניות של rhBMP-2 בסטרילית 4 מ&quot;מ HCl בריכוז של 100 מיקרוגרם / מיליליטר (aliquots חנות ב -80 מעלות צלזיוס). לדילולים עובדים (3.5 מיקרוגרם / מיליליטר), לדלל את פתרון המניות ב-PBS / NaCl (PBS המכיל 1 M NaCl) וdjust ל-pH 8.5 מייד לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה משטחים פונקציונליות MU-NHS בפתרון עובד rhBMP-2 על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. הסר supernatant דגירה. משטחי Sonicate ב-PBS / NaCl למשך 2 דקות ולשטוף 3x עם PBS סטרילי / NaCl. </li></ol> 4. אפיון פני השטח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לחסום ספיחה לא ספציפית של נוגדן, דגירה משטחים עם BSA 5% (w / v) בפתרון PBS עבור שעה 1 ב RT, ואחריו דגירה עם נוגדן אנטי BMP-2 (1:100 ב1% (w / v ) פתרון BSA / PBS) במשך שעה 1 ב RT. שטוף משטחים פעמיים עם PBS sonicate במשך 30 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה מצעים עם נוגדן HRP-מצומדות המשני (1:1,000 ב1% (w / v) פתרון BSA / PBS) במשך 30 דקות ב RT, ולאחר מכן לשטוף פעמיים עם PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש assay האדום Ampliflu כדי למדוד את הפעילות האנזימטית HRP ב 570 ננומטר עם קורא צלחת. </li></ol> 5. ניתוח של פעילות ביולוגית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרעים 1 x 10 myoblasts C2C12 5 עכבר לכל טוב ב6 גם plאטס במדיום גידול, בהיקף של DMEM גלוקוז גבוהה המכיל פירובט בתוספת 10% FBS, 1% פניצילין / סטרפטומיצין ומדגיר אותן 24 שעות על 37 ° C / 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרעיב את התאים בסרום ללא DMEM ל3-5 שעות לפני זריעה על גבי המשטחים מעוצבים עם BMP-2 המשותק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחקירה של אינדוקציה איתות לטווח קצר, להחליף את המדיום בסרום ללא DMEM הטרי 200 μl ולמקם את BMP-2 משטחים משותקים מעל התאים. המשטח צריך להיות מטופלים עם פינצטה קצה קנס כדי להימנע מגירוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בעדינות משטחים ולשאוב את המדיום עם טפטפת, לשטוף את התאים פעמיים עם PBS. המשך לניתוח של תגובות תא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לניתוח של פעילות ביולוגית ארוך טווח, תאי צלחת על גבי משטחים ותרבותם על 37 ° C / 5% CO 2 בתנאים נמוכים בסרום (2% FBS) במשך שישה ימים. </li></ol>

