Name: FtsZ פלמור מבחני: פרוטוקולים ושיקולים פשוטים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 4 s
Description: למדו פרוטוקולים לניטור פולימריזציה של FtsZ בחיידקים באמצעות מיורי שקיעה, פיזור אור והידרוליזת GTP. שיטות אלו מאפשרות לחוקרים לבחון פעילות חלבונית ולפתח אסטרטגיות אנטיבקטריאליות חדשות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

העבודה במעבדה שלנו ממומנת על ידי מענק VIDI מהארגון ההולנדי למחקר מדעי (ל-DJS). 
אנו מודים למארק סטיוארט ולמחלקה למיקרוסקופיה אלקטרונית באוניברסיטה שלנו, על הסיוע והגישה למיקרוסקופ אלקטרוני השידור.

<ol><li>Haydon, D. J., Stokes, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+inhibitor+of+FtsZ+with+potent+and+selective+anti-staphylococcal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">An inhibitor of FtsZ with potent and selective anti-staphylococcal activity.</a> Science. 321 (5896), 1673-1675 (2008).</li>
<li>Adams, D. W., Errington, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+cell+division%3A+assembly%2C+maintenance+and+disassembly+of+the+Z+ring%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Bacterial cell division: assembly, maintenance and disassembly of the Z ring.</a> Nat. Rev. Microbiol. 7 (9), 642-653 (2009).</li>
<li>Erickson, H. P., Anderson, D. E., Osawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FtsZ+in+bacterial+cytokinesis%3A+cytoskeleton+and+force+generator+all+in+one%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol.+Mol.+Biol.+Rev%22%5BJournal%5D)">FtsZ in bacterial cytokinesis: cytoskeleton and force generator all in one.</a> Microbiol. Mol. Biol. Rev. 74 (4), 504-528 (2010).</li>
<li>Li, Z., Trimble, M. J., Brun, Y. V., Jensen, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+FtsZ+filaments+in+vivo+suggests+a+force-generating+role+in+cell+division%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">The structure of FtsZ filaments in vivo suggests a force-generating role in cell division.</a> EMBO J. 26 (22), 4694-4708 (2007).</li>
<li>Król, E., van Kessel, S. P., van Bezouwen, L. S., Kumar, N., Boekema, E. J., Scheffers, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacillus+subtilis+SepF+binds+to+the+C-terminus+of+FtsZ%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Bacillus subtilis SepF binds to the C-terminus of FtsZ.</a> PLoS One. 7 (8), e43293(2012).</li>
<li>Singh, J. K., Makde, R. D., Kumar, V., Panda, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SepF+increases+the+assembly+and+bundling+of+FtsZ+polymers+and+stabilizes+FtsZ+protofilaments+by+binding+along+its+length%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">SepF increases the assembly and bundling of FtsZ polymers and stabilizes FtsZ protofilaments by binding along its length.</a> J. Biol. Chem. 283 (45), 31116-31124 (2008).</li>
<li>Gündoğdu, M. E., Kawai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+ring+polymers+align+FtsZ+polymers+for+normal+septum+formation%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Large ring polymers align FtsZ polymers for normal septum formation.</a> EMBO J. 30 (3), 617-626 (2011).</li>
<li>Pacheco-Gomez, R., Roper, D. I., Dafforn, T. R., Rodger, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pH+dependence+of+polymerization+and+bundling+by+the+essential+bacterial+cytoskeletal+protein+FtsZ%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The pH dependence of polymerization and bundling by the essential bacterial cytoskeletal protein FtsZ.</a> PLoS One. 6 (6), e19369(2011).</li>
<li>Mendieta, J., Rico, A. I., Lopez-Vinas, E., Vicente, M., Mingorance, J., Gomez-Puertas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+functional+model+for+ionic+%28K%28%2B%29%2FNa%28%2B%29%29+and+pH+dependence+of+GTPase+activity+and+polymerization+of+FtsZ%2C+the+prokaryotic+ortholog+of+tubulin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Structural and functional model for ionic (K(+)/Na(+)) and pH dependence of GTPase activity and polymerization of FtsZ, the prokaryotic ortholog of tubulin.</a> J. Mol. Biol. 390 (1), 17-25 (2009).</li>
<li>Tadros, M., Gonzalez, J. M., Rivas, G., Vicente, M., Mingorance, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+the+Escherichia+coli+cell+division+protein+FtsZ+by+a+low-affinity+interaction+with+monovalent+cations%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Activation of the Escherichia coli cell division protein FtsZ by a low-affinity interaction with monovalent cations.</a> FEBS Lett. 580 (20), 4941-4946 (2006).</li>
<li>Scheffers, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+MinC+on+FtsZ+polymerization+is+pH+dependent+and+can+be+counteracted+by+ZapA%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">The effect of MinC on FtsZ polymerization is pH dependent and can be counteracted by ZapA.</a> FEBS Lett. 582 (17), 2601-2608 (2008).</li>
<li>Mukherjee, A., Lutkenhaus, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+FtsZ+assembly+by+light+scattering+and+determination+of+the+role+of+divalent+metal+cations%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Analysis of FtsZ assembly by light scattering and determination of the role of divalent metal cations.</a> J. Bacteriol. 181 (3), 823-832 (1999).</li>
<li>Chen, Y., Erickson, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+in+vitro+assembly+dynamics+and+subunit+turnover+of+FtsZ+demonstrated+by+fluorescence+resonance+energy+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Rapid in vitro assembly dynamics and subunit turnover of FtsZ demonstrated by fluorescence resonance energy transfer.</a> J. Biol. Chem. 280 (23), 22549-22554 (2005).</li>
<li>Hou, S., Wieczorek, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Caulobacter+crescentus+FtsZ+protein+using+dynamic+light+scattering%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Characterization of Caulobacter crescentus FtsZ protein using dynamic light scattering.</a> J. Biol. Chem. 287 (28), 23878-23886 (2012).</li>
<li>Mukherjee, A., Lutkenhaus, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+assembly+of+FtsZ+regulated+by+GTP+hydrolysis%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Dynamic assembly of FtsZ regulated by GTP hydrolysis.</a> EMBO J. 17 (2), 462-469 (1998).</li>
<li>Lanzetta, P. A., Alvarez, L. J., Reinach, P. S., Candia, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+assay+for+nanomole+amounts+of+inorganic+phosphate%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">An improved assay for nanomole amounts of inorganic phosphate.</a> Anal. Biochem. 100 (1), 95-97 (1979).</li>
<li>Ray, S., Kumar, A., Panda, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GTP+regulates+the+interaction+between+MciZ+and+FtsZ%3A+a+possible+role+of+MciZ+in+bacterial+cell+division%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">GTP regulates the interaction between MciZ and FtsZ: a possible role of MciZ in bacterial cell division.</a> Biochemistry. 52 (2), 392-401 (2013).</li>
<li>Rivas, G., Lopez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnesium-induced+linear+self-association+of+the+FtsZ+bacterial+cell+division+protein+monomer.+The+primary+steps+for+FtsZ+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Magnesium-induced linear self-association of the FtsZ bacterial cell division protein monomer. The primary steps for FtsZ assembly.</a> J. Biol. Chem. 275 (16), 11740-11749 (2000).</li>
<li>Oliva, M. A., Cordell, S. C., Lowe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+insights+into+FtsZ+protofilament+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Structural insights into FtsZ protofilament formation.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 11 (12), 1243-1250 (2004).</li>
<li>Lowe, J., Amos, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+bacterial+cell-division+protein+FtsZ%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the bacterial cell-division protein FtsZ.</a> Nature. 391 (6663), 203-206 (1998).</li>
<li>Cordell, S. C., Robinson, E. J., Lowe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+SOS+cell+division+inhibitor+SulA+and+in+complex+with+FtsZ%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the SOS cell division inhibitor SulA and in complex with FtsZ.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (13), 7889-7894 (2003).</li>
<li>Chen, Y., Anderson, D. E., Rajagopalan, M., Erickson, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+dynamics+of+Mycobacterium+tuberculosis+FtsZ%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Assembly dynamics of Mycobacterium tuberculosis FtsZ.</a> J. Biol. Chem. 282 (38), 27736-27743 (2007).</li>
<li>White, E. L., Ross, L. J., Reynolds, R. C., Seitz, L. E., Moore, G. D., Borhani, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slow+polymerization+of+Mycobacterium+tuberculosis+FtsZ%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Slow polymerization of Mycobacterium tuberculosis FtsZ.</a> J. Bacteriol. 182 (14), 4028-4034 (2000).</li>
<li>Oliva, M. A., Trambaiolo, D., Lowe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+insights+into+the+conformational+variability+of+FtsZ%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Structural insights into the conformational variability of FtsZ.</a> J. Mol. Biol. 373 (5), 1229-1242 (2007).</li>
<li>Thanbichler, M., Shapiro, L. M. ipZ. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+spatial+regulator+coordinating+chromosome+segregation+with+cell+division+in+Caulobacter%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">a spatial regulator coordinating chromosome segregation with cell division in Caulobacter.</a> Cell. 126 (1), 147-162 (2006).</li>
<li>Buske, P. J., Levin, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extreme+C+terminus+of+bacterial+cytoskeletal+protein+FtsZ+plays+fundamental+role+in+assembly+independent+of+modulatory+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Extreme C terminus of bacterial cytoskeletal protein FtsZ plays fundamental role in assembly independent of modulatory proteins.</a> J. Biol. Chem. 287 (14), 10945-10957 (2012).</li>
<li>Mukherjee, A., Lutkenhaus, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+FtsZ+assembly+by+light+scattering+and+determination+of+the+role+of+divalent+metal+cations%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Analysis of FtsZ assembly by light scattering and determination of the role of divalent metal cations.</a> J. Bacteriol. 181 (3), 823-832 (1999).</li>
</ol>

לא הוכרז על ניגוד עניינים.

