נהלים לזיהוי פריוני זיהומיות לאחר המעבר דרך מערכת העיכול של מינים עופות

המטרה הכוללת של הליך זה היא לתעד מעבר של חומר PreOn זיהומי דרך מערכת העיכול של העורבים האמריקאים. זה מושג על ידי עורבים ראשונים עם חומר PreOn מדבק. השלב השני הוא לאסוף את צואת העורב במשך ארבע שעות לאחר הגאווג' ולהכין אותה להזרקה לעכברים.

העכברים הבאים מחוסנים תוך צפקית במיליליטר אחד של צואת עורב הומוגנית. השלב האחרון הוא ניטור עכברים מדי יום עד שהם מבטאים סימנים קליניים של גירוד עכברים. בסופו של דבר, ניתוח כתמים מערביים משמש כדי לאשר את נוכחותו של PreOn זיהומי במודל העכבר ולאמת את העברת המחלה.

הרעיון שעורבים יכולים להעביר. CWD הגיע אלינו ביום חורף אחד כאשר לאחר שנסענו למתקן איילים בשבי שם עשינו קצת מחקר וראינו איילים קטלניים ניזונים על ידי עורבים, ומאוחר יותר באותו יום, עורבים יוצאים מהשמיים משום מקום, נוחתים בשקתות ההזנה האלה, ניזונים ממש ליד האיילים, עושים את צרכיהם על התבואה שהאיילים צורכים זאת בנוסף לתצפית מהספרות שהרבה מהספרות עורבים באותו קיץ ברחבי קולורדו, ויומינג חורפים באזור מרוכז בניו מקסיקו, זה בדיוק במקרה שהאזור הזה בניו מקסיקו הוא המקום שבו צצו כמה CABD והוא נמצא במרחק של מאה קילומטרים מאות קילומטרים מהמוקד של מחלת בזבוז הקראק. לכן שתי התצפיות האלה גרמו לנו לחשוב שעורבים פוטנציאליים יכולים למלא תפקיד בהובלת CWD ברחבי הנוף.

הדגמה חזותית של טכניקות אלו היא קריטית מכיוון שטכניקות שגויות של גבאז' תוך-צפקי ואוראלי עלולות לגרום למוות של חיות מחקר. כדי להתחיל, הוסיפו ארבע טיפות צבע כחול לביצה מקושקשת וערבבו היטב. לאחר מכן משוך חמישה מיליליטר מתערובת הצבע והביצים למחט גבג' בגודל שני אינץ 'כשאדם אחד מרסן בעדינות את העורב.

פתחו את מקור העורב רחב מספיק כדי לראות את גרונו והכניסו בזהירות את מחט הגאווג' לוושט שלו. אם מבחינים בשינוי כלשהו בנשימה, הסר את המזרק ונסה שוב מכיוון שייתכן שהוא הוכנס לקנה הנשימה. ברגע שאתה בטוח שמחט הגאוואז' נמצאת בוושט, בטא לאט את תכולת המזרק.

בדוק את העורב כל 30 דקות עד שכבר לא מופרשת צואה מוכתמת בכחול-ירוק. לעורבים לקח כארבע שעות להפסיק להפריש צואה צבועה בכחול. לאחר מכן, הוסף חלק אחד לא נגוע C 57 שחור שישה מוח עכבר לארבעה חלקים PBS סטרילי וכמה חרוזי זכוכית לבלנדר כדורים.

הומוגנייזר הומוגניזציה של הדגימה למשך דקה עד חמש דקות עד להשגת העקביות החלקה. חזור על התהליך באמצעות חולה סופני R ML צ'נדלר נגוע בזן C 57 שחור שישה מוחות עכברים. הצנטריפוגה הבאה ההומוגנית ב 3000 כפול G למשך דקה אחת.