<ol><li>Helm, G., Andersson, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Summary+statement%3A+Bone+morphogenetic+proteins%3A+Basic+science%5BTitle%5D)+AND+%22Spine%22%5BJournal%5D)">Summary statement: Bone morphogenetic proteins: Basic science.</a> Spine. 27 (16S), S9(2002).</li>
<li>Hogan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+morphogenetic+proteins%3A+multifunctional+regulators+of+vertebrate+development%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Bone morphogenetic proteins: multifunctional regulators of vertebrate development.</a> Genes Dev. 10 (13), 1580-1594 (1996).</li>
<li>Reddi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMPs%3A+from+bone+morphogenetic+proteins+to+body+morphogenetic+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine+Growth+Factor+Rev%22%5BJournal%5D)">BMPs: from bone morphogenetic proteins to body morphogenetic proteins.</a> Cytokine Growth Factor Rev. 16, 249-250 (2005).</li>
<li>Rengachary, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+morphogenetic+proteins%3A+basic+concepts%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosurg+Focus%22%5BJournal%5D)">Bone morphogenetic proteins: basic concepts.</a> Neurosurg Focus. 13 (6), 1-6 (2002).</li>
<li>Schlunegger, M., Grütter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+unusual+feature+revealed+by+the+crystal+structure+at+2.2+%C3%85%3B+resolution+of+human+transforming+growth+factor-%CE%B22%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An unusual feature revealed by the crystal structure at 2.2 Å; resolution of human transforming growth factor-β2.</a> Nature. 358, 430-434 (1992).</li>
<li>Scheufler, C., Sebald, W., Hülsmeyer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+human+bone+morphogenetic+protein-2+at+2.7+%C3%85+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of human bone morphogenetic protein-2 at 2.7 Å resolution.</a> J. Mol. Biol. 287 (1), 103-115 (1999).</li>
<li>Nimni, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polypeptide+growth+factors%3A+targeted+delivery+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Polypeptide growth factors: targeted delivery systems.</a> Biomaterials. 18 (18), 1201-1225 (1997).</li>
<li>Wozney, J., Rosen, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+morphogenetic+protein+and+bone+morphogenetic+protein+gene+family+in+bone+formation+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Orthop.+Related+Res%22%5BJournal%5D)">Bone morphogenetic protein and bone morphogenetic protein gene family in bone formation and repair.</a> Clin. Orthop. Related Res. 346, 26(1998).</li>
<li>Rosen, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMP+and+BMP+inhibitors+in+bone%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">BMP and BMP inhibitors in bone.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1068, 19-25 (2006).</li>
<li>Kirsch, T., Sebald, W., Dreyer, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+BMP-2-BRIA+ectodomain+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the BMP-2-BRIA ectodomain complex.</a> Nat. Struct. Biol. 7 (6), 492-496 (2000).</li>
<li>Keller, S., Nickel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+recognition+of+BMP-2+and+BMP+receptor+IA%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular recognition of BMP-2 and BMP receptor IA.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 11 (5), 481-488 (2004).</li>
<li>Miyazono, K., Maeda, S., Imamura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMP+receptor+signaling%3A+transcriptional+targets%2C+regulation+of+signals%2C+and+signaling+cross-talk%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine+Growth+Factor+Rev%22%5BJournal%5D)">BMP receptor signaling: transcriptional targets, regulation of signals, and signaling cross-talk.</a> Cytokine Growth Factor Rev. 16 (3), 251-263 (2005).</li>
<li>Nohe, A., Hassel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mode+of+bone+morphogenetic+protein+%28BMP%29+receptor+oligomerization+determines+different+BMP-2+signaling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The mode of bone morphogenetic protein (BMP) receptor oligomerization determines different BMP-2 signaling pathways.</a> J. Biol. Chem. 277 (7), 5330-5338 (2002).</li>
<li>Sieber, C., Kopf, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+BMP+receptor+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine+Growth+Factor+Rev%22%5BJournal%5D)">Recent advances in BMP receptor signaling.</a> Cytokine Growth Factor Rev. 20 (5-6), 343-355 (2009).</li>
<li>Carragee, E. J., Hurwitz, E. L., Weiner, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+review+of+recombinant+human+bone+morphogenetic+protein-2+trials+in+spinal+surgery%3A+emerging+safety+concerns+and+lessons+learned%5BTitle%5D)+AND+%22Spine+J%22%5BJournal%5D)">A critical review of recombinant human bone morphogenetic protein-2 trials in spinal surgery: emerging safety concerns and lessons learned.</a> Spine J. 11, 471-491 (2011).</li>
<li>Luginbuehl, V., Meinel, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localized+delivery+of+growth+factors+for+bone+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Pharm.+Biopharm%22%5BJournal%5D)">Localized delivery of growth factors for bone repair.</a> Eur. J. Pharm. Biopharm. 58 (2), 197-208 (2004).</li>
<li>Nakaji-Hirabayashi, T., Kato, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oriented+immobilization+of+epidermal+growth+factor+onto+culture+substrates+for+the+selective+expansion+of+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Oriented immobilization of epidermal growth factor onto culture substrates for the selective expansion of neural stem cells.</a> Biomaterials. 28 (24), 3517-3529 (2007).</li>
<li>Gonçalves, R., Martins, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioactivity+of+immobilized+EGF+on+self-assembled+monolayers%3A+Optimization+of+the+immobilization+process%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Mater.+Res.+Part+A.+94A%22%5BJournal%5D)">Bioactivity of immobilized EGF on self-assembled monolayers: Optimization of the immobilization process.</a> J. Biomed. Mater. Res. Part A. 94A. 2 (2), 576-585 (2010).</li>
<li>Pohl, T. L. M., Boergermann, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+immobilization+of+bone+morphogenetic+protein+2+via+a+self-assembled+monolayer+formation+induces+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Surface immobilization of bone morphogenetic protein 2 via a self-assembled monolayer formation induces cell differentiation.</a> Acta Biomater. 8 (2), 772-780 (2012).</li>
<li>Love, J., Estroff, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembled+monolayers+of+thiolates+on+metals+as+a+form+of+nanotechnology%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Rev%22%5BJournal%5D)">Self-assembled monolayers of thiolates on metals as a form of nanotechnology.</a> Chem. Rev. 105 (4), 1103-1169 (2005).</li>
