הדמיה של זרימה ציטופלזמית במהלך ריפוי פצע של תא בודד ב-Stentor coeruleus

המטרה הכוללת של הליך זה היא למדוד את זרימת הציטופלזמה במהלך ריפוי פצעים בתא בודד. זה מושג על ידי איסוף תאי סטנט חיים או SEIUs לשימוש כמערכת מודל לפציעה תאית. השלב השני הוא הכנת כלי הזכוכית לחיתוך התאים.

לאחר מכן, תאי הסטנט סריוס נחתכים במערך מיקרוסקופ מותאם אישית המאפשר ניתוח הגדלה נמוכה בו זמנית והדמיה ברזולוציה גבוהה. השלב האחרון הוא ביצוע ניתוח חישובי של הזרימה הציטופלזמית באמצעות תוכנת סימטריית וולו של תמונת חלקיקים. בסופו של דבר, הדמיה ברזולוציה גבוהה של הציטופלזמה משמשת כדי להראות את התגובה הפעילה של התאים במהלך ריפוי הפצע.

ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לענות על שאלות מפתח לגבי ריפוי פצעים תאיים, כגון האם הציטופלזמה הופכת לדמוית ג'ל סביב אזור החתך על מנת למנוע דליפה לתווך שמסביב. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית מכיוון שקשה ללמוד את הכנת כלי הטיפול בתאים ושלבי החיתוך מכיוון שהם דורשים מיומנות ידנית. כדי להתחיל להשיג סטנט או תאי סיריוס מפונים טבעיים כפי שמתואר על ידי אבנית או מספק מסחרי, הוסף 300 מיליליטר של סטנט או מדיום מותאם ממתכונים של אבנית והרתיע כמתואר בפרוטוקול הטקסט הנלווה.

שמרו על תרבויות על ידי גידולן בחושך בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, לגדול תרבויות של אצות כלמידומונס ריין הארדי במדיום טריס אצטט פוספט. השתמשו בשיטות תרבית סטנדרטיות לפני האכלה, שטפו את תאי הכלמידומונס על ידי סיבובם בעדינות כלפי מטה, הסרת הסופרנטנט והשעייתם בסטנט או במדיום ששונה.

האכילו את הסטנט של 300 מיליליטר או תרביות הסאריוס בכ-30 מיליון תאי chm פעמיים או שלוש בשבוע בעת הצורך. אסוף סטנט או תאים לניתוח. כדי להתחיל, ערבבו בעדינות את התרבית על ידי בעבוע אוויר דרך קצה פיפטה עד שהתאים מתחילים להתנתק ולשחות בחופשיות.

לאחר מכן לכוד את תאי השחייה באמצעות פיפטה של מיליליטר אחד המצוידת בקצה קדח רחב כדי למנוע גזירה של התאים. לאחר האיסוף, תנו לתאים להתייצב. לאחר מכן הסר לאט את המדיה שמעליהם והוסף סטנט או מדיום טרי שונה.

הכן את מחטי הזכוכית המשמשות לחיתוך תאי הסטנט על ידי החזקת שני מוטות ערבוב זכוכית מעל שפע ומבער עד שהקצוות מתחילים להמיס. לאחר מכן גע בקצות שני המוטות יחד עד שהזכוכית המותכת מתמזגת. לאחר שהם מתמזגים, הסר אותם מהאש והניח להם להתקרר למשך שנייה עד שתיים.

ואז להפריד אותם לאט כדי לעשות הפסקה נקייה. באופן אידיאלי, זה יפיק מחט באורך של כסנטימטר עד שני סנטימטרים עם נקודה דקה בקצה. אם המחט המתקבלת אינה אופטימלית, שברו את הקצה למותני הזכוכית ועשו שימוש חוזר במוטות.

לאחר מכן, השתמש בחותמת גומי מרובעת המצופה בווזלין כדי להכין תא מרובע עם קירות וזלין על ידי לחיצה עליו לתוך פתק כיסוי זכוכית. לאחר מכן הוסף 100 מיקרוליטר של סטנט או מדיום שונה המכיל 2% מתיל צלולוז לריבוע הווזלין. הנח את פתק הכיסוי המוכן לתוך מתאם פלסטיק ולאחר מכן הוסף את תאי הסטנט השטופים להחלקת הכיסוי.