אנו מתארים סט של שיטות המאפשרות ניתוח מהיר של פעילות FtsZ והאינטראקציה שלה עם חלבונים אחרים. פיזור אור, שקיעה ומבחני GTPase כמו גם מיקרוסקופ אלקטרונים היו בשימוש נרחב לחקר פילמור FtsZ. ביצענו כמה שיפורים בפרוטוקולים הקיימים, הראינו את ההשפעה של תנאים שונים על הרכבת FtsZ, ואנו מציעים בקרות שיש לכלול במחקרי FtsZ.
אנו מציגים צנטריפוגה במהירות נמוכה כדי להבחין בין מבנים גדולים שנוצרו על ידי הקשר בין FtsZ וחלבוני האינטראקציה שלו מפולימרים FtsZ. שיטה זו מציגה שני יתרונות על פני מבחן השיקוע הסטנדרטי. ראשית, לא נוצר רקע על ידי פולימרי FtsZ בשבר הגלולה מכיוון שהם אינם מסובבים כלפי מטה ב-24,600 x גרם. שנית, ניתן לחשב את כמות ה-FtsZ הקיימת במבנה שנוצר עם חלבון מקיים אינטראקציה מהג'ל. שני שלבים קריטיים בשיטה זו הם זמן הדגירה וריכוז ה-GTP. חשוב לצנטריפוגה את מבנה החלבון הגדול כשהוא הושלם, אך לפני שהוא מתפרק כאשר כל ה-GTP עובר הידרוליזה. הבקרה הטובה ביותר למחקר זה היא פילמור של FtsZ עם תמ"ג. יש מגבלה פוטנציאלית אחת של הבדיקה. FtsZ יוצר קומפלקס יציב עם SepF, שניתן לסובב בקלות ב-24,600 x גרם. אם מתבצעת שקיעה עם מפעיל אחר או תרופה המאגדת פולימרים FtsZ, ייתכן שיהיה צורך להתאים את הבדיקה. ניתן לעשות זאת על ידי שינוי זמן הדגירה, או הגדלת מהירות הצנטריפוגה.
הכנה נכונה של הדגימה היא החשובה ביותר לניסויי פיזור אור. יש לנקות חלבונים מראש על ידי סיבוב ויש לסנן את כל המאגרים לפני השימוש. אם קיימים אגרגטים כלשהם בדגימה, הם ישבשו אות יציב המתקבל מפולימרים FtsZ. לניתוח מבני FtsZ על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים, הכנת רשת היא הצעד העיקרי. זמן הדגירה של הדגימה על הרשת ישפיע על ייצור פולימרים דחוסים פחות או יותר. עבור צרורות של FtsZBs, זמן הדגירה חייב להיות קצר יותר מאשר עבור FtsZEc ו-FtsZBs בריכוז KCl גבוה. השתמשנו בריכוז של 12 מיקרומטר עבור כל דגימה כדי שנוכל להשוות את התוצאות. עם זאת, עבור FtsZBs ב-50 מ"מ KCl יש להשתמש בריכוז FtsZ נמוך יותר, מכיוון ש-12 מיקרומטר הביא לרוויה מלאה של הרשת. זה הופך את הפולימרים לדחוסים מאוד וקשים לזיהוי. עדיף לזהות פולימרים פחות דחוסים ב- EM.
בדיקת GTPase היא הניסוי היחיד המשמש לחקר הפעילות ולא המבנים של FtsZ. Mg2+ נחוץ לתחלופת GTP בפולימרים FtsZ. לפיכך, בהיעדר Mg2+, FtsZ אינו מבצע הידרוליזה של GTP. לכן, דגימה ללא Mg2+ היא הבקרה הנכונה בבדיקה זו, אך קטיונים של Mg קיימים במאגר האחסון של FtsZ. ניתן להסיר אותם על ידי תוספת של 1 מ"מ EDTA לדגימת הבקרה. השלב הקריטי בבדיקה זו הוא זמן הדגירה. חשוב להפסיק את פעילות ה-FtsZ לאחר זמן נתון. זה מושג על ידי העברת דגימת ה-FtsZ לתמיסה ירוקה מלכיט בצלחת של 96 בארות. עם זאת, התפתחות הצבע הירוק של המלכיט היא תהליך מתמשך. לפיכך, יש לבצע את המדידות בו זמנית עבור כל דגימה. באמצעות פרוטוקול תוספת GTP מתוכנן היטב עם מדידות שנלקחו כל 30 שניות זו מזו בסדר קבוע, ניתן לקבל את אותו זמן דגירה וטיפול בדגימה עבור כל נקודת זמן. שלב קריטי נוסף הוא בחירת ריכוז החלבון לניסוי. בניסוי השתמשנו בשני ריכוזים שונים עבור FtsZEc ו-FtsZBs. הידרוליזה של GTP מהירה בהרבה עבור FtsZEc בהשוואה ל-FtsZBs. פעילות ה-GTPase של FtsZEc בתנאים נבחרים וב-12 מיקרומטר היא ליניארית רק למשך 5 דקות לכל היותר ולאחר זמן זה קצב ההידרוליזה מתייצב. לפיכך, קשה לפרש נתונים מהניסוי כאשר הם מבוצעים בתנאים אלה. במקרה זה יש להשתמש ב-FtsZEc בריכוז נמוך יותר מ-FtsZBs כדי להיות מסוגל להשוות את הפעילויות של שני החלבונים. פעילות GTPase של FtsZs ממקורות שונים עשויה להשתנות. לפיכך, יש לבחור את הריכוז הנכון. הריכוז לפילמור FtsZ צריך להיות הרבה מעל הריכוז הקריטי (באופן כללי בין 2.5-10 מיקרומטר). הדינמיקה של הרכבה ופירוק של FtsZ חשובה גם היא. חלק מהחלבונים מראים פיגור משמעותי בפילמור לאחר הוספת GTP, כפי שמוצג עבור FtsZBs ב-50 מ"מ KCl. כדאי לבצע את בדיקת פיזור האור לפני בדיקת GTPase כדי להעריך את זמן ההרכבה והפירוק של פולימרי FtsZ. לאחר מכן, ניתן לבחור את זמן הדגירה וריכוז החלבון. מכיוון שהתנאים שנבחרו לפילמור FtsZ הם קריטיים, חשוב להשתמש בריכוז ה-pH וה-KCl הנכונים בכל שיטה. בעבודה זו חקרנו 9 חוצצים שונים עם pH שנע בין 6.5-7.5 וריכוזי KCl מ-0 מ' עד 300 מ"מ. שמנו לב שהמצב הטוב ביותר לניתוח FtsZs מ-B. subtilis ו-E.coli והפעילות הביולוגית שלהם הוא ב-pH הקרוב לרמה הפיזיולוגית (7.5) יחד עם ריכוז KCl גבוה. בריכוז KCl גבוה, ל-FtsZ יש פעילות GTPase גבוהה יותר ומייצר פולימרים הניתנים לזיהוי טוב יותר על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים. אישרנו גם כי ה-pH הפיזיולוגי וריכוז KCl גבוה טובים יותר לחקר האינטראקציה בין FtsZ לחלבונים רגולטוריים מאשר כל חוצץ אחר המשמש בעיקר לחקר הרכבת FtsZ. FtsZBs מראה פעילות דומה ל-FtsZEc כאשר נחקר בריכוז KCl גבוה. בנוסף, בריכוז מלח נמוך השפעת ה-pH ניכרת יותר מאשר במאגרים עם ריכוז מלח גבוה. FtsZ לפעמים משקע בעת שימוש במאגרים ללא KCl, כתוצאה מכך יש להימנע ממאגרים ללא מלח. שקיעה של פולימרים FtsZ נמוכה בעת שימוש במאגרים עם ריכוזי KCl גבוהים. זה עשוי להיות יתרון כאשר חוקרים אינטראקציות בין FtsZ לחלבונים המרכיבים חוטי FtsZ כגון SepF ו-ZapA מכיוון שקל לזהות מבנים מסדר גבוה יותר אלה באמצעות צנטריפוגה. בכל הניסויים שלנו השתמשנו ב-MgCl2 בריכוז של 10 מילימטר. הוכח כי ריכוז גבוה יחסית של Mg2+ מייצב פולימרים FtsZ ומפחית את פעילות ה-GTPase של FtsZ. בטבלה 2 מסכמים תוצאות ממחקרים שונים המתארות פילמור FtsZ ופעילות GTPase בריכוזים שונים של Mg2+ תוך שימוש בתנאי חיץ זהים אחרת 27. הריכוז הנמדד של Mg2+ ציטופלזמי חופשי הוא 0.9 מ"מ3. יש לשים לב ש-GTP יבצע כמות שווה ערך של Mg2+. לפיכך, הריכוז האופטימלי של Mg2+ לניסויי GTPase הוא בסביבות 2-2.5 מ"מ, שהוא קרוב לרמה פיזיולוגית3. עם זאת, בניסויים שלנו השתמשנו ב-MgCl2 בריכוז של 10 מ"מ כדי להשיג אות פיזור אור הניתן לזיהוי בקלות ולייצב פולימרים של FtsZ במהלך בדיקת השיקוע.
אף על פי שהחלנו את הפרוטוקולים שלנו על FtsZ מאורגניזמי המודל E. coli ו-B. subtilis, הם יכולים להיות מותאמים ל-FtsZ מכל אורגניזם אחר. יש לציין כי ה-pH הפיזיולוגי, והריכוזים של קטיונים חד-ערכיים ודו-ערכיים שונים בין אורגניזמים. לפיכך, התנאים האופטימליים לפילמור FtsZ עשויים להשתנות. הבדלים בזמן ההכפלה ובתנאי הגידול של חיידקים שונים עשויים לגרום לקינטיקה שונה של הרכבה של FtsZ ולתנאים אופטימליים של הניסויים. אולם הפרוטוקול שלנו מספק נקודת התחלה טובה לניסויים עם FtsZs מאורגניזמים אחרים. הפרוטוקולים צריכים להיות שימושיים לחקר FtsZ עם חלבונים רגולטוריים או לחקר ההשפעות של תרכובות ותרופות קטנות על FtsZ.
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>מקור</td>
			<td>פילמור [% מ-FtsZ משוקע]</td>
			<td>GTPase [Pi/FtsZ/min]</td>
			<td>ריכוז מ"ג2+ [מ"מ]</td>
			<td>ריכוז FtsZ [μM]</td>
			<td>הפניות</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FtsZEC</td>
			<td>~ 28%</td>
			<td>~ 2.1</td>
			<td>10</td>
			<td>12</td>
			<td>עבודה זו</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>~ 50%</td>
			<td>~ 2.4</td>
			<td>10</td>
			<td>12.5</td>
			<td>27</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>~ 43%</td>
			<td>~ 3.5</td>
			<td>5</td>
			<td>12.5</td>
			<td>27</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>~ 27%</td>
			<td>~ 4.6</td>
			<td>2.5</td>
			<td>12.5</td>
			<td>27</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>נ.ד</td>
			<td>~ 5.4</td>
			<td>2.5</td>
			<td>5</td>
			<td>26</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FtsZBs</td>
			<td>~ 30%</td>
			<td>~ 0.8</td>
			<td></td>
			<td>12</td>
			<td>עבודה זו</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>~ 52% (עם דקסטרן DEAE)</td>
			<td>~ 0.5</td>
			<td>10</td>
			<td>10</td>
			<td>11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>נ.ד</td>
			<td>~ 2.25</td>
			<td>2.5</td>
			<td>5</td>
			<td>26</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
טבלה 2. השפעה על Mg2+ על פילמור FtsZ ו-GTPase. תוצאות מעבודה זו בהשוואה לנתונים שפורסמו. כל הניסויים בוצעו ב-50 מ"מ MES/NaOH, pH=6.5, 50 מ"מ KCl.