<li>Katagiri, T., Yamaguchi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+morphogenetic+protein-2+converts+the+differentiation+pathway+of+C2C12+myoblasts+into+the+osteoblast+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Bone morphogenetic protein-2 converts the differentiation pathway of C2C12 myoblasts into the osteoblast lineage.</a> J. Cell Biol. 127 (6), 1755-1766 (1994).</li>
<li>Whitaker, M. J., Quirk, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+factor+release+from+tissue+engineering+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharm.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Growth factor release from tissue engineering scaffolds.</a> J. Pharm. Pharmacol. 53 (11), 1427-1437 (2001).</li>
<li>Uludag, H., D'Augusta, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implantation+of+recombinant+human+bone+morphogenetic+proteins+with+biomaterial+carriers%3A+a+correlation+between+protein+pharmacokinetics+and+osteoinduction+in+the+rat+ectopic+model%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Mater.+Res%22%5BJournal%5D)">Implantation of recombinant human bone morphogenetic proteins with biomaterial carriers: a correlation between protein pharmacokinetics and osteoinduction in the rat ectopic model.</a> J. Biomed. Mater. Res. 50 (2), 227-238 (2000).</li>
<li>Kashiwagi, K., Tsuji, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directional+BMP-2+for+functionalization+of+titanium+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Directional BMP-2 for functionalization of titanium surfaces.</a> Biomaterials. 30 (6), 1166-1175 (2008).</li>
<li>Karageorgiou, V., Meinel, V. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+morphogenetic+protein-2+decorated+silk+fibroin+films+induce+osteogenic+differentiation+of+human+bone+marrow+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Mater.+Res%22%5BJournal%5D)">Bone morphogenetic protein-2 decorated silk fibroin films induce osteogenic differentiation of human bone marrow stromal cells.</a> J. Biomed. Mater. Res. 71 (3), 528-573 (2004).</li>
<li>Rose, F. R. A. J., Hou, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+systems+for+bone+growth+factors+-+the+new+players+in+skeletal+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharm.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Delivery systems for bone growth factors - the new players in skeletal regeneration.</a> J. Pharm. Pharmacol. 56 (4), 415-427 (2004).</li>
<li>Masters, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Covalent+growth+factor+immobilization+strategies+for+tissue+repair+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Macromol.+Biosci%22%5BJournal%5D)">Covalent growth factor immobilization strategies for tissue repair and regeneration.</a> Macromol. Biosci. 11 (9), 1149-1163 (2011).</li>
<li>Crouzier, T., Fourel, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presentation+of+BMP-2+from+a+soft+biopolymeric+film+unveils+its+activity+on+cell+adhesion+and+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Mater%22%5BJournal%5D)">Presentation of BMP-2 from a soft biopolymeric film unveils its activity on cell adhesion and migration.</a> Adv. Mater. 23 (12), H111-H118 (2011).</li>
<li>Ruppert, R., Hoffmann, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+bone+morphogenetic+protein+2+contains+a+heparin-binding+site+which+modifies+its+biological+activity%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Human bone morphogenetic protein 2 contains a heparin-binding site which modifies its biological activity.</a> European Journal of Biochemistry. 237 (1), 295-302 (1996).</li>
<li>Love, J., Estroff, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembled+monolayers+of+thiolates+on+metals+as+a+form+of+nanotechnology%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Rev%22%5BJournal%5D)">Self-assembled monolayers of thiolates on metals as a form of nanotechnology.</a> Chem. Rev. 105 (4), 1103-1169 (2005).</li>
<li>Kato, K., Sato, H., Iwata, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immobilization+of+histidine-tagged+recombinant+proteins+onto+micropatterned+surfaces+for+cell-based+functional+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Immobilization of histidine-tagged recombinant proteins onto micropatterned surfaces for cell-based functional assays.</a> Langmuir. 21 (16), 7071-7075 (2005).</li>
<li>Martins, M., Curtin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecularly+designed+surfaces+for+blood+deheparinization+using+an+immobilized+heparin-binding+peptide%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Mater.+Res%22%5BJournal%5D)">Molecularly designed surfaces for blood deheparinization using an immobilized heparin-binding peptide.</a> J. Biomed. Mater. Res. 88 (1), 162-173 (2009).</li>
<li>Limbut, W., Kanatharana, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+study+of+capacitive+immunosensors+based+on+self-assembled+monolayers+formed+from+thiourea%2C+thioctic+acid%2C+and+3-+mercaptopropionic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens.+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">A comparative study of capacitive immunosensors based on self-assembled monolayers formed from thiourea, thioctic acid, and 3- mercaptopropionic acid.</a> Biosens. Bioelectron. 22 (2), 233-240 (2006).</li>
<li>Patel, N., Davies, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immobilization+of+protein+molecules+onto+homogeneous+and+mixed+carboxylate-terminated+self-assembled+monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Immobilization of protein molecules onto homogeneous and mixed carboxylate-terminated self-assembled monolayers.</a> Langmuir. 13 (24), 6485-6490 (1997).</li>
<li>Hu, J., Duppatla, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+PEGylation+of+bone+morphogenetic+protein-2+cysteine+analogues%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjug.+Chem%22%5BJournal%5D)">Site-specific PEGylation of bone morphogenetic protein-2 cysteine analogues.</a> Bioconjug. Chem. 21 (10), 1762-1772 (2010).</li>
<li>Hersel, U., Dahmen, C., Kessler, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RGD+modified+polymers%3A+biomaterials+for+stimulated+cell+adhesion+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">RGD modified polymers: biomaterials for stimulated cell adhesion and beyond.</a> Biomaterials. 24 (24), 4385-4415 (2003).</li>
<li>Cao, T., Wang, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+spacer+length+effect+on+immobilized+Escherichia+coli+pili-antibody+molecular+recognition+by+AFM%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Investigation of spacer length effect on immobilized Escherichia coli pili-antibody molecular recognition by AFM.</a> Biotechnol. Bioeng. 98 (6), 1109-1122 (2007).</li>
<li>Puleo, D., Kissling, R., Sheu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+technique+to+immobilize+bioactive+proteins%2C+including+bone+morphogenetic+protein-4+%28BMP-4%29%2C+on+titanium+alloy%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">A technique to immobilize bioactive proteins, including bone morphogenetic protein-4 (BMP-4), on titanium alloy.</a> Biomaterials. 23 (9), 2079-2087 (2002).</li>
</ol>