לבסוף, סדרו תאים במתיל צלולוז כך שהם יהיו מרווחים באופן שווה ונדחפים קרוב מספיק לפני השטח של החלקת הכיסוי כדי להיות ממוקדים במהלך ההדמיה. כדי להתחיל, הנח את השקופית על הבמה של המיקרוסקופ ההפוך. לאחר מכן הסר את גוף המיקרוסקופ המנתח מהמעמד שלו וקבע את המיקום המשוער בו יהיה צורך למקם אותו על מנת לדמיין את השקופית בהגדלה נמוכה מלמעלה.

לאחר מכן, בנה מיקרוסקופ דו-קומתי על ידי הוספת קופסת קרטון עם המרווח הרצוי בין העינית של המיקרוסקופ ההפוך לטווח הניתוח. הדביקו את הקופסה למקומה באמצעות סרט מעבדה כך שניתן יהיה להסיר אותה בקלות בסיום הניסוי, ודא שהדגימה תהיה בשדה הראייה ובמיקוד ללא צורך להזיז את טווח החיתוך לאחר חיבורו, החזק את משקף החיתוך כנגד הקופסה והדביק אותו על הקופסה באמצעות סרט מעבדה. לאחר מכן, הגדר את המיקרוסקופ ההפוך באמצעות אופטיקה DIC על ידי הצבת מטרת אוויר של פי 20 למקומה.

כמו כן, הקפד להשתמש במעבה DIC למרחק עבודה ארוך כדי לספק מספיק מקום לביצוע המיקרו-כירורגיה מלמעלה. לאחר מכן הביאו את התאים לפוקוס עם המיקרוסקופ ההפוך כשהכל מוכן וממוקד משני הצדדים. התחל לרכוש תמונות בקצב פריימים של שתי תמונות בשנייה, באמצעות מצלמת חמש 12 על חמש 12 CCD.

ואז חותכים את התא בעזרת מחט הזכוכית. לכוד את דפוס הזרימה הציטופלזמי הראשוני וצפה בכל שלבי תהליך הפציעה וריפוי הפצעים. הפסק את הרכישה כאשר התא חזר למראה רגיל או החל שוב בתנועתיות פעילה.

כדי להתחיל, הורד מעבדת PIV חבילת MATLAB למדידת זרימה ציטופלזמית באמצעות סימטריית וולוק של תמונת חלקיקים. לאחר מכן, טען את ערימת התמונות TIFF עבור כל רצף וידאו לתוכנית סימטריית veloc של תמונת החלקיקים בתוך מדריך MATLAB. צרו ידנית מסיכה לכל אוסף תמונות כדי להסתיר אזורים בנתונים הגולמיים מחוץ לגוף הסטנט.

לאחר מכן הגדר את PIV lab להשתמש בהגדרת הטרנספורמציה המהירה של פורייה ובגודל סל של 64 על 64 פיקסלים, אשר יכניס את הפיקסלים בכל מסגרת לפיקסלים מרובעים גדולים יותר. לאחר מכן, הפעל את PIV lab כדי לחשב מתאמים צולבים בין הפיקסלים בכל פריים עם פיקסלים סמוכים. בפריים הבא, זה יניב וקטור זרימה תלוי זמן שבמרכזו כל פיקסל עיקול, בעל רזולוציית זמן זהה לנתונים הגולמיים.

לאחר מכן חשב את ממוצעי הזמן של פלט השדה הווקטורי המתקבל על מנת להשוות את הנתונים שנלקחו עם הסטנט לפני החיתוך ובמהלך ריפוי הפצע. כמו כן, חשב היסטוגרמות של מהירויות זרימה כדי לחקור את חוזק הזרימה ושינוי המהירות בפיקסל נתון לאורך זמן על מנת לחקור תנודות זרימה. בעת הדמיה של רצפים עם הסטנט או התא מחולקים לשניים, חשב את השטף הכולל של הציטופלזמה בחזרה לגוף התא הנכון על ידי הכפלת מהירות הזרימה הממוצעת בשטח החתך של בסיס בועות הציטופלזמה החוץ-תאית.

מוצגת כאן הדמיה חיה של סטנט או תא כשהוא נחתך ומשובש באמצעות מחט זכוכית. לאחר החיתוך, כמות משמעותית של ציטופלזמה נשלפה מגוף התא הראשי, אך היא זורמת במהירות חזרה לתא. לאחר הליך זה, ניתן להוסיף מעכבים כימיים על מנת לענות על שאלות נוספות כגון אילו רכיבי שלד ציטו עשויים לתרום לתנועה הציטופלזמית במהלך ריפוי סטנט או פצע.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להכין את הכלים לחיתוך סטנט לתאים שלנו וכיצד לדמות זרימה ציטופלזמית במהלך תהליך החיתוך וריפוי הפצע בתוך התא הענק הבודד.