החלבון החיידקי החיוני FtsZ הוא החלבון המאופיין בצורה הטובה ביותר של מנגנון חלוקת תאי החיידקים. FtsZ הוא ההומולוג הפרוקריוטי של טובולין ומתפלמר במבחנה באופן תלוי GTP. FtsZ הוא יעד אטרקטיבי מאוד לאנטיביוטיקה חדשה בשל אופיו השמור והייחודיות שלו לחיידקים1,2. בתחילת חלוקת התא, FtsZ יוצר טבעת ציטוקינטית באמצע התא, המשמשת כפיגום להרכבה של חלבוני חלוקת תאים אחרים. היווצרות טבעת ה- Z חיונית ללוקליזציה נכונה של מישור החלוקה. דינמיקת ההרכבה של FtsZ מווסתת על ידי מספר חלבונים נלווים, כגון (תלוי במין החיידקים) MinC, SepF, ZapA, UgtP ו-EzrA2. פילמור FtsZ נחקר באופן אינטנסיבי במבחנה ותוארו מבנים רבים ושונים כולל פרוטופילמנטים ישרים, פרוטופילמנטים מעוקלים, יריעות חוטים, צרורות חוטים וצינורות חוטים בהתאם למאגר ההרכבה, הנוקלאוטיד וחלבונים נוספים הכלולים בבדיקה3. הארכיטקטורה של פרוטופילמנטים של FtsZ in vivo עדיין לא מובנת במלואה, אם כי ניסויי קריוטומוגרפיה אלקטרונית ב-Caulobacter crescentus מצביעים על כך שטבעת ה-Z מורכבת מפרופילמנטים בודדים קצרים יחסית ולא רציפים ללא צרור נרחב4.
במבחנה, תכונות הפילמור של FtsZ והאינטראקציה של FtsZ עם חלבונים רגולטוריים רגישות להרכב מאגר התגובה. לדוגמה, תיארנו לאחרונה את אתר האינטראקציה עבור SepF במסוף FtsZ C והראינו כי חיתוך FtsZBs∆16 C-terminal כבר לא נקשר ל-SepF5. במחקר קודם על האינטראקציה בין SepF-FtsZBs, קטום דומה של FtsZBs∆16 עדיין משקע יחד עם SepF, מה שהציע ש-SepF נקשר לאתר משני ב-FtsZ6. ההבדל בין מחקרים אלה היה הרכב חוצצי התגובה - ב-pH 7.5 לא הייתה קו-סקצנציה של SepF עם קטום FtsZ, בעוד שב-pH 6.5 הייתה קו-סקציה. Gündoğdu et al. ציין כי SepF אינו מתפקד ומשקע ב-pH 6.57, מה שמראה כי הקו-שקיעה שנצפתה ב-pH 6.5 עשויה להיגרם על ידי משקעים של SepF ולא על ידי אינטראקציה עם קטום FtsZBs∆16 C-terminal. השפעת ריכוז ה-pH וה-KCl על הפילמור של FtsZ נבדקה בעבר. פולימרים של E. coli FtsZ (FtsZEc) ב-pH 6.5 ארוכים ושופעים יותר מאלה שנוצרו ב-pHניטרלי 8,9. טדרוס ואחרים. חקרו את הפילמור של FtsZEc בנוכחות קטיונים חד-ערכיים, וציינו כי קשירת K+ קשורה לפילמור FtsZEc והיא חיונית לפעילות FtsZ10. ה-pH הוא קריטי יותר כאשר נחקרת האינטראקציה של FtsZ עם חלבונים אחרים, כפי שמוצג בדוגמה הקודמת של SepF, ותלות ה-pH של ההשפעה המעכבת של MinC על FtsZ11. מכיוון שגם pH וגם ריכוז המלח עשויים להשפיע על האינטראקציה של FtsZ עם חלבונים אחרים, חשוב לבחור את התנאים והבקרות הנכונים למחקרי הפילמור של FtsZ.
כאן אנו מתארים פרוטוקולים לחקר פילמור FtsZ ופעילות GTPase על ידי פיזור אור, מיקרוסקופ אלקטרונים, שקיעה ומבחני GTPase. פיזור אור בזווית ישרה הוא שיטה סטנדרטית לחקר פילמור FtsZ בזמן אמת12. הכנסנו כמה שיפורים לבדיקת המשקעים ו-GTPase. אנו מציגים בפירוט כיצד להכין דגימות לפיזור אור ומיקרוסקופ אלקטרונים. נבדקו מספר חוצצים המשמשים בספרות לחקר פילמור FtsZ ואנו מתארים את התנאים הטובים ביותר לכל ניסוי. אנו גם מראים אילו בקרות יש להציג כדי להשיג את הנתונים הטובים ביותר.
שיטות אלו מאפשרות מחקר מהיר של פילמור, פעילות ואינטראקציה עם חלבונים אחרים באמצעות שיטות וציוד פשוטים הזמינים ברוב המעבדות. קיימות שיטות מתוחכמות יותר לחקר פילמור FtsZ אך לעתים קרובות דורשות גישה לציוד מיוחד יותר, ו/או שינוי של FtsZ עם תוויות פלואורסצנטיות8,13,14. השיטות הפשוטות המתוארות במאמר זה מודגמות באמצעות FtsZ מ-B. subtilis ו-E. coli, האורגניזמים הנפוצים ביותר במודל Gram+ ו-Gram-. ניתן להתאים את הפרוטוקולים לכל חלבון FtsZ אחר. בהתבסס על בדיקות ראשוניות עם FtsZs חדשים אלה, ייתכן שיהיה צורך בשינויים קלים לגבי זמן, חיץ או טמפרטורת הדגירה לתוצאה אופטימלית. הניסויים המתוארים כאן אמורים לסייע במציאת התנאים האופטימליים הללו.