יש מחברים אין לחשוף.

בפרוטוקול זה אנו מתארים את הכנת המשטחים פונקציונליות עם rhBMP-2 ביו. גישה זו כוללת שני שלבים: 1) היווצרות הראשונית של monolayer הרכבה עצמית (SAM) של מקשר bifunctional על משטח הזהב, 2) קיבוע קוולנטי של חלבון rhBMP-2. בעבודה קודמת, שתוקפים יעיל מחייב של מקשר bifunctional וגורם הגדילה, והוכחתי כי משותק משטח rhBMP-2 שומר על הפעילות הביולוגית שלו 19. הפעילות הביולוגית של גורמי גדילה המוצגים בצורה משותקת גם הוכח במחקרים אחרים, מצביעה על כך ששחרורו של החלבונים וההפנמה הבאה שלה...

חלבון morphogenetic עצם 2 (BMP-2) הוא חבר של גורם הפיכת צמיחת משפחה (TGF-β) ופועל כמשדל של דה נובו היווצרות עצם כמו גם רגולטור של כמה רקמות במהלך התפתחות עוברית ובוגר הומאוסטזיס 1-3. כל מונומר של BMP-2 החלבון homodimeric הפעיל הביולוגית מכיל מוטיב &quot;קשר ציסטאין&quot;, שזה שמור ביותר בכל 4 BMPs. שש משאריות ציסטאין שבע ליצור קשרי דיסולפיד intramolecular כי לייצב מונומר אחד, ואילו ציסטאין השביעי מעורבים בdimerization, ויצר אג&quot;ח מולקולאריים בין שני מונומרים 5,6. קשר ציסטאין השמור ביותר זה מגדיר את המבנה התל הממדי של חלבון BMP-2 וקובע את המאפיינים הייחודיים שלה, כגון עמידות מפני חום, denaturants וחומצי pH 7-9. BMP-2 נקשר לקולטנים הטרנסממברני קינאז סרין / תראונין, וכך גרימת הולכות אותות <sup&gt; 10-12. בהתאם למצב של oligomerization קולט, מסלולי איתות שונים מופעלים: מפל איתות הסמאד עצמאי מוביל לאינדוקצית phosphatase אלקליין באמצעות איתות p38, ואילו מסלול הסמאד תלוי מופעל על ידי תוצאות זרחון הקולטן בטרנסלוקציה הסמאד המורכבת גרעינית והפעלה של שעתוק של גנים ספציפיים יעד, כגון המעכב של התמיינות (Id) 12-14. בעצמות, BMP-2 גורם להתמיינות של תאי גזע mesenchymal לאוסטאובלסטים, וכך מגרה את הריפוי והיווצרות דה נובו של עצם. נכון לעכשיו, recombinantly הביע BMP-2 מוחל קליני כדי לשפר את הריפוי של אתרים שבורים. אסטרטגיה נפוצה בהנדסת רקמות עצם היא השימוש בגורמי גדילה בזריקות, שהוא פחות פולשני בהשוואה למערכות אספקה ​​מקומיות. עם זאת, במחקרי vivo ויישומים קליניים הראו כי זמן מחצית החיים הביולוגיים קצרים, loc הנוקבalization וסליקה מקומית מהירה של BMP-2 עשויים להוביל למספר בעיות מקומיות, מחוץ לרחם ומערכתית 15. לפיכך, כדי להשיג מצגת יעילה, המלכוד או חוסר תנועה של BMP-2 בתוך או על גבי חומרים הכרחי למסירה באתר היעד מתמשכת והמקומית שלה. משלוח מתמשך ניתן להשיג עם גישות שימור שאינו קוולנטיים, כגון הילכדות פיזית, ספיחה או complexation יון 16. עם זאת, ידוע כי ספיחה לא ספציפית של חלבונים על משטחים עשויות תוצאות בdenaturation של המולקולות 17. לקוולנטיים המחייב של גורמי גדילה, סוגים שונים של תומך פותחו בעשור האחרון. השימוש במולקולות מקשרים bifunctional כי יעד קבוצות אמינו או carboxyl של החלבון לדוגמא, הוא סוג אחד גישה שלא בהכרח דורש שינוי חלבון כדי להשיג קיבועה של. למעשה, בעוד שינוי החלבון מציע את היתרון של השליטה נטייה חלבון,המבוא של תחומים מלאכותיים, תגי פפטיד ורשתות באתר ספציפי עשוי לשנות את הפעילות הביולוגית של גידול גורמי 17. לכן, כדי לעקוף denaturation עקב אינטראקציה עם חומר התמיכה, יכולים להיות פונקציונליות משטחים מראש, למשל, עם monolayer עצמי התאספו (SAM) של מולקולה המקשרת, ואחריו צימוד של הגורם הרצוי 18. יש לנו בשימוש בגישה מבוססת SAM כדי לשתק קוולנטית BMP-2 על גבי משטח על ידי מיקוד השאריות האמינים בחינם והראינו כי החלבון המשותק שומר גם הפעילות הביולוגית לטווח קצר והארוך שלה 19. פרוטוקול זה מספק דרך פשוטה ויעילה כדי לספק BMP-2 לתאים לבדיקות במבחנה על המנגנונים שמתרחשים בקרום התא ומווסתים את האיתות תאית אחראית לאיתות osteogenic.