כדי להסיר את החלקיקים הגדולים יותר. לאחר מכן הסר את הסופרנטנט ודלל אותו בנפח שווה של XPBS סטרילי כדי ליצור משקל של 10% לנפח של חומר מוח. ב-PBS יש לאחסן את הדגימות בטמפרטורה שלילית של 80 מעלות צלזיוס עד הצורך 17 שעות לפני הגאווה.

הסר את האוכל אך לא את המים ממכלאות העורבים. הקצו באופן אקראי את העורבים לקבוצות טיפול וגבלו דרך הפה כל עורב בחמישה מיליליטר של מוח עכבר טרי, רגיל או נגוע באמצעות מחט גבאז' בגודל 2 אינץ'. לאחר מכן העבירו את העורבים לכלובים בודדים.

אספו ואספו את כל הצואה בכל כלוב ארבע שעות לאחר הגאווה. לאחר מכן, הומוגניזציה של הצואה המאוגדת עבור כל עורב בהומוגנייזר כדור כחול עם חרוזי זכוכית עד להשגת מרקם אחיד. לאחר מכן קחו 500 מיקרוליטר מהתערובת ודללו אותה מאחד ל -20 עם 9.5 מיליליטר צנטריפוגה PBS סטרילית, הצואה המדוללת הומוגנית למשך 15 דקות.

מוסיפים 1, 300 פעמים G ואז מעבירים את הסופרנטנט לצינור טרי. כדי למזער את האיום של זיהום מיקרוביאלי משני, הוסף יחידה אחת של פניצילין ומיקרוגרם אחד של סטרפטומיצין למיליליטר הומוגנט. לאחר מכן סוניקציה של הדגימות בטור של 3000 מגה פיקסל בהגדרת הספק של 70 למשך 30 שניות כדי לשבש את הממברנה של כל החיידקים שנותרו.

ראשית, הקצו את העכברים באופן אקראי לאחת מארבע הקבוצות שמוצגות כאן. קבוצה ראשונה תקבל צואת עורבים נגועה. קבוצה שנייה תקבל צואת עורבים לא נגועה.

קבוצה שלישית תקבל מוח עכבר נגוע וקבוצה רביעית תקבל מוח עכבר רגיל. ואז עבור קבוצות MN אחת ושתיים, צייר מיליליטר אחד של צואת העורב החיובית או השלילית המגרדת. הומוגנציה באמצעות מחט בגודל 25 בהתאם למספר הקבוצה של העכבר.

לאחר מכן קשקש את העכבר בפרוות הצוואר הגבי שלו. השתמש באגודל ובאצבע המורה וסובב אותו בעדינות כדי לחשוף את הצד הגחוני. הרם את הקצה האחורי של העכבר כך שראשו יהיה מעט נמוך יותר.

הכנס את המחט סנטימטר אחד דרך העור, סנטימטר אחד לרוחב קו האמצע וסנטימטר עד שני סנטימטרים קדמיים למפרק העצה והכסל. לאחר מכן משוך מעט לאחור והזריק את ההומוגני לאט לחלל גוף העכבר. לאחר מכן, הכינו את מוח העכבר הקפוא עם ובלי גרוטאות להזרקה לבעלי החיים בקבוצות שלוש וארבע.

על ידי דילול ראשון של תערובות מלאי האוס אחד עד 10 עם PBS סטרילי. לאחר מכן הזריק מיליליטר אחד של המוח החיובי המדולל הומוגנאט לעכברים בקבוצה השלישית ומיליליטר אחד של המוח השלילי המדולל לתוך העכברים. בבית 4.

עקוב אחר עכברים מדי יום עד שהם מבטאים סימנים קליניים של גירוד עכברים. הסימנים הקליניים עשויים לכלול קיפוזיס, אטקסיה, זנב נוקשה, חוסר טיפוח, רזון ועייפות. ציין את הציון היומי שלי עבור כל אחד מששת הסימנים הקליניים.

כאשר ניכרים סימנים גלויים. אפס שווה ללא סימנים נראים לעין. אחד שווה בינוני ושניים שווה רמה חמורה של סימן.