<table><tbody><tr><td>GTP</td><td>Roche</td><td>10106399001</td><td>חלק 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7</td></tr><tr><td>צינורות פוליקרבונט עבי דופן</td><td>בקמן קולטר</td><td>343776</td><td>חלק 2</td></tr><tr><td>אופטימה MAX-XP אולטרה-צנטריפוגה</td><td>בקמן קולטר</td><td></td><td>393315 חלק 2, 3</td></tr><tr><td>צינור פוליאלומר עם כובע הצמדה</td><td>בקמן קולטר</td><td>357448</td><td>חלק 3</td></tr><tr><td>חבילה ביולוגית AIDA, 1D, 2D,</td><td>FL Raytest Isotopenmessger&auml; te GmbH</td><td>15000001</td><td>חלק 4</td></tr><tr><td>מנתח תמונות זוהר LAS-4000</td><td>Fujifilm</td><td></td><td>חלק 4</td></tr><tr><td>ספקטרומטר תרמו-ספקטרוני AMINCO-Bowman ספקטרומטר זוהר</td><td>מכשירים</td><td></td> ספקטרוניים <td>חלק 5</td></tr><tr><td>תא פלואורסצנטי</td><td>Hellma Analytics</td><td>105-250-15-40</td><td>חלק 5</td></tr><tr><td>ריבוע 400 רשת, נחושת, 100/בקבוקון</td><td>מיקרוסקופ אלקטרונים מדעי</td><td>G400-Cu</td><td>חלק 6</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ אלקטרונים CM120 הפועל ב-120 קילו וולט</td><td>פיליפס</td><td></td><td>חלק 6</td></tr><tr><td>96 מ"ל x 0.2 מ"ל צלחת</td><td>BIOplastics</td><td>B70501</td><td>חלק 7</td></tr><tr><td>ערכת בדיקת פוספט ירוק מלכיט</td><td>מערכת בדיקה ביולוגית</td><td>POMG-25H</td><td>חלק 7</td></tr><tr><td>PowerWave HT ספקטרופוטומטר מיקרופלייט</td><td>BioTek</td><td></td><td>חלק 7</td></tr></tbody></table>

ftsz פלמור מבחני: פרוטוקולים ושיקולים פשוטים

FtsZ Polymerization Assays: Simple Protocols and Considerations

במהלך חלוקת תא חיידק, FtsZ החלבון החיוני מרכיב באמצע של התא כדי ליצור את מה שנקרא Z-הטבעת. FtsZ polymerizes לחוטים ארוכים בנוכחות GTP במבחנה, ופילמור מוסדר על ידי מספר חלבוני אבזר. פילמור FtsZ נחקר בהרחבה במבחנה באמצעות שיטות בסיסיות כוללים פיזור אור, שקיעה, מבחני הידרוליזה GTP ומיקרוסקופ אלקטרונים. שני מאפייני השפעת תנאי חיץ פילמור של FtsZ, ואת היכולת של FtsZ לאינטראקציה עם חלבונים רגולטוריים. כאן, אנו מתארים פרוטוקולים ללימודי פילמור FtsZ ולאמת את התנאים ושולטים באמצעות Escherichia coli וsubtilis Bacillus FtsZ חלבונים דגם. Assay שקיעת מהירות נמוכה הוא הציג שמאפשר הלימוד של האינטראקציה של FtsZ עם חלבונים שחבילה או tubulate פולימרים FtsZ. פרוטוקול assay GTPase השתפר מתואר המאפשר בדיקותשל הידרוליזה GTP לאורך זמן באמצעות תנאים שונים בהתקנת צלחת 96 היטב, עם זמני דגירה סטנדרטיים הלבטל וריאציה בהתפתחות צבע בתגובה לגילוי פוספט. הכנת דגימות ללימודי פיזור אור ומיקרוסקופ אלקטרונים מתוארת. כמה מאגרים המשמשים להקמת ה-pH המתאים חיץ וריכוז מלח ללימודי פילמור FtsZ. ריכוז גבוה של KCl הוא הטוב ביותר עבור רוב הניסויים. השיטות שלנו מספקות נקודה מוצא למבחנת האפיון בשל FtsZ, לא רק מE. coli ו-B subtilis אבל מכל חיידק אחר. ככזה, השיטות יכולות לשמש למחקרים על האינטראקציה של FtsZ עם חלבונים רגולטוריים או הבדיקה של תרופות אנטיבקטריאליות אשר עשוי להשפיע פילמור FtsZ.