<table><tbody><tr><td>N-hydroxysuccinimide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>130672</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>4-(דימתיל-אמינו)פירידין</td><td>, סיגמא-אולדריץ'</td><td>522805</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>אצטון</td><td>AppliChem</td><td>A2282</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>11-חומצה מרקפטונדקנואית</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>674427</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>דיכלורמתאן</td><td>Merck</td><td>106050</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>N,N'-dicyclohexylcarbodiimide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D80002</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>נפט בנזן</td><td>Merck</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>כיסויי זכוכית</td><td>Carl Roth</td><td>M 875</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>אתילאצטט</td><td>AppliChem</td><td>A3550</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>מתנול</td><td>קארל רוט</td><td>4627</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>N,N-dimethylformamide</td><td>Carl Roth</td><td>T921</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>rhBMP-2</td><td>מו"פ D Systems</td><td>355-BM</td><td>ללא ספק; מבוטא ב-E.coli</td></tr><tr><td>PBS</td><td>PAA</td><td>H15-002</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>קארל רות'</td><td>HN00.2</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>פולי (דימתיל סילוקסן) (PDMS)</td><td>דאו קורנינג</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>ערכת אלסטומר סיליקון Sylgard 184</td><td>Dow Corning</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>אנטי-rhBMP-2</td><td>סיגמא</td><td>B9553</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>עיזים נגד עכבר IgG-HRP</td><td>סנטה קרוז</td><td>sc-2005</td><td>נוגדן משני</td></tr><tr><td>Ampliflu מבחן אדום</td><td>סיגמא</td><td>90101</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (1x), נוזלי</td><td>Gibco</td><td>41966</td> סרום בקר עוברי <td>עם גלוקוז גבוה</td></tr><tr><td>(FBS)</td><td>Sigma</td><td>F7524</td> עט/סטרפטוקוס Gibco 15140 <td>מסונן סטרילי, נבדק בתרבית תאים</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>טריפסין 0.05% (פי 1) עם EDTA 4Na</td><td>Gibco</td><td>25300</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>גליצין (0.1 מ')</td><td>Riedel-de Ha&euml; n</td><td>33226</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>IGEPAL CA-630 (1%)</td><td>Sigma</td><td>I8896</td><td>מאגר ליזה (בדיקת ALP)19</td></tr><tr><td>מגנזיום כלוריד (MgCl2)(1 מ"מ)</td><td>Carl Roth</td><td>HNO3.2</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>אבץ כלורי (ZnCl2) (1 מ"מ)</td><td>Carl Roth</td><td>3533.1</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>p-nitrophenylphosphate (pNPP)</td><td>Sigma</td><td>S0942</td><td>מצע פוספטאז</td></tr><tr><td>אנטי-מיזין שרשרת כבדה (MHC)</td><td>מחקרים התפתחותיים בנק היברידומה, אוניברסיטת איווה</td><td>MF20</td><td>נוגדן חד-שבטי</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 עז נגד עכבר IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A11001</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>סיגמא</td><td>D9542</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4" ><חזק>ציוד</חזק></td></tr><tr><td>אמבט אולטרסוניק (Sonorex Super RK 102H), תדר 35 קילו-הרץ</td><td>BANDELIN אלקטרוני GmbH Co. KG</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>MED 020 מערכת ציפוי</td><td>מקרטע BAL-TEC AG</td><td></td><td>תנאי ציפוי Cr: 120 mA, 1.3 x 10-2 mbar, 30 שניות Au: 60 mA, 5.0 x 10-2 mbar, 45 שניות</td></tr><tr><td>Tecan Infinite M200 קורא צלחות</td><td>Tecan</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr></tbody></table>

קוולנטיים עקידת bmp-2 על משטחים באמצעות גישה חד שכבתי התאסף עצמית

Covalent Binding of BMP-2 on Surfaces Using a Self-assembled Monolayer Approach

morphogenetic עצם חלבון 2 (BMP-2) הוא גורם גדילה משובץ במטריצה ​​תאית של רקמת עצם. BMP-2 משמש כהדק של התמיינות תאי mesenchymal לאוסטאובלסטים, וכך מגרה ריפוי והיווצרות עצם נובו דה. השימוש הקליני של אנושי רקומביננטי BMP-2 (rhBMP-2) בשיתוף עם פיגומים העלה מחלוקות האחרונות, המבוסס על המצב של מצגת ואת הסכום כדי להיות מועבר. הפרוטוקול המובא כאן מספק דרך פשוטה ויעילה כדי לספק BMP-2 לבדיקות במבחנה בתאים. אנו מתארים כיצד ליצור monolayer עצמית התאספו בהיקף של מקשר heterobifunctional, ולהראות את הצעד מחייב שלאחר מכן כדי להשיג קיבוע קוולנטי של rhBMP-2. עם גישה זו אפשר להשיג מצגת מתמשכת של BMP-2 תוך שמירה על הפעילות הביולוגית של החלבונים. למעשה, חוסר התנועה של BMP-2 המשטח מאפשרת חקירות ממוקדות על ידי מניעת מודעות נוקבותorption, תוך הפחתת הכמות של גורם גדילה, ובעיקר, פוגע בשחרור מבוקר מהשטח. שני אירועי האיתות לטווח קצר וארוך מופעלים על ידי BMP-2 מתרחשים כאשר תאים נחשפים למשטחי הצגה משותקים קוולנטית rhBMP-2, מה שהופך את הגישה הזאת מתאימה למחקרים במבחנה בתגובות תא לBMP-2 גירוי.

בהתקנה שלנו, זהב נבחר כחומר לא פעיל מאז שהיא מספקת מערכת ביולוגית נוקבת אבל כימי מתכונן. יתר על כן, היישום של monolayers הרכבה העצמית כרוך יתרונות רבים: סאמס לספוג באופן ספונטני באמצעות "ראש הקבוצות" שלהם על מתכות וmonolayers טופס עם כמה פגמים, ואילו ניתן לשנות קצה הקבוצות הפונקציונלית שלהם עוד יותר. כך שהם מספקים פלטפורמה ללהתאים את המאפיינים של הממשק בצורה עדיין ישימה מאוד מבוקרת 20. לחוסר התנועה של ...

