FtsZ פלמור מבחני: פרוטוקולים ושיקולים פשוטים

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לקבוע תנאים מתאימים לחקר FTSZ, פילמור ופעילות באמצעות מבחנים וציוד פשוטים. זה מושג על ידי ביצוע בדיקות שקיעה פולימרית FDSC בתנאים שונים כדי למצוא תנאים מתאימים שבהם FDSZ מתפלמר. כשלב שני, אנו מבצעים מבחני פיזור אור כדי לחקור פילמור FDSZ בזמן אמת.

לאחר מכן, אנו מבצעים מבחני הידרוליזה של GTP כדי לקבוע את פעילות הפילמור ggtpa הקשורה לפילמור של FT SC. מתקבלות תוצאות המראות אילו תנאים מתאימים ביותר לחקר FTSC של מקור חיידקי ספציפי המבוסס על משקעים, פיזור אור והידרוליזה של GTP. הטכניקה המוצגת כאן קלה לביצוע בכל מעבדה ותספק מושג מהיר על יכולות הפילמור של FT a z ספציפי. אנו מוצאים כי הבחירה של המאגר הנכון חשובה במיוחד כאשר עובדים עם FTAZ בנוכחות חלבונים אחרים המדגימים את הטכניקה תהיה זחילת EVA, סטודנט לתואר שני מהמעבדה שלי.

כדי להתחיל, הוסף חמישה מיקרוליטרים של 100 מילי-מולרי מגנזיום כלוריד, ו-12 מיקרו-מולרי של חלבוני החיידקים, FDSC ו/או SEP F לאחד ממאגרי הפילמור שנבחרו בעלי ערכי pH והרכבים שונים כמתואר בפרוטוקול הטקסט הנלווה. לאחר מכן, הכניסו את הצינורות לאינקובטור עם פונקציית ניעור ודגרו את הדגימות למשך שתי דקות בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס ו-300 סל"ד. לאחר שהצינורות עורבבו היטב, התחל בפילמור על ידי הוספת מיקרוליטר אחד של תערובת GTP או GDP מתמיסת מלאי של 100 מילימולר כך שהריכוז הסופי יהיה שני מילימולר.

לאחר מכן הכניסו את הדגימות בחזרה לחממה הרועדת למשך 20 דקות נוספות. לאחר מכן, סובב את הצינורות בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות ב-20,000 סל"ד באמצעות רוטור TLA 55 או שווה ערך ל-24, 600 Gs אם משתמשים במשהו אחר. לאחר שהצנטריפוגה הסתיימה, העבירו את הסופרנטנטים לצינורות נקיים ושמרו את הכדורים למועד מאוחר יותר.

קח 20 מיקרוליטר מהסופרנטנטים המועברים וערבב אותם בצינור נפרד עם 20 מיקרוליטר של מאגר דגימה מרוכז פי שניים. מהדקים את הכובעים ומרתיחים את הדגימות במשך 10 דקות בחום של 98 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, הוסף 50 מיקרוליטר של מאגר דגימה מרוכז פי 2 לכל שבר גלולה שהונח בעבר והשהה את הפולימרים על ידי הרתחת הדגימות למשך 10 דקות ב-98 מעלות צלזיוס.

לאחר שהדגימות סיימו לרתוח, הוסיפו עוד 50 מיקרוליטר של מים דה-מינרליים לצינורות המכילים את הכדורים. לאחר מכן, טען 10 מיקרוליטר הן של הסופרנטנטים והן של הכדורים מכל דגימה זה לצד זה על ג'ל דף SDS של 10% והפעל את הג'ל ב-150 וולט. לאחר השלמת הג'ל, הסר את הג'ל והכתים אותו בכחול מבריק קומאסי G 2 50.

לאחר מכן דמיין את הג'ל וכימת את החלבון באמצעות ציטומטריה כמתואר בפרוטוקול הטקסט הנלווה. ראשית הפעל ספקטרומטר פלורסנט ואפשר למנורה להתחמם במשך מספר דקות כדי למנוע תנודות תרמיות. כמו כן, הפעל אמבט מים במחזור והגדר את טמפרטורת המים ל-30 מעלות צלזיוס כדי לשמור על תא הווט בטמפרטורה קבועה.