ניקוי של FtsZ ממקורות חיידקיים שונים תואר בספרות ומסוכם בטבלה 1.
<table border="1">
	<tbody >
		<tr >
			<td >מקור</td >
			<td >שיטה</td >
			<td >מודיפיקציה</td >
			<td >ניצול שהתקבל [mg/L של תרבית]&gt;</td >
			<td >מקורות</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >B. subtilis</td >
			<td >1) שקיעה באמון סולפט/כרומטוגרפיית חילוף יונים</td >
			<td >אין</td >
			<td >40</td >
			<td >עבודה זו, 11,15</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >2) כרומטוגרפיית זיקה</td >
			<td >His-tag</td >
			<td >ND</td >
			<td >17</td >
			<td ></td >
		</tr >
		<tr >
			<td >E. coli</td >
			<td >1) שקיעה באמון סולפט/כרומטוגרפיית חילוף יונים</td >
			<td >אין</td >
			<td >35</td >
			<td >עבודה זו, 11,15</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >2) שקיעה בסידן, כרומטוגרפיית חילוף יונים</td >
			<td >אין</td >
			<td >40</td >
			<td >18</td >
			<td ></td >
		</tr >
		<tr >
			<td >Methanococcus jannaschii</td >
			<td >1) כרומטוגרפיית זיקה בתנאים דנטורטיים/קיפול מחדש/שקיעה באמון סולפט/סינון ג'ל</td >
			<td >His-tag</td >
			<td >1.3</td >
			<td >19</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >2) כרומטוגרפיית זיקה/ סינון ג'ל</td >
			<td >His-tag</td >
			<td >ND</td >
			<td >20</td >
			<td ></td >
		</tr >
		<tr >
			<td >Thermotoga maritima</td >
			<td >כרומטוגרפיית חילוף יונים/סינון ג'ל</td >
			<td >אין</td >
			<td >6.7</td >
			<td >19</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >Pseudomonas aeruginosa</td >
			<td >כרומטוגרפיית זיקה/סינון ג'ל</td >
			<td >Strep-tag, His-tag</td >
			<td >ND</td >
			<td >21</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >Mycobacterium tuberculosis</td >
			<td >1) כרומטוגרפיית זיקה/חילוף יונים</td >
			<td >אין</td >
			<td >ND</td >
			<td >22</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >2) כרומטוגרפיית זיקה/ סינון ג'ל</td >
			<td >אין</td >
			<td >30</td >
			<td >23</td >
			<td ></td >
		</tr >
		<tr >
			<td >Aquifex aeolicus</td >
			<td >כרומטוגרפיית זיקה/סינון ג'ל</td >
			<td >His-tag, קיטוע קצה-C (331-367)</td >
			<td >ND</td >
			<td >24</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >Caulobacter crescentus</td >
			<td >כרומטוגרפיית חילוף יונים/שקיעה באמון סולפט/סינון ג'ל</td >
			<td >אין</td >
			<td >ND</td >
			<td >25</td >
		</tr >
	</tbody>
</table>
טבלה 1. פרוטוקולים לטיהור FtsZ המתוארים. ND: לא נקבע.
שיקוע של פולימרי FtsZ
בתחילה, השתמשנו בשתי מהירויות שונות כדי לשקע פולימרים של FtsZ. מצאנו שרק במהירות של 350,000 x g שוקעים פולימרים בודדים של FtsZEc (איור 1), בעוד שבמהירות של 190,000 x g קיימים רק צרורים של FtsZBs בפרקציית המשקע (הנתונים לא מוצגים). לפיכך, נעשה שימוש ב-350,000 x g בניסויים הבאים. אחוז ה-FtsZEc וה-FtsZBs הפולימריים דומה בריכוז של 50 mM KCl, למרות שניסויי פיזור האור חשפו אות פיזור גבוה בהרבה עבור FtsZBs. הדבר נובע מצbundles שנוצרו על ידי FtsZBs, אשר מפיצים יותר אור מאשר פולימרים בודדים של FtsZEc. לא ניתן היה להשיג כמות גבוהה של פולימרים של FtsZ בפרקציית המשקע בניסוי עם 300 mM KCl עבור FtsZEc ו-FtsZBs (איור 1). אנו מייחסים זאת לשילוב של פירוק מהיר של מבני ה-FtsZ וירידה במידת הצרוריות של הפילמנטים.
שיקוע של צינוריות FtsZ-SepF
כדי לנתח את האינטראקציה של FtsZ עם מפעילים מסוימים, ניתן לבצע בדיקות שקיעה במהירויות צנטריפוגה נמוכות יותר. במהירות זו, רק מבנים גדולים של FtsZ עשויים לשקוע, למשל, הצינורות הגדולים הנוצרים על ידי טבעים של SepF וסיבי FtsZBs5, או הצבורים הנוצרים על ידי FtsZ ו-ZapA. השתמשנו בצנטריפוגה במהירות נמוכה יותר (24,600 x g) כדי להדגים את היתכנות גישה זו עבור הצינורות הנוצרים על ידי FtsZ ו-SepF. FtsZ התאושש במשקע מעל רמות הרקע רק כאשר גם SepF וגם GTP היו נוכחים בדגימה (איור 2), ונוכחותו של SepF אינה משפיעה על פעילות ה-GTPase של FtsZ7, מה שמעיד על כך ש-FtsZ פעיל באופן מלא בנוכחות SepF. השקיעה הספציפית של SepF ו-FtsZ היא בקירוב 45% מכלל ה-SepF ו-15% מכלל ה-FtsZ (בהשוואה לחומר השוקע כאשר מתווסף GDP). דבר זה מראה כי צינורות ה-SepF-FtsZ מכילים יותר SepF מאשר FtsZ. ייתכן שהדבר נובע מכך שטבעי SepF רבים מארגנים את צינורות ה-FtsZ-SepF5,7. הסטוכיומטריה המדויקת של SepF-FtsZ בצינורות אלו אינה ידועה, אך תוצאותינו מרמזות כי קיים יותר SepF מאשר FtsZ.
תכונות הפולימריזציה והאגודה (bundling) של FtsZEc ו-FtsZBs
לאפיון יעילות הפולימריזציה של FtsZבס ו-FtsZEc בבפרוטוקולים שונים ניתחנו את שני החלבונים באמצעות 90° פיזור אור בזווית. בריכוז של 50 mM KCl, חלבון ה-FtsZבשתי (Bs) נותן אות פיזור אור הגבוה פי 20-40 מזה של FtsZEc בהתאם ל-pH של התמיס (איורים 3A ו- B) אישור של תוצאותיו של Buske ואחרים.26 העלאת ריכוז ה-KCl בבופר לא השפיעה באופן מובהק על אות פיזור האור של FtsZEc (איור 3D) אך האות של FtsZBs פחת בערך פי 80 ב-pH 7.5, בערך פי 30 ב-pH 6.8 ובערך פי 45 ב-pH 6.5 ב-300 mM KCl (איור 3C) בהשוואה לתמיסות עיכוב (buffers) עם 50 mM KCl (איור 3A). פירוק פולימרים של FtsZ מהיר יותר בריכוזי KCl גבוהים יותר עבור שני החלבונים (איור 3C ו- ד). מחקרים של Pacheco-Gómez ואחריםהוכיחו ש *E. coli* פולימריזציה ואגדגוד (bundling) של FtsZ תלויים ב-pH. מחברים אלה מצאו שבבופר עם 50 mM KCl, אות פיזור האור של פולימריזציית FtsZ היה גבוה יותר, והפירוק של FtsZ ארך זמן רב יותר ב-pH 6.0 בהשוואה ל-pH 7.0. 8תוצאות אלו אינן תואמות את הנתונים שלנו מפולימריזציה של FtsZ.Ec בריכוז של 50 mM KCl (איור 3B), אך יש לציין כי השתמשנו בשלושה באפרים שונים (HEPES, MES ו-PIPES), בעוד ש-Pacheco-Gómez ואח'השתמשו ב-MES בלבד. לכן, לא רק ה-pH, אלא גם הרכב התמיסה הבופרית (החוזק היוני) משפיע על קינטיקת הפולימרים של FtsZ בריכוז של 50 mM KCl. עם זאת, בריכוז של 300 mM KCl, לא הרכב התמיסה הבופרית ולא ה-pH השפיעו על FtsZ.Ec הרכבה באופן ניתן לזיהוי.
ניסוי פיזור אור של FtsZBs בתמיסות חוצץ ללא KCl לא היה אפשרי עקב שקיעה של החלבון בתנאים אלה. כאשר ריכוז ה-FtsZBs הופחת ל-3 µM, לא התרחשה שקיעה. עם זאת, 3 µM אינו הריכוז הפיזיולוגי של FtsZ בתא. בקיובטות פלסטיק, FtsZBs לא שקע בריכוז של 12 µM ב-pH 7.5, אך ב-pH 6.8 ו-6.5 ה-FtsZ עדיין שקע בהיעדרו של KCl.