המתת חסד של עכברים כאשר סך הציונים היומיים עבור כל סימן, מגיע לגדול או שווה לשמונה ליום אחד גדול או שווה לשש ברציפות במשך שלושה ימים או לאחר 365 ימים. לאחר החיסון, קצרו מוחות מיד לאחר המתת חסד ואחסנו אותם בטמפרטורה שלילית של 80 מעלות צלזיוס. לאחר מכן השלך כראוי את הפגרים כדי לאשר אבחנה גרועה.

הפשירו את מוחות העכברים הקפואים והפכו אותם להומוגניזציה בנפרד בהומוגנייזר כדור כחול עם חרוזי זכוכית עד להשגת מרקם אחיד. לאחר מכן, הכינו 125 מיקרוליטר של תמיסת עיכול חלבון K על ידי שילוב של 109.39 מיקרוליטר PBS עם 12.5 מיקרוליטר של 500 מילי-מולרי EDTA ב-pH שמונה ו -3.1 מיקרוליטר של תמיסת 50 מיקרוגרם למיליליטר חלבון K. לאחר מכן הוסף שלושה מיקרוליטר מתמיסת העיכול ל -17 מיקרוליטר של המוח. הומוגנאט.

דגרו את הדגימות בטמפרטורה של 45 מעלות צלזיוס על גוש חום רועד למשך 30 דקות. לאחר סיום הדגירה, השביתו את תמיסת העיכול על ידי הוספת שמונה מיקרוליטרים של מאגר טעינת דפי SDS, ודגרו את הדגימות ב-95 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. לאחר מכן טען את הדגימות לדף SDS של 12%.

אלקטרופורזה של ג'ל החלבונים והעברת הג'ל לקרום IMON PVDF לאחר ההעברה, חסום את קרום ה-PVDF עם 5% חלב ללא שומן ב-PBS עם 0.2% בין 20 ונדנדה למשך שעה בטמפרטורת החדר. לאחר מכן בדוק את הממברנה עם נוגדן חד שבטי 224 ו-IPRP מצומד לצנון סוסים פרוקסידאז מדולל אחד עד 20,000 בסופרבלוק וסלע למשך שעה בטמפרטורת החדר לאחר הדגירה. שוטפים את הממברנה למשך שעה ב-PBS עם 0.2%בין 20.

דמיין את החלבונים על ידי דגירה של הממברנה עם מצע כימילומינסנט למשך חמש דקות. לאחר מכן הדמיה של הממברנה במערכת תיעוד ג'ל G box. עכברים חולים זוהו על ידי ביטוי של סימני גירוד קליניים של עכברים ואישור המחלה הושלם על ידי ניתוח דם מערבי.

מוח עכבר רגיל הומוגני ללא גירוד מוצגים כאן בשני הנתיבים השמאליים עם ובלי עזרת פרוטאז K ללא פרוטאז K נראים שלוש עיקולים. עם זאת, מכיוון שהחלבון הרגיל רגיש לחלבונים, העיקולים אינם נראים בנתיב השני. נתיב 3 מציג דגימת ביקורת חיובית מעוכלת פרוטאז.

הפרוטאזות גורמות לשינוי בשלושת הרצועות המקוריות עקב אובדן הטרמיני n ו-c של החלבונים. אבל החלבונים הנגועים אינם מסוגלים להתעכל לחלוטין כפי שהיו בדגימת המוח הרגילה. המוח המעוכל של פרוטאינאז K מעכבר שחוסן בצואה מעורב מחוסן מוצג מימין ומאשר את נוכחותם של פריונים בדגימה מכיוון שהרצועות אינן מתעכלות.

לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לך הבנה טובה יותר כיצד לתעד את המעבר של חומר פריון זיהומי דרך מערכת העיכול של עורבים. לאחר מכן אמת את ההדבקה באמצעות בדיקה ביולוגית של עכבר בין-צפק.