כאשר המערכת מתחממת, הגדר את פרמטרי ההפעלה של הספקטרומטר. הגדר את המתח הגבוה של הגלאי ל-300 וולט ואת אורכי הגל של הפליטה והעירור ל-350 ננומטר עם רוחב חריץ של ארבעה ננומטר. לאחר מכן תכנת את פרוטוקול רכישת הנתונים על ידי בחירת רכישה מבוססת זמן עם משך של 3, 600 שניות.

נקו בזהירות ווט פלואורסצנטי של 200 מיקרוליטר באורך נתיב של סנטימטר אחד על ידי זנות בתמיסת ניקוי באמבט מים למשך חמש דקות. לאחר מכן, הכינו 294 מיקרוליטר של תערובת מאסטר עבור כל אחד מתשעת מאגרי הפילמור המתוארים בפרוטוקול הטקסט הנלווה, כל אחד עם 10 מילי-מולרי מגנזיום כלוריד, ו-12 מיקרו-מולרי FDSE כריכוזים הסופיים המחושבים עבור 300 מיקרוליטר. ואז מערבולת קצרה התערובות מעבירות 196 מיקרוליטר של מאגר הפילמור הראשון לווטרינר.

מניחים אותו בספקטרומטר ומדגרים למשך שתי דקות כדי להביא את טמפרטורת הדגימה עד 30 מעלות צלזיוס. לאחר שתי דקות, התחל את רכישת הנתונים והמתן 90 שניות כדי לוודא שהאות יציב. לאחר מכן הוסף ארבעה מיקרוליטר של 100 מילי-מולרי GTP או תמ"ג.

ערבב את הדגימה והמשך באיסוף הנתונים במשך שעה שלמה. חזור על שלבים אלה עבור כל מאגר שמופיע ברשימה. הכן 1.5 מיליליטר של שני מילי-מולרי GTP במאגר פילמור נבחר.

הכן גם דילול סטנדרטי של פוספט בטווח של אפס עד 40 מיקרומולר באותו מאגר. לאחר מכן, הכינו מגיב עבודה ירוק מלכיט כמתואר בערכת הבדיקות הביולוגיות. לאחר מכן הרכיבו ארבע תערובות מאסטר בנפח כולל כל אחת של 360 מיקרוליטר מאסטר מיקס אחד מכיל FDSZ שמקורו ב-B subtilis ותערובת מאסטר שתיים מכילה FDSE שמקורו ב-e coli.

תערובות מאסטר 3 ו-4 משמשות כבקרות ומכילות EDTA במקום מגנזיום כלוריד. לאחר מכן פיפטה 20 מיקרוליטר של תערובות המאסטר ותקני הפוספט. בצלחת באר A-Q-P-C-R 96 כך שיש 16 בארות לכל תערובת מאסטר ותקני הפוספט מסודרים כפי שמוצג כאן.

פיפטה 180 מיקרוליטר של מלאי GTP של שני מילימולר לנתיב האחרון של הצלחת. לאחר מכן הנח את הצלחת במכונת PCR. הפעל תוכנית עם מחזור יחיד המוגדר ל-30 מעלות צלזיוס למשך 40 דקות.

בפיפטה שנייה של 96 בארות, 20 מיקרוליטר של מגיב העבודה הירוק מלכיט לבארות, A אחד עד H 10. ואז ב-60 מיקרוליטר של מאגר הפילמור מהניסוי טוען A אחד עד H שמונה, לאחר מכן ב-20 מיקרוליטר של תמיסת GTP של שני מילי-מולרים לבארות בכל נתיב של צלחת. אחד במרווחים שנקבעו מראש כפי שמוצג כאן כדי לבחון את התגובה בנקודות זמן שונות.

מצננים את התערובות למעלה ולמטה כדי לערבב אותן לאחר 30 דקות, החל מנתיב אחד בצלחת אחת, מעבירים 20 מיקרוליטר מנתיב אחד של צלחת אחת לנתיב אחד של צלחת שתיים ופיפטה למעלה ולמטה לערבב. זוהי נקודת ההתחלה של התפתחות צבע ירוק מלכיט לתגובה של 30 דקות לאחר 30 וחצי דקות, להעביר 20 מיקרוליטר מנתיב שתיים של צלחת אחת לנתיב שתיים של צלחת שתיים ולערבב. זוהי נקודת ההתחלה של התפתחות הצבע הירוק מלכיט לתגובה של 20 דקות.