מורפולוגיות של מבני FtsZ מ-E. coli ו-B. subtilis
המבנים שנוצרו על ידי FtsZ נבחנו באמצעות TEM. FtsZBs התרכב לפולימרים דחוסים שכיסו את כל הרשת בכל סוגי התמיסות בריכוז מלח נמוך (איורים 4A-C). FtsZEc יצר פילמנטים ארוכים, כבלים ואגודות בכל התמיסות בריכוז מלח נמוך (איורים 4D-F). עם זאת, כמות הפולימריםB הנצפית שנוצרה על ידי FtsZEc הייתה נמוכה מזו שנוצרה על ידי FtsZBs. בתמיסות בעלות ריכוז מלח גבוה, FtsZBs יצר פרוטו-פילמנטים ארוכים בעלי גדיל יחיד שלא התאגדו לאגודות (איורים 4G-I). בעוד שהפרוטו-פילמנטים של FtsZBs שינו את מבנם בריכוז מלח גבוה יותר, FtsZEc יצר מבנים שאינם ניתנים להבחנה מאלה של תמיסת מלח בריכוז נמוך (איורים 4J-L). לא נצפתה השפעה של pH על הפולימריזציה של FtsZEc, אך FtsZBs יוצר יותר אגודות ב-pH 6.5, הנראות כפולימרים ודפים דחוסים (איור 4B). תוצאות אלו תואמות את ניסויי פיזור האור שלנו ואת עבודות TEM שפורסמו בעבר8,11,26.
פעילות ה-GTPase של FtsZ בריכוזי KCl גבוהים ונמוכים
פעילות הידרוליזת ה-GTP של FtsZ נמדדה בתנאים שונים באמצעות בדיקה קולורימטרית לפוספט חופשי. כפי שדווח בעבר15 פעילות ה-GTPase של FtsZ עלתה עם עליית ריכוז ה-KCl: בהתאם לבפר שהיה בשימוש, FtsZBs הראתה עלייה של 3-7 מ'; ו-FtsZEc הראתה עלייה של 1.5-2.5 מ' בפעילות ה-GTPase בריכוז של 300 mM KCl בהשוואה ל-50 mM KCl. הפעילות המופחתת של ה-GTPase ב-50 mM KCl נובעת מהצמדה (bundling) של סיבי FtsZBs. ב-50 mM KCl, ל-FtsZEc הייתה פעילות GTPase גבוהה פי 3-6 מזו של FtsZBs עקב פירוק מהיר יותר של פולימרים של FtsZEc. ההבדל בפעילות הידרוליזת ה-GTP בין FtsZBs ל-FtsZEc פחת ב-300 mM KCl, ייתכן בשל הפחתה בהצמדה של סיבי FtsZBs (איור 5).
<img alt="פולימריזציה של FtsZ, ניתוח % של המשקע, גרף עמודות, אלקטרופורזה של ג'ל, השוואת השפעת GTP/GDP." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50844/50844fig1.jpg" width="600px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="איור 1"> 
איור 1. כימות של פולימריזציה של FtsZ באמצעות שיקוע. (A) 12 µM FtsZ עברו פולימריזציה בנוכחות 2 mM GTP או GDP ב-pH 7.5 (עמודות שחורות), 6.8 (עמודות אפורות) או 6.5 (עמודות לבנות). כמות החלבון שהשקיעה נקבעה באמצעות ניתוח דנסיטומטרי של ג'לים שנצבעו ב-Coomassie. GDP שימש כביקורת לשקיעה ספציפית, ואחוז ה-FtsZ שהשקיע עם GDP הופחת מאחוז ה-FtsZ שהשקיע עם GTP כדי לקבל את הערכים המוצגים בגרף. משמאל: FtsZ שהשקיע ב-50 mM KCl, מימין: FtsZ שהשקיע ב-300 mM KCl. (B) תוצאות מייצגות מג'לים שנצבעו ב-Coomassie. פולימריזציה של FtsZBs (הג'ל העליון) ו-FtsZEc (הג'ל התחתון) ב-50 mM KCl. (S) עלה, (P) פракציות של משקע מהניסוי. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50844/50844fig1highres.jpg" target="_blank">לחצו כאן להצגת תמונה גדולה יותר</a>.
<img alt="גרף אינטראקציה בין FtsZ ל-SepF וג'ל המראה את השפעת GTP/GDP על אחוז חלבון המשקע." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50844/50844fig2.jpg" width="600px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="איור 2"> 
איור 2. שקיעה של צינוריות SepF/FtsZ במהירות נמוכה. (A) 12 µM FtsZBs עבר פולימריזציה עם 2 mM GDP (פסים לבנים) או GTP (פסים שחורים). כמות החלבון שהשקיע נקבעה באמצעות אנליזה דנסיטומטרית של ג'לים שנצבעו ב-Coomassie. הסימנים + ו- - מתחת לציר ה-x מצביעים על נוכחות או היעדר של FtsZ ו-SepF בתגובה. (B) תוצאות מייצגות מג'ל שנצבע ב-Coomassie. פולימריזציה של FtsZBs בנוכחות ובהיעדר SepF. כביקורת נעשה שימוש ב-SepF ללא FtsZ. הפולימריזציה בוצעה עם GTP ו-GDP. (S) עלילון, (P) פראקציות משקע מהניסוי. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50844/50844fig2highres.jpg" target="_blank">לחצו כאן להצגת תמונה גדולה יותר</a>.
<img alt="גרפים של פיזור אור של FtsZ בריכוזי KCl שונים; מראה השפעות של pH 6.5, 6.8, 7.5." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50844/50844fig3.jpg" width="600px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="איור 3"> 
איור 3. פיזור אור של 12 μM FtsZEc ו-12 μM FtsZBs. חלבוני FtsZ הורכבו בנוכחות 2 mM GTP והפולימריזציה נוטרה באמצעות פיזור אור בזווית של 90°. פולימריזציה של FtsZBs (A) ו-FtsZEc (B) בריכוז 50 mM KCl ב-pH 7.5, pH 6.8, pH 6.5. פולימריזציה של FtsZBs (C) ו-FtsZEc (D) בריכוז 300 mM KCl ב-pH 7.5, pH 6.8 ו-pH 6.5. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50844/50844fig3highres.jpg" target="_blank">לחצו כאן להצגת תמונה גדולה יותר</a>.
<img alt="מיקרוסקופיה אלקטרונית של פולימרים של FtsZ בריכוזי pH ו-KCl משתנים; ניתוח מבני." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50844/50844fig4.jpg" width="600px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="איור 4"> 
איור 4. מבנים של פולימרים של FtsZBs ו-FtsZEc כפי שנצפו במיקרוסקופיה אלקטרונית. (A-L) תמונות של 12 µM FtsZBs (A-C ו-G-I) ו-FtsZEc (D-F) ו-(J-L) שעברו פולימריזציה עם 2 mM GTP. (A-C) FtsZBs בבופר עם 50 mM KCl ו-pH 7.5, 6.8, ו-6.5 בהתאמה. (D-F) FtsZEc בבופר עם 50 mM KCl ו-pH 7.5, 6.8, ו-6.5 בהתאמה. (G-I) FtsZBs בבופר עם 300 mM KCl ו-pH 7.5, 6.8, ו-6.5 בהתאמה. (J-L) FtsZEc בבופר עם 300 mM KCl ו-pH 7.5, 6.8, ו-6.5 בהתאמה. סרגל קנה מידה: 100 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50844/50844fig4highres.jpg" target="_blank">לחצו כאן להצגת תמונה גדולה יותר</a>.
<img alt="גרף פעילות GTPase; תרשים עמודות של FtsZ בריכוז 50mM לעומת 300mM KCl, וריאציות של pH בערכים 7.5, 6.8, 6.5." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50844/50844fig5.jpg" width="600px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="איור 5"> 
איור 5. הידרוליזה של GTP במהלך פולימריזציה של FtsZ ב-6 חוצצים שונים.בכל הניסויים נעשה שימוש ב-2 mM GTP. כביקורת, נעשה שימוש בדגימה ללא MgCl2. הפעילות של FtsZ ללא MgCl2 הופחתה מהפעילות של FtsZ בנוכחות MgCl2. משמאל: פעילות GTPase של FtsZ בריכוז 50 mM KCl, מימין: פעילות GTPase של FtsZ בריכוז 300 mM KCl. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50844/50844fig5highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן להצגת תמונה גדולה יותר</a>.