אנו מתארים שיטה לביצוע קיבוע יעיל של BMP-2 על גבי משטחים. הגישה שלנו מבוססת על היווצרות monolayer עצמי התאספו כדי להשיג את הקשר הקוולנטי של BMP-2 באמצעות השאריות האמינים שלה בחינם. שיטה זו היא כלי שימושי כדי ללמוד איתות בקרום התא.

קוולנטיים עקידת BMP-2 על משטחים באמצעות גישה חד שכבתי התאסף עצמית

Bone morphogenetic protein 2 (BMP-2) is a growth factor embedded in the extracellular matrix of bone tissue. BMP-2 acts as trigger of mesenchymal cell ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא לקשור קוולנטית שתי מולקולות BMP למשטחים מבלי לאבד את הפעילות הביולוגית שלהן. זה מושג על ידי יצירת שכבת זהב על מצע על ידי שקיעת אדים פיזית. השלב השני הוא ליצור שכבה חד-שכבתית בהרכבה עצמית של מקשר NHS Thiol דו-פונקציונלי של ה-NHSA.לאחר מכן, RH BMP 2 קשור קוולנטית למקשר. השלב האחרון הוא להסיר את ה-BMP הלא קשור שניים על ידי סוניקציה. בסופו של דבר, נעשה שימוש בבדיקת קשירת נוגדנים כדי להראות את הקישור המוצלח של BMP 2 על פני השטח והפעילות הביולוגית של BMP 2 הקשור למשטח נקבעת בתאים על ידי ניתוח זרחון SMA 1 5 8.שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה של גורמי גדילה, כגון אם הקישור הראשוני של גורמי גדילה לקולטנים שלהם על פני התא מספיק כדי לעורר תגובות איתות. המדגימות את ההליך יהיו שתי חברות במעבדה שלי, תרזה פול ואליזבת שוואב. כדי להתחיל בהליך זה, יש לנקות את כיסוי הזכוכית עם מגבונים מדויקים ולהפוך אותם לסוניקציה למשך חמש דקות בתערובת אחד לאחד של אתיל אצטט ומתנול.לאחר סוניקציה יש לשטוף את המצעים במתנול ולייבש אותם בזרימת חנקן. הניחו את המצעים הנקיים במכשיר ציפוי מקרטע ופנו את החדר. הסר את שכבת תחמוצת הכרום העליונה ממטרת הכרום על ידי התזה למשך 60 שניות.לאחר מכן מצפים את המצע בשכבת כרום של 10 ננומטר ואחריה ציפוי בשכבת זהב של 40 ננומטר. בסיום, הסר את מצעי הזהב מהתא והניח אותם בצד. העבירו את מצעי הזהב לבקבוק תחתון עגול עם שני צווארים ודגרו אותם במילימולרית אחת M-U-N-H-S ב-DMF בטמפרטורת החדר למשך ארבע שעות תחת אטמוספירת חנקן.לאחר הדגירה, סוניקציה של המצעים ב-DMF למשך שתי דקות. שטפו אותם עם DMF ומתנול וייבשו אותם בזרימת חנקן. יש לדלל את תמיסת ה-RHB MP Two Stock עם נתרן כלורי מולארי אחד ב-PBS כדי לתת ריכוז סופי של 3.5 מיקרוגרם למיליליטר.התאם את תמיסת העבודה הזו ל-pH 8.5 עם אשלגן הידרוקסיד סטרילי של 10 מילי-מולרי מיד לפני השימוש. הנח טבעת A-P-D-M-S על גבי הדגימה. העבירו את המצע לצלחת שש בארות כדי להבטיח שרק משטחי המצע חשופים לתמיסת הדגירה.לאחר מכן דגרו את מצעי ה-M-U-N-H-S הפונקציונליים עם פתרון העבודה RHB MP Two בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה. לאחר הסרת הסופרנטנט הדגירה, הוסף נתרן כלורי מולארי אחד ב-PBS ועשה סוניקציה של המצעים למשך שתי דקות. בסיום, שטפו את המצעים שלוש פעמים עם נתרן כלורי מולארי אחד סטרילי ב-PBS כדי לחסום ספיגה לא ספציפית של נוגדנים.דגרו את המצעים ב-5% BSA ב-PBS למשך שעה בטמפרטורת החדר. לאחר מכן דגרו את המצעים עם תמיסת נוגדנים נגד BMP למשך שעה בטמפרטורת החדר בסיום, שטפו את המצעים פעמיים עם PBS והפכו אותם לסוניקציה למשך 30 שניות. לאחר מכן, דגרו את המצעים בתמיסת נוגדנים משנית מצומדת HRP למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר ולאחר מכן שטפו אותם פעמיים עם PBS.השתמש במבחן האדום של שפעת כדי למדוד את הפעילות האנזימטית של HRP ב-570 ננומטר עם זרע קורא צלחות, אחד כפול 10 לפה החמישי, C שני C, 12 מיובלסטים לבאר בשש צלחות באר במצע הגידול ודגירה עליהם למשך 24 שעות ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2. לאחר הוצאת הלוחות מהחממה, שאפו את המדיה מהבארות והרעיבו את התאים ב-DMEM חופשי בסרום במשך שלוש עד חמש שעות לפני הזריעה על ה-BMP הפונקציונלי שני משטחי מצע לחקירת אינדוקציה של איתות לטווח קצר. החלף את המדיום ב-200 מיקרוליטר של DMEM טרי ללא סרום והנח את ה-BMP המשותק שני מצעים מעל התאים באמצעות פינצטה עדינה לאחר הדגירה ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2.הסר את המצעים בעדינות ושאף את המדיום בעזרת פיפטה. לאחר מכן שטפו את התאים פעמיים עם PBS והמשיכו לניתוח תגובות התאים באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל וכתמים מערביים לניתוח פעילות ביולוגית ארוכת טווח. צלחו את התאים על המשטחים כפי שתואר קודם לכן, ותרבו אותם בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 ב-2% FBS למשך שישה ימים.לאחר הדגירה. דמו את התאים על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית כדי לאמת RH BMP, שני משטחי קישור המציגים RH BMP משותק, שניים הודגרו עם BMP, שני נוגדנים ספציפיים ונוגדנים משניים מצומדים עם HRP. ה-RH BMP המשותק על פני השטח שניים או I BMP שניים זוהה לפני ואחרי גירוי התאים.מוצג כאן הקישור המוצלח של RH BMP 2 לפני השטח באישור המוכר על ידי האנטי BMP שני IgG. ה-RH BMP המשותק פני השטח השני כומת באמצעות הבדיקה המטרית של שפעת האמלי והנתונים מראים כי לאחר גירוי התאים, החלבון עדיין זוהה על פני השטח תגובות התאים למשטחים המציגים RHB MP משותק שניים הוערכו והושוו להשפעה של מצעי זהב לא מטופלים. כאן, שני תאי C 12 מגורים למשך 30 דקות על ידי RHB MP שני משטחים פונקציונליים המתקרבים מלמעלה.במודל זה, BMP 2 מעכב את התמיינות התאים לצינורות מיו מרובי גרעינים וגורם לפנוטיפים של אוסטאובלסטים. ההפעלה של SMAD 1 5 8, שהם מדווחים במורד הזרם של מסלול האיתות BMP 2 מנותחת על ידי כתמים מערביים כפי שמוצג כאן. זרחון SM נצפה לאחר גירוי של 30 דקות על ידי I BMP 2, בעוד שלא מתרחשת זרחון של SMAD 1 58 בתאים שנחשפו לדגימות זהב לא מטופלות.תוצאה זו מצביעה על כך שתהליך הקיבוע אינו משנה את הפעילות הקצרה של BMP לטווח הקצר ומפעיל שלבים מוקדמים באיתות smad כדי לקבוע אם I BM P 2 משפיע על התמיינות אוסטאוגנית לטווח ארוך. רמת הביטוי של פוספטאז אלקליין נחקרה על ידי מבחן מטרי של צ'ול. פעילות פוספטאז אלקליין של שני תאי C 12 נמדדה לאחר דגירה של התאים במשך שישה ימים על זהב רגיל ועל IBP שני משטחים.פעילות פוספטאז אלקליין בליזטים של תאים שגודלו על שני משטחים I BM P הראתה ספיגה גבוהה משמעותית בהשוואה לביקורת. תוצאה זו מגלה כי IBMP 2 גורם לביטוי של פוספטאז אלקליין בתאי C 2 C 12 כדי לחקור את ההשפעה של IBP 2. במיוגנזה C שני תאי C 12 צופו ישירות על זהב או על משטחים פונקציונליים ותורבו בתנאי סרום נמוכים.לאחר שישה ימים בוצעה צביעה של שרשרת כבדה של מיוזין כפי שמוצג כאן. C שני תאי C 12 לא הצליחו ליצור צינורות מיו חיוביים בעלי שרשרת כבדה של מיוזין בנוכחות I BM P 2 בניגוד לתאים על מצעי זהב. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו קיבוע BMP 2 על ננו-חלקיקי זהב כדי לענות על שאלות נוספות.לדוגמה, כמה BMP 2 משותק דרוש באופן מקומי כדי להפעיל ביעילות תגובות איתות.

covalent-binding-bmp-2-on-surfaces-using-self-assembled-monolayer

Research

JoVE Journal

Chemistry

כימיה

אנו מציגים הליך לגיבוש פולי (אתילן גליקול) עצמית התאספו monolayer (PEG-SAM) על מצע סיליקון עם microelectrodes זהב. PEG-SAM נוצר בשלב אחד ומונע Biofouling על משטחי סיליקון וזהב. אלקטרופורזה לאחר מכן נעשה שימוש עבור ביומולקולות דפוסים עד הננומטרי.

Antifouling עצמית התאספו monolayers על Microelectrodes עבור ביומולקולות דפוסים

כאן אנו מראים כיצד להשתמש קשירת הסמיכות Assay (PLA), עם שילוב של נוגדנים לדמיין המוךפו"גנטי שהולך עצם חלבון (BMP) איתות תאים קבוע. טכניקה זו אפשרה לנו לעקוב אחר הצטברות הגרעין של BMP אנדוגני מופעל מפעיל, מתחמי ולכמת רמות שלהם לאורך זמן תחת גירוי BMP4.

איתור של מפעיל איתות, מתחמי Downstream של BMP4 שימוש באתרו PLA, Assay קשירת הסמיכות

מוצג פרוטוקול לחיבור מגוון גדול של מולקולות בודדות באופן קוולנטי לקצה AFM. ניתנים נהלים ודוגמאות לקביעת כוח ההדבקה והאנרגיה החופשית של מולקולות אלה על תומכים מוצקים וממשקים ביולוגיים.