חזור על שלבים אלה עם הנתיבים הנותרים 3 עד 7 במרווחים 32 לאחר 33 וחצי דקות ב-20 מיקרוליטר GTP לנתיב שמונה בלוח הראשון ולערבב. לאחר מכן מעבירים 20 מיקרוליטר לנתיב שמונה בצלחת השנייה ומערבבים. זה מייצג את תגובת דקה האפס והיא נקודת הזמן ההתחלתית להתפתחות צבע ירוק מלכיט.

לאחר 34 דקות, הוסף 80 מיקרוליטר מנתיב תשע של צלחת אחת המכיל את תקן הפוספט לנתיב תשע של צלחת שתיים וערבב לאחר 34 וחצי דקות, העביר 80 מיקרוליטר מתקן הפוספט השני בנתיב 10 של הצלחת הראשונה לנתיב 10 בצלחת השנייה וערבב. לאחר מכן הסר את כל בועות האוויר מהדגימות ודגר את הצלחת בטמפרטורת החדר למשך 25 וחצי דקות נוספות. לאחר הדגירה.

הנח את הצלחת בקורא צלחות 96 באר החל מ-60 דקות מתחילת הניסוי. מדוד את הצלחת ב-630 ננומטר כל 30 שניות למשך חמש דקות כך שיילקחו 10 נקודות זמן. מדידת הלוח הראשונה תתאים לנתיב הראשון, השנייה לנתיב השני, וכך לכל נתיב היה בדיוק אותו זמן להתפתחות הצבע הירוק של המלכיט.

לאחר מכן, חשב את הפוספט החופשי בכל דגימה באמצעות עקומת הכיול הסטנדרטית של הפוספט ושרטט את הנתונים כשחרור פוספט לאורך זמן. לאחר מכן חשב את פעילות ההידרוליזה F-D-S-Z-G-T-P מהטווח הליניארי של העקומה. מוצגים כאן אחוז ה-SEP F וה-FDSZ בכדורי הדגימות.

FDSZ התגלה בגלולה מעל רמות הרקע רק כאשר גם SEP F וגם GTP היו נוכחים בדגימה. הסטוכיומטריה המדויקת של SEPPE ו-FDSZ בצינורות אלה אינה ידועה, אך תוצאות אלה מצביעות על כך שיש יותר ספה מאשר FDSZ. פיזור אור של FDSZ מ-B subtilis ו-e coli מוצג כאן, מורכב בנוכחות שני GTP מילי-מולרי במאגר אשלגן כלורי של 50 מילי-מולרי.

F-D-S-E-B-S נותן אות פיזור אור גבוה פי 20 עד 40 מאשר FDSC EC בהתאם ל-pH של המאגר. מעניין שהגדלת ריכוז האשלגן הכלורי במאגר לא השפיעה באופן משמעותי על אות פיזור האור של F-D-S-Z-E-C, אך האות של F-T-S-Z-B-S ירד פי 80 ב-pH 7.5 פי 30 ב-pH 6.8 ופי 45 ב-pH 6.5 ב-300 מילי-מולרי אשלגן כלורי בהשוואה למאגרים עם 50 מילי-מולרי אשלגן כלורי. פעילות ההידרוליזה GTP של FDSZ נמדדה בתנאי חיץ שונים באמצעות בדיקה קולורימטרית לפוספט חופשי.

נמצא כי פעילות ה-GTPS של FT SZ גדלה עם הגדלת ריכוז האשלגן הכלורי בכל אחד מתנאי ה-pH השונים. ב-50 מילי-מולרי אשלגן כלורי, פעילות ה-gtpa הופחתה עקב צרור של חוטי F-D-S-Z-B-S ב-50 מילי-מולאר. לאשלגן כלורי FDSZ EEC הייתה פעילות GTPS גבוהה פי שלושה עד שישה מאשר F-D-S-Z-B-S עקב פירוק מהיר יותר של פולימרי FDSC EEC.

לבסוף, ההבדל בפעילות ההידרוליזה של GTP בין F-D-S-Z-B-S ו-F-D-S-Z-E-C הצטמצם ב-300 מילי-מולרי אשלגן כלורי, אולי בגלל צרור מופחת של חוטי F-D-S-Z-B-S. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע מתכות אחרות כמו אלקטרומיקרוסקופיה על מנת לענות על שאלות נוספות הנוגעות למבנה פולימרי fts בדגימה.