פילמור של FtsZ חיוני לחלוקת תאי חיידקים. בדוח זה, אנו מפרטים פרוטוקולים פשוטים לניטור פעילות פילמור FtsZ ודנים בהשפעת הרכב המאגר. ניתן להשתמש בפרוטוקולים כדי לחקור את האינטראקציה של FtsZ עם חלבונים רגולטוריים או תרופות אנטיבקטריאליות המשפיעות על פילמור FtsZ.

FtsZ פלמור מבחני: פרוטוקולים ושיקולים פשוטים

During bacterial cell division, the essential protein FtsZ assembles in the middle of the cell to form the so-called Z-ring. FtsZ polymerizes into long ...

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לקבוע תנאים מתאימים לחקר FTSZ, פילמור ופעילות באמצעות מבחנים וציוד פשוטים. זה מושג על ידי ביצוע בדיקות שקיעה פולימרית FDSC בתנאים שונים כדי למצוא תנאים מתאימים שבהם FDSZ מתפלמר. כשלב שני, אנו מבצעים מבחני פיזור אור כדי לחקור פילמור FDSZ בזמן אמת.לאחר מכן, אנו מבצעים מבחני הידרוליזה של GTP כדי לקבוע את פעילות הפילמור ggtpa הקשורה לפילמור של FT SC. מתקבלות תוצאות המראות אילו תנאים מתאימים ביותר לחקר FTSC של מקור חיידקי ספציפי המבוסס על משקעים, פיזור אור והידרוליזה של GTP. הטכניקה המוצגת כאן קלה לביצוע בכל מעבדה ותספק מושג מהיר על יכולות הפילמור של FT a z ספציפי. אנו מוצאים כי הבחירה של המאגר הנכון חשובה במיוחד כאשר עובדים עם FTAZ בנוכחות חלבונים אחרים המדגימים את הטכניקה תהיה זחילת EVA, סטודנט לתואר שני מהמעבדה שלי.כדי להתחיל, הוסף חמישה מיקרוליטרים של 100 מילי-מולרי מגנזיום כלוריד, ו-12 מיקרו-מולרי של חלבוני החיידקים, FDSC ו/או SEP F לאחד ממאגרי הפילמור שנבחרו בעלי ערכי pH והרכבים שונים כמתואר בפרוטוקול הטקסט הנלווה. לאחר מכן, הכניסו את הצינורות לאינקובטור עם פונקציית ניעור ודגרו את הדגימות למשך שתי דקות בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס ו-300 סל"ד. לאחר שהצינורות עורבבו היטב, התחל בפילמור על ידי הוספת מיקרוליטר אחד של תערובת GTP או GDP מתמיסת מלאי של 100 מילימולר כך שהריכוז הסופי יהיה שני מילימולר.לאחר מכן הכניסו את הדגימות בחזרה לחממה הרועדת למשך 20 דקות נוספות. לאחר מכן, סובב את הצינורות בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות ב-20,000 סל"ד באמצעות רוטור TLA 55 או שווה ערך ל-24, 600 Gs אם משתמשים במשהו אחר. לאחר שהצנטריפוגה הסתיימה, העבירו את הסופרנטנטים לצינורות נקיים ושמרו את הכדורים למועד מאוחר יותר.קח 20 מיקרוליטר מהסופרנטנטים המועברים וערבב אותם בצינור נפרד עם 20 מיקרוליטר של מאגר דגימה מרוכז פי שניים. מהדקים את הכובעים ומרתיחים את הדגימות במשך 10 דקות בחום של 98 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, הוסף 50 מיקרוליטר של מאגר דגימה מרוכז פי 2 לכל שבר גלולה שהונח בעבר והשהה את הפולימרים על ידי הרתחת הדגימות למשך 10 דקות ב-98 מעלות צלזיוס.לאחר שהדגימות סיימו לרתוח, הוסיפו עוד 50 מיקרוליטר של מים דה-מינרליים לצינורות המכילים את הכדורים. לאחר מכן, טען 10 מיקרוליטר הן של הסופרנטנטים והן של הכדורים מכל דגימה זה לצד זה על ג'ל דף SDS של 10% והפעל את הג'ל ב-150 וולט. לאחר השלמת הג'ל, הסר את הג'ל והכתים אותו בכחול מבריק קומאסי G 2 50.לאחר מכן דמיין את הג'ל וכימת את החלבון באמצעות ציטומטריה כמתואר בפרוטוקול הטקסט הנלווה. ראשית הפעל ספקטרומטר פלורסנט ואפשר למנורה להתחמם במשך מספר דקות כדי למנוע תנודות תרמיות. כמו כן, הפעל אמבט מים במחזור והגדר את טמפרטורת המים ל-30 מעלות צלזיוס כדי לשמור על תא הווט בטמפרטורה קבועה.כאשר המערכת מתחממת, הגדר את פרמטרי ההפעלה של הספקטרומטר. הגדר את המתח הגבוה של הגלאי ל-300 וולט ואת אורכי הגל של הפליטה והעירור ל-350 ננומטר עם רוחב חריץ של ארבעה ננומטר. לאחר מכן תכנת את פרוטוקול רכישת הנתונים על ידי בחירת רכישה מבוססת זמן עם משך של 3, 600 שניות.נקו בזהירות ווט פלואורסצנטי של 200 מיקרוליטר באורך נתיב של סנטימטר אחד על ידי זנות בתמיסת ניקוי באמבט מים למשך חמש דקות. לאחר מכן, הכינו 294 מיקרוליטר של תערובת מאסטר עבור כל אחד מתשעת מאגרי הפילמור המתוארים בפרוטוקול הטקסט הנלווה, כל אחד עם 10 מילי-מולרי מגנזיום כלוריד, ו-12 מיקרו-מולרי FDSE כריכוזים הסופיים המחושבים עבור 300 מיקרוליטר. ואז מערבולת קצרה התערובות מעבירות 196 מיקרוליטר של מאגר הפילמור הראשון לווטרינר.מניחים אותו בספקטרומטר ומדגרים למשך שתי דקות כדי להביא את טמפרטורת הדגימה עד 30 מעלות צלזיוס. לאחר שתי דקות, התחל את רכישת הנתונים והמתן 90 שניות כדי לוודא שהאות יציב. לאחר מכן הוסף ארבעה מיקרוליטר של 100 מילי-מולרי GTP או תמ"ג.ערבב את הדגימה והמשך באיסוף הנתונים במשך שעה שלמה. חזור על שלבים אלה עבור כל מאגר שמופיע ברשימה. הכן 1.5 מיליליטר של שני מילי-מולרי GTP במאגר פילמור נבחר.הכן גם דילול סטנדרטי של פוספט בטווח של אפס עד 40 מיקרומולר באותו מאגר. לאחר מכן, הכינו מגיב עבודה ירוק מלכיט כמתואר בערכת הבדיקות הביולוגיות. לאחר מכן הרכיבו ארבע תערובות מאסטר בנפח כולל כל אחת של 360 מיקרוליטר מאסטר מיקס אחד מכיל FDSZ שמקורו ב-B subtilis ותערובת מאסטר שתיים מכילה FDSE שמקורו ב-e coli.תערובות מאסטר 3 ו-4 משמשות כבקרות ומכילות EDTA במקום מגנזיום כלוריד. לאחר מכן פיפטה 20 מיקרוליטר של תערובות המאסטר ותקני הפוספט. בצלחת באר A-Q-P-C-R 96 כך שיש 16 בארות לכל תערובת מאסטר ותקני הפוספט מסודרים כפי שמוצג כאן.פיפטה 180 מיקרוליטר של מלאי GTP של שני מילימולר לנתיב האחרון של הצלחת. לאחר מכן הנח את הצלחת במכונת PCR. הפעל תוכנית עם מחזור יחיד המוגדר ל-30 מעלות צלזיוס למשך 40 דקות.בפיפטה שנייה של 96 בארות, 20 מיקרוליטר של מגיב העבודה הירוק מלכיט לבארות, A אחד עד H 10. ואז ב-60 מיקרוליטר של מאגר הפילמור מהניסוי טוען A אחד עד H שמונה, לאחר מכן ב-20 מיקרוליטר של תמיסת GTP של שני מילי-מולרים לבארות בכל נתיב של צלחת. אחד במרווחים שנקבעו מראש כפי שמוצג כאן כדי לבחון את התגובה בנקודות זמן שונות.מצננים את התערובות למעלה ולמטה כדי לערבב אותן לאחר 30 דקות, החל מנתיב אחד בצלחת אחת, מעבירים 20 מיקרוליטר מנתיב אחד של צלחת אחת לנתיב אחד של צלחת שתיים ופיפטה למעלה ולמטה לערבב. זוהי נקודת ההתחלה של התפתחות צבע ירוק מלכיט לתגובה של 30 דקות לאחר 30 וחצי דקות, להעביר 20 מיקרוליטר מנתיב שתיים של צלחת אחת לנתיב שתיים של צלחת שתיים ולערבב. זוהי נקודת ההתחלה של התפתחות הצבע הירוק מלכיט לתגובה של 20 דקות.חזור על שלבים אלה עם הנתיבים הנותרים 3 עד 7 במרווחים 32 לאחר 33 וחצי דקות ב-20 מיקרוליטר GTP לנתיב שמונה בלוח הראשון ולערבב. לאחר מכן מעבירים 20 מיקרוליטר לנתיב שמונה בצלחת השנייה ומערבבים. זה מייצג את תגובת דקה האפס והיא נקודת הזמן ההתחלתית להתפתחות צבע ירוק מלכיט.לאחר 34 דקות, הוסף 80 מיקרוליטר מנתיב תשע של צלחת אחת המכיל את תקן הפוספט לנתיב תשע של צלחת שתיים וערבב לאחר 34 וחצי דקות, העביר 80 מיקרוליטר מתקן הפוספט השני בנתיב 10 של הצלחת הראשונה לנתיב 10 בצלחת השנייה וערבב. לאחר מכן הסר את כל בועות האוויר מהדגימות ודגר את הצלחת בטמפרטורת החדר למשך 25 וחצי דקות נוספות. לאחר הדגירה.הנח את הצלחת בקורא צלחות 96 באר החל מ-60 דקות מתחילת הניסוי. מדוד את הצלחת ב-630 ננומטר כל 30 שניות למשך חמש דקות כך שיילקחו 10 נקודות זמן. מדידת הלוח הראשונה תתאים לנתיב הראשון, השנייה לנתיב השני, וכך לכל נתיב היה בדיוק אותו זמן להתפתחות הצבע הירוק של המלכיט.לאחר מכן, חשב את הפוספט החופשי בכל דגימה באמצעות עקומת הכיול הסטנדרטית של הפוספט ושרטט את הנתונים כשחרור פוספט לאורך זמן. לאחר מכן חשב את פעילות ההידרוליזה F-D-S-Z-G-T-P מהטווח הליניארי של העקומה. מוצגים כאן אחוז ה-SEP F וה-FDSZ בכדורי הדגימות.FDSZ התגלה בגלולה מעל רמות הרקע רק כאשר גם SEP F וגם GTP היו נוכחים בדגימה. הסטוכיומטריה המדויקת של SEPPE ו-FDSZ בצינורות אלה אינה ידועה, אך תוצאות אלה מצביעות על כך שיש יותר ספה מאשר FDSZ. פיזור אור של FDSZ מ-B subtilis ו-e coli מוצג כאן, מורכב בנוכחות שני GTP מילי-מולרי במאגר אשלגן כלורי של 50 מילי-מולרי.F-D-S-E-B-S נותן אות פיזור אור גבוה פי 20 עד 40 מאשר FDSC EC בהתאם ל-pH של המאגר. מעניין שהגדלת ריכוז האשלגן הכלורי במאגר לא השפיעה באופן משמעותי על אות פיזור האור של F-D-S-Z-E-C, אך האות של F-T-S-Z-B-S ירד פי 80 ב-pH 7.5 פי 30 ב-pH 6.8 ופי 45 ב-pH 6.5 ב-300 מילי-מולרי אשלגן כלורי בהשוואה למאגרים עם 50 מילי-מולרי אשלגן כלורי. פעילות ההידרוליזה GTP של FDSZ נמדדה בתנאי חיץ שונים באמצעות בדיקה קולורימטרית לפוספט חופשי.נמצא כי פעילות ה-GTPS של FT SZ גדלה עם הגדלת ריכוז האשלגן הכלורי בכל אחד מתנאי ה-pH השונים. ב-50 מילי-מולרי אשלגן כלורי, פעילות ה-gtpa הופחתה עקב צרור של חוטי F-D-S-Z-B-S ב-50 מילי-מולאר. לאשלגן כלורי FDSZ EEC הייתה פעילות GTPS גבוהה פי שלושה עד שישה מאשר F-D-S-Z-B-S עקב פירוק מהיר יותר של פולימרי FDSC EEC.לבסוף, ההבדל בפעילות ההידרוליזה של GTP בין F-D-S-Z-B-S ו-F-D-S-Z-E-C הצטמצם ב-300 מילי-מולרי אשלגן כלורי, אולי בגלל צרור מופחת של חוטי F-D-S-Z-B-S. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע מתכות אחרות כמו אלקטרומיקרוסקופיה על מנת לענות על שאלות נוספות הנוגעות למבנה פולימרי fts בדגימה.

ftsz-polymerization-assays-simple-protocols-and-considerations

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

אנו מתארים שיטה זמנית לצורך זיהוי של מיקרואורגניזמים בתוך מדגם באמצעות חרוזי ניאון oligonucleotide מצמידים. Amplicon מכל האורגניזמים בתוך מדגם הוא הכלאה בפני פאנל של בדיקה, בשילוב חרוזים. מכשיר Luminex או Bio-Plex משמש עבור כל שאילתת חרוז חרוז סוג האות הכלאה.

Multiplex זיהוי של חיידקים דוגמאות מורכבות קלינית הסביבה באמצעות oligonucleotide מצמידים פלורסנט microspheres

תיאור של ההיווצרות של הפולימר microarray באמצעות טכניקת photopolymerization על שבב. אפיון משטח התפוקה הגבוהה באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי, מדידות זווית מגע מים, ספקטרוסקופיה Photoelectron רנטגן ושעה של ספקטרומטריית טיסה משנית יון המוני וassay מצורף תא גם תאר.

Microarrays פולימר לגילוי תפוקה גבוהה של Biomaterials

PCR התפתחה טכניקה נפוצה הרבה מעבדות ביולוגיה מולקולרית. בתנאי הנה מדריך מהיר קונבנציונאלי פרוטוקולים מספר ה-PCR. כי כל תגובה היא ניסוי ייחודי, תנאים אופטימליים הנדרשים כדי לייצר מוצר להשתנות. הבנת המשתנים התגובה יהיה מאוד לשפר את יעילות לפתרון בעיות, ובכך להגדיל את הסיכוי להשיג את התוצאה הרצויה.

תגובת שרשרת פולימרז: פרוטוקול בסיסי פלוס אסטרטגיות לפתרון בעיות ואופטימיזציה

הפרוטוקול המתואר במסמך זה נועד להסביר ולקצר מספר רב של מכשולים בדרכו של המסלול המורכב המוביל לtriphosphates נוקלאוזידים שונה. כתוצאה מכך, פרוטוקול זה מאפשר גם לסינתזה של אבני הבניין הופעל אלה וזמינותם ליישומים מעשיים.

נוקלאוזידים triphosphates - מ - סינתזה ביוכימיה באפיון

פרוטוקול זה מתאר את האפיון של ה-DNA פולימראז סינתזה של דנ א שונה דרך התבוננות שינויים-סגול fluorescently שכותרתו הדנ א באמצעות אלקטרופורזה בג'ל ג'ל הדמיה. ג'לים אקרילאמיד משמשים עבור הדמיה ברזולוציה גבוהה של ההפרדה של חומצות גרעין קצר, אשר נודדים בקצב שונה בהתאם לגודל.

DNA פולימראז פעילות Assay באמצעות DNA שכותרתו פלורסנט-סגול, דמיינו ידי אקרילאמיד אלקטרופורזה בג'ל

מדויק וחזק מבוסס תגובת שרשרת פולימראז ' המבוססת על ככמת ציטוסינוס-גואן ין-גואנין trinucleotide גאות חוזר על הפיגור שברירי X 1 גן מקלה אבחנה מולקולרית והקרנה של תסמונת X שביר והקשורות X שברירי הפרעות עם הזמן להסתובב קצר והשקעה בציוד.

בסיס מבוסס על תגובת שרשרת פולימראז חזקה עבור כימות ציטוסינוס-גואנין-גואנין Trinucleotide גאות חוזר בצורה שברירית X פיגור-1 גן

סמנים אפיגנטיים משמשים עבור תא דם לבן (WBC) תת-כמות באמצעות כימות של דפוסי מתילציה DNA. פרוטוקול זה מציג שיטת תגובת שרשרת פולימראז טיפות טיפות כפוליות (mdPCR) באמצעות elastomer תרמופלסטי (TPE) מבוסס מיקרופלואידים התקן עבור יצירת droplet המאפשר דיוק ו- multiplex ספציפית מתילציה היעד כימות של ספירות דיפרנציאליות WBC.

מתילציה ספציפית מולטיפלקס טיפות PCR באמצעות התקן מחולל טיפות פולימר לאבחון המטולוגי

חלקים גנטיים מאופיינים היטב נחוצים לתכנון מעגלים גנטיים חדשים. כאן אנו מתארים שיטה חסכונית ובעלת תפוקה גבוהה לאפיון מהיר של חלקים גנטיים. השיטה שלנו מפחיתה עלויות וזמן על ידי שילוב ליזטים נטולי תאים, DNA ליניארי למניעת שיבוט וטיפול בנוזלים אקוסטיים כדי להגדיל את התפוקה ולהפחית את נפחי התגובה.

אפיון מהיר של חלקים גנטיים עם מערכות נטולות תאים

אוליגונוקלאוטיד 5′-טריפוספטים הם מרכיבים הנמצאים בכל מקום במסלולים ביולוגיים חיוניים וראו שימוש הולך וגובר ביישומי ביוטכנולוגיה. כאן אנו מתארים טכניקות לסינתזה וטיהור שגרתיים של אוליגונוקלאוטיד 5′-טריפוספטים, החל מאוליגונוקלאוטידים שהוכנו על ידי טכניקות סינתזה אוטומטיות סטנדרטיות.

טריפוספורילציה כימית של אוליגונוקלאוטידים

פרוטוקול זה מתאר בדיקת שכפול DNA חד-מולקולה מבוססת מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, המאפשרת הדמיה בזמן אמת של אינטראקציות בין פולימראזות DNA ומכשולים כגון מבני G-quadruplex.

הדמיה פלואורסצנטית של מולקולה אחת של דינמיקת DNA פולימראז ב-G-quadruplexes

פרוטוקול זה מציג מתודולוגיית סקר פלואורומטרית המותאמת לזיהוי מעכבי מוצר טבעי/מולקולות קטנות של סינתזת חלבונים. הפרקטיות שלו הופכת אותה למתאימה הן להוראה לתואר ראשון בטכניקות גילוי תרופות והן ליישום בקמפיינים של כימיה רפואית.

פרוטוקול מבוסס פלואורסצנציה לסינון ראשוני של מעכבי סינתזת חלבונים ממקורות טבעיים

למדו פרוטוקולים לניטור פולימריזציה של FtsZ בחיידקים באמצעות מיורי שקיעה, פיזור אור והידרוליזת GTP. שיטות אלו מאפשרות לחוקרים לבחון פעילות חלבונית ולפתח אסטרטגיות אנטיבקטריאליות חדשות.

FtsZ פלמור מבחני: פרוטוקולים ושיקולים פשוטים

גלה סרטונים נוספים