חוקר מולקולה בודדת הדבקה על ידי הכוח האטומי ספקטרוסקופיה

אנו מתארים את הייצור והאפיון של מערכות ננו-ביולוגיות המממשקות מצעים ננו-מובנים עם חלבונים ואפטמרים משותקים. מדווחים על השלבים הניסויים הרלוונטיים הכוללים ייצור ליטוגרפי של מצעים ננו-מבניים, ביו-פונקציונליזציה ואפיון ספקטרוסקופיה רמאן משופרת פני השטח (SERS). זיהוי SERS של חלבונים משותקים על פני השטח, ובדיקה של קשירת חלבון-ליגנד ואפטאמר-ליגנד מודגמת.

משטח משופר ראמאן ספקטרוסקופיה איתור של מולקולות ביולוגיות באמצעות EBL מצעי Nanostructured המפוברק

אנו מציגים פרוטוקול functionalize זכוכית עם טלאי חלבון ננומטריים המוקפים bilayer שומנים נוזל. מצעים אלו עולים בקנה אחד עם מיקרוסקופיה אופטית מתקדמת וצפויים להוות פלטפורמה ללימודי הדבקה ו נדידת תאים.

מערכי ננו-אשכול ליגנד בתוך bilayer שומנים נתמך

Biomaterials מסטול עם 2 חלבון Morphogenetic (BMP2) עצם שימשו בתור אסטרטגיה טיפולית חדשה ריפוי שברים בעצמות, והמעלית. כדי להתגבר על תופעות לוואי הנובעות שחרור בלתי נשלט של הגורם, אנו מציעים אסטרטגיה חדשה באתר-ישירות לשתק את הגורם, ובכך ליצור חומרים עם יכולות osteogenic משופר.

האתר מכוון הנייח של עצם Morphogenetic חלבון 2 משטחים מוצקים על ידי לחץ על כימיה

פרוטוקול זה מתאר את הנייח קוולנטיות של חלבונים עם heterobifunctional silane זיווג סוכן תחמוצת סיליקון משטחים המיועדים ספקטרוסקופיה בכוח כוח אטומי מבוסס מיקרוסקופיה מולקולה בודדת אשר הוא כשניסחתי האינטראקציה של RrgA (pilus-1 עצה adhesin של ס pneumoniae) עם fibronectin.

קיבעון קוולנטיות של חלבונים על ספקטרוסקופיה כוח מולקולה בודדת

החזקה הקוולנטי של מולקולות בדיקה למיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) מהווה טכניקה חיונית לחקירת התכונות הפיזיות שלהם. זה מאפשר לנו לקבוע את כוח מתיחה, כוח desorption אורך של פולימרים באמצעות AFM מבוססי כוח מולקולה בודדת ספקטרוסקופיה עם היכולת הגבוהה.

חיבור קוולנטי של מולקולות בודדות לספקטרוסקופיית כוחות מבוססי AFM

גשושית כוח ביו-מברן (BFP) היא טכניקה של ספקטרוסקופיית כוח דינמית (DFS). BFP יכול לשמש כדי למדוד את קבוע האביב של אינטראקציות מולקולריות על תאים חיים. פרוטוקול זה מציג ניתוח מתמיד באביב עבור קשרים מולקולריים שזוהו על ידי BFP.

ניתוח מתמיד של האביב המולקולרי על ידי ספקטרוסקופיית בדיקה כוח Biomembrane

מודל במבחנה של נישה וסקולרית של מח העצם נקבע על ידי זריעת תאים מזנכימליים ואנדותל על הידרוג'ל PEG תלת-ממדי יצוק מראש. רשתות האנדותל, רכיבי ECM ופעילות ALP של הנישות משתנים בהתאם לגורם הגדילה בו נעשה שימוש. הפלטפורמה יכולה לשמש למודלים מתקדמים של סרטן.

הקמה פשוטה של נישת מח עצם אוסטאוגנית וסקולרית באמצעות הידרוג'לים פוליאתילן גליקול (PEG) יצוקים מראש במיקרו-צלחת הדמיה

פרוטוקול לסינתזה ואפיון של חד-שכבות מסגרת מתכתית-אורגנית בהרכבה עצמית מסופק באמצעות גבישי מסגרת מתכת-אורגנית (MOF) מושתלים פולימריים. ההליך מראה כי חלקיקי MOF מושתלים פולימריים ניתנים להרכבה עצמית בממשק אוויר-מים וכתוצאה מכך נוצרים מבנים חד-שכבתיים בנויים היטב, העומדים בפני עצמם, כפי שמעידה הדמיית מיקרוסקופ אלקטרונים סורק.

סינתזה ואפיון של חד-שכבות מסגרת מתכת-אורגנית בהרכבה עצמית באמצעות חלקיקים מצופים פולימר

למד שיטה לקישור קוולנטי של BMP-2 למשטחים תוך שמירה על פעילות ביולוגית באמצעות שכבה עצמית מתאספת. טכניקה זו מאפשרת חקר אינטראקציות חלבונים ומסלולי סיגנלים בתאים.

קוולנטיים עקידת BMP-2 על משטחים באמצעות גישה חד שכבתי התאסף עצמית

גלה סרטונים נוספים