Name: דור מהיר של עמילואיד מחלבונים שפת אם במבחנה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-05T16:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 48 s
Description: למד שיטה מהירה ליצירת סיבי עמילואיד מחלבונים במבחנה באמצעות חימום וקישור כימי. שיטה זו מאפשרת חקר מנגנוני קיפול חלבונים שגוי ומחלות קשורות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכת על ידי מענקים ל-W.C. מהמכונים הלאומיים לבריאות AI074809 ותוכנית מענק המחקר המוסדי של מרכז הסרטן M. D. Anderson של אוניברסיטת טקסס.

1. הכן מאגר MES
<ol>
	<li>השתמש במאגר MES (0.1 M 2-(N-morpholino) חומצה אתנסולפונית ו-0.9 M NaCl) כדי להכין גם עמילואיד חלבון בלבד וגם אוליגומרים של חלבון מסיס מיוצב. שוקל 1.95 גרם MES ו-5.27 גרם NaCl. הוסף H2O והתאם את ה-pH ל-4.7. הרכיבו את הנפח הסופי ל-100 מ"ל. יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך עד 6 חודשים.</li>
</ol>
2. הכן עמילואיד חלבון בלבד ישירות מחלבונים טבעיים
<ol>
	<li>שקלו חלבון לבחירתכם (כל חלבון או פפטיד מקומי) והרכיבו מחדש ל-10 מ"ג/מ"ל במאגר MES.</li>
	<li>דגירה בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס באמבט מים למשך 4 שעות. בסוף התקופה, משקעים לבנים נראים בתמיסה.</li>
	<li>נטרל את הדגימה עם 10% (v/v) של Tris-HCl (1 M, pH 10.5).</li>
	<li>דיאליזה של החלבון בקלטת דיאליזה למשך הלילה כדי להחליף למאגר הרצוי להמשך ניתוח.</li>
	<li>ניתן להכין דגימת בקרה של חלבון מקומי על ידי ביצוע שלבים 2.1, 2.3 ו-2.4 ללא משקעי חום (שלב 2.2).</li>
</ol>
3. הכן עמילואיד היברידי מאוליגומרים מסיסים מיוצבים של חלבונים מקומיים
<ol>
	<li>הכן אוליגומרים של חלבון מסיס מיוצב
	<ol>
		<li>שקלו חלבון לבחירתכם והרכיבו מחדש ל-10 מ"ג/מ"ל במאגר MES. השאירו בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות.</li>
		<li>שקלו 1-ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl] carbodiimide hydrochloride (EDC) והכינו מלאי טרי של 20 מ"ג/מ"ל במאגר MES.</li>
		<li>מערבבים תמיסות חלבון ו-EDC ביחס של 2:5 (v/v), כלומר 2 מ"ג חלבון לכל 10 מ"ג EDC.</li>
		<li>דגירה בטמפרטורת החדר למשך שעתיים.</li>
		<li>נטרל את הדגימה עם 10% (v/v) של Tris-HCl (1 M, pH 10.5).</li>
		<li>דיאליזה של החלבון בקלטת דיאליזה למשך הלילה כדי להחליף למאגר הרצוי להמשך ניתוח.</li>
		<li>אחסן את אוליגומר החלבון המסיס המיוצב בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד 4 שבועות.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>הכן עמילואידים היברידיים מאוליגומר חלבון מסיס מיוצב.
	<ol>
		<li>להכנת עמילואיד המכיל DNA, מערבבים DNA ואוליגומר חלבון מסיס מיוצב ביחס של 1:1 (w/w). השאירו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך שעתיים לפחות. במהלך תקופה זו, משקעים בלתי מסיסים נראים בתמיסה כאשר ריכוז החלבון הראשוני הוא 0.5 מ"ג/מ"ל ומעלה.</li>
		<li>להכנת עמילואיד המכיל RNA, מערבבים RNA ואוליגומר חלבון מסיס מיוצב ביחס של 1:1 (w/w). השאירו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך שעתיים לפחות. במהלך תקופה זו, משקעים בלתי מסיסים נראים בתמיסה כאשר ריכוז החלבון הראשוני הוא 0.5 מ"ג/מ"ל ומעלה.</li>
		<li>להכנת עמילואיד המכיל הפרין, מערבבים הפרין ואוליגומר חלבון מסיס מיוצב ביחס של 1:1 (w/w). השאירו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך שעתיים לפחות. במהלך תקופה זו, משקעים בלתי מסיסים נראים בתמיסה כאשר ריכוז החלבון הראשוני הוא 0.5 מ"ג/מ"ל ומעלה.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Selkoe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folding+proteins+in+fatal+ways%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Folding proteins in fatal ways.</a> Nature. 426, 900-904 (2003).</li>
<li>Schnabel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+folding%3A+The+dark+side+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Protein folding: The dark side of proteins.</a> Nature. 464, 828-829 (2010).</li>
<li>Goldberg, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+degradation+and+protection+against+misfolded+or+damaged+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Protein degradation and protection against misfolded or damaged proteins.</a> Nature. 426, 895-899 (2003).</li>
<li>Chiti, F., Dobson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+misfolding%2C+functional+amyloid%2C+and+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Protein misfolding, functional amyloid, and human disease.</a> Annu. Rev. Biochem. 75, 333-366 (2006).</li>
<li>Goldschmidt, L., Teng, P. K., Riek, R., Eisenberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+the+amylome%2C+proteins+capable+of+forming+amyloid-like+fibrils%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Identifying the amylome, proteins capable of forming amyloid-like fibrils.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 3487-3492 (2010).</li>
<li>Fowler, D. M., Koulov, A. V., Balch, W. E., Kelly, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+amyloid+-+from+bacteria+to+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem.+Sci%22%5BJournal%5D)">Functional amyloid - from bacteria to humans.</a> Trends Biochem. Sci. 32, 217-224 (2007).</li>
<li>Chapman, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Escherichia+coli+Curli+Operons+in+Directing+Amyloid+Fiber+Formation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Role of Escherichia coli Curli Operons in Directing Amyloid Fiber Formation.</a> Science. 295, 851-855 (2002).</li>
<li>Barnhart, M. M., Chapman, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Curli+Biogenesis+and+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Curli Biogenesis and Function.</a> Annu. Rev. Microbiol. 60, 131-147 (2006).</li>
<li>Claessen, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+n%09olved+in+aerial+hyphae+formation+in+Streptomyces+coelicolor+by+forming+amyloid-like+fibrils%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A n	olved in aerial hyphae formation in Streptomyces coelicolor by forming amyloid-like fibrils.</a> Genes Dev. 17, 1714-1726 (2003).</li>
<li>Maji, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+Amyloids+As+Natural+Storage+of+Peptide+Hormones+in+Pituitary+Secretory+Granules%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Functional Amyloids As Natural Storage of Peptide Hormones in Pituitary Secretory Granules.</a> Science. 325, 328-332 (2009).</li>
<li>Badtke, M. P., Hammer, N. D., Chapman, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+Amyloids+Signal+Their+Arrival%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Signal%22%5BJournal%5D)">Functional Amyloids Signal Their Arrival.</a> Sci. Signal. 2, pe43(2009).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RIP1%2FRIP3+Necrosome+Forms+a+Functional+Amyloid+Signaling+Complex+Required+for+Programmed+Necrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The RIP1/RIP3 Necrosome Forms a Functional Amyloid Signaling Complex Required for Programmed Necrosis.</a> Cell. 150, 339-350 (2012).</li>
<li>Hou, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MAVS+forms+functional+prion-like+aggregates+to+activate+and+propagate+antiviral+innate+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">MAVS forms functional prion-like aggregates to activate and propagate antiviral innate immune response.</a> Cell. 146, 448-461 (2011).</li>
<li>Stefani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+and+biophysical+features+of+both+oligomer%2Ffibril+and+cell+membrane+in+amyloid+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">Biochemical and biophysical features of both oligomer/fibril and cell membrane in amyloid cytotoxicity.</a> FEBS J. 277, 4602-4613 (2010).</li>
<li>Glabe, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+classification+of+toxic+amyloid+oligomers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Structural classification of toxic amyloid oligomers.</a> J. Biol. Chem. 283, 29639-29643 (1074).</li>
<li>Di Domizio, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+with+nucleic+acids+or+glycosaminoglycans+converts+soluble+protein+oligomers+to+amyloid%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Binding with nucleic acids or glycosaminoglycans converts soluble protein oligomers to amyloid.</a> J. Biol. Chem. 287, 736-747 (2012).</li>
<li>Zhang, X., Li, J. -P., Lijuan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heparan+sulfate+proteoglycans+in+amyloidosis%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Mol.+Biol.+Transl.+Sci%22%5BJournal%5D)">Heparan sulfate proteoglycans in amyloidosis.</a> Prog. Mol. Biol. Transl. Sci. 93, 309-334 (2010).</li>
<li>Jiménez, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-DNA+Interaction+at+the+Origin+of+Neurological+Diseases%3A+A+Hypothesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Alzheimer%27s+Dis%22%5BJournal%5D)">Protein-DNA Interaction at the Origin of Neurological Diseases: A Hypothesis.</a> J. Alzheimer's Dis. 22, 375-391 (2010).</li>
<li>Bhattacharya, M., Jain, N., Mukhopadhyay, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+the+Mechanism+of+Aggregation+and+Fibril+Formation+from+Bovine+Serum+Albumin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+Chem.+B%22%5BJournal%5D)">Insights into the Mechanism of Aggregation and Fibril Formation from Bovine Serum Albumin.</a> J. Phys. Chem. B. 115, 4195-4205 (2011).</li>
<li>Vetri, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bovine+Serum+Albumin+protofibril-like+aggregates+formation%3A+Solo+but+not+simple+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Biochem.+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Bovine Serum Albumin protofibril-like aggregates formation: Solo but not simple mechanism.</a> Arch. Biochem. Biophysics. 508, 13-24 (2011).</li>
<li>Bucciantini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inherent+toxicity+of+aggregates+implies+a+common+mechanism+for+protein+misfolding+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Inherent toxicity of aggregates implies a common mechanism for protein misfolding diseases.</a> Nature. 416, 507-511 (2002).</li>
<li>McParland, V. J., Kalverda, A. P., Homans, S. W., Radford, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+properties+of+an+amyloid+precursor+of+b2-microglobulin%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Structural properties of an amyloid precursor of b2-microglobulin.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 9, 326-331 (2002).</li>
<li>Chiti, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designing+conditions+for+in+vitro+formation+of+amyloid+protofilaments+and+fibrils%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Designing conditions for in vitro formation of amyloid protofilaments and fibrils.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 3590-3594 (1999).</li>
<li>McParland, V. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partially+Unfolded+States+of+b2-Microglobulin+and+Amyloid+Formation+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Partially Unfolded States of b2-Microglobulin and Amyloid Formation in vitro.</a> Biochemistry. 39, 8735-8746 (2000).</li>
<li>Liu, K., Cho, H. S., Lashuel, H. A., Kelly, J. W., Wemmer, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+glimpse+of+a+possible+amyloidogenic+intermediate+of+transthyretin%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">A glimpse of a possible amyloidogenic intermediate of transthyretin.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 7, 754-757 (2000).</li>
<li>Pfefferkorn, C. M., McGlinchey, R. P., Lee, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+pH+on+aggregation+kinetics+of+the+repeat+domain+of+a+functional+amyloid%5BTitle%5D)+AND+%22Pmel17.+Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Effects of pH on aggregation kinetics of the repeat domain of a functional amyloid.</a> Pmel17. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 21447-21452 (2010).</li>
<li>Di Domizio, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleic+acid-containing+amyloid+fibrils+potently+induce+type+I+interferon+and+stimulate+systemic+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Nucleic acid-containing amyloid fibrils potently induce type I interferon and stimulate systemic autoimmunity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 14550-14555 (2012).</li>
<li>Halle, A., Hornung, V., Petzold, G. C., Stewart, C. R., Monks, B. G., Reinheckel, T., Fitzgerald, K. A., Latz, E., Moore, K. J., Golenbock, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+NALP3+inflammasome+is+involved+in+the+innate+immune+response+to+amyloid-%CE%B2%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The NALP3 inflammasome is involved in the innate immune response to amyloid-β.</a> Nat. Immunol. 9, 857(2008).</li>
<li>Masters, S. L., O'Neill, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease-associated+amyloid+and+misfolded+protein+aggregates+activate+the+inflammasome%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Disease-associated amyloid and misfolded protein aggregates activate the inflammasome.</a> Trends Mol. Med. 17, 276-282 (2011).</li>
</ol>

אין לנו מה לחשוף.

השיטה המתוארת כאן מציעה אמצעי מהיר וגמיש להכנת סיבי עמילואיד במבחנה כמעט מכל חלבון או פפטיד לבחירה. ניתן להכין באופן אמין מספר סוגים שונים של עמילואיד - סיבי חלבון בלבד או אגרגטים היברידיים המכילים DNA, RNA או גליקוזאמינוגליקנים. הנהלים המעורבים הם פשוטים, ישירים ואינם דורשים הכשרה טכנית מתקדמת. העמילואיד שהוכן בשיטה זו יציב למדי וניתן לאחסן אותו בבטחה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס או להקפיא בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס לתקופה ארוכה יותר.
אחד הגורמים הקריטיים ביותר להבטחת ייצור מוצלח ש...

חלבונים הם המקרומולקולות הביולוגיות הנפוצות ביותר הקיימות בכל סוגי התאים. הם מופיעים במגוון גדול של גדלים, מבנים ושינויים לאחר התרגום, וממלאים מגוון עצום של פונקציות ביולוגיות חשובות כאשר הם בצורתם המקורית. יותר משני תריסר פוליפפטידים חריגים היו מעורבים במצבים פתולוגיים אנושיים רבים, כגון מחלת אלצהיימר, מחלת פרקינסון וסוכרת מסוג2 1-4. החלבונים הסופיים המקופלים בצורה לא נכונה מצטברים כסיבי עמילואיד את האגרגטים היציבים הבלתי מסיסים המתרחשים מחוץ לתאית או תוך תאית.
למרות ההשלכות של חלבונים ספציפיים במחלות מסוימות, ראיות הולכות וגדלות תומכות ברעיון שלכל הפוליפפטידים יש תכונות מהותיות המאפשרות טרנספורמציה של עמילואיד. סקר רצף כלל-גנומי זיהה את ה"עמילום", לפיו שברים המועדים לעמילואיד מהווים כ-15% מכלל מקטעי הפפטידים המקודדים מ-E. coli לבני אדם5. בהתאם לכך, התגלה בשנים האחרונות מספר הולך וגדל של עמילואידים פונקציונליים, המשתתפים בתהליכים תאיים חשובים שונים. לדוגמה, חיידקים מרכיבים עמילואידים ליצירת מבני ביופילם ונבגים שהם קריטיים להישרדותם ולפתוגנזהשלהם 6-9. הורמוני פפטיד יוצרים משקעי עמילואיד במהלך האחסון בתוך גרגירי הפרשה של יונקים לפני שחרורם, מה שמרמז עוד יותר על כך שצורת החלבון עמילואיד יכולה לשרת פונקציות ביולוגיות מועילות6,10,11. יתר על כן, חלבונים יכולים גם להתאסף לסיבי עמילואיד כדי להעביר אותות תאיים קריטיים12,13.
במשך שנים רבות, העמילואידים הנחקרים ביותר מוכנים מפפטידים בודדים הקשורים למחלות אנושיות, כגון עמילואיד בטא או פפטיד פריון. פפטידים אלה בדרך כלל חסרים מבנה מוגדר היטב ויוצרים באופן ספונטני עמילואיד בתמיסה לאורך זמן, תהליך המתווך על ידי ביניים לא מקופל חלקית המשמש כמבשר של עמילואיד בלתי מסיס. קודמן העמילואיד נקרא גם אוליגומר חלבון מסיס, שהוא נדיר ולא יציב כאשר הוא נוצר מפפטידים טבעיים14,15. עם זאת, כפי שתואר קודם לכן, כמעט כל חלבון באופן עקרוני יכול לאמץ קונפורמציה של עמילואיד בתנאים המתאימים. לאחרונה הקמנו שיטה להכנת אוליגומרים מסיסים מיוצבים של חלבונים מקומיים, היוצרים עמילואיד בקלות בנוכחות קופקטורים שונים16. סיבי העמילואיד המתקבלים משקפים את האופי המורכב של אגרגטים של קיפול שגוי של החלבון הסופי17,18. כאן אנו משתמשים במונח עמילואיד חלבון בלבד כדי להפנות את סיבי החלבון ללא קופקטורים ועמילואיד היברידי לסיבים המכילים רכיבים לא חלבונים.
בעבר, פותחו שיטות שונות ליצירת עמילואיד במבחנה על ידי יישום תנאים הידועים כמעדיפים קיפול שגוי של חלבון, כגון טמפרטורה גבוהה, סביבה הידרופובית ושינויי pH19-23. עם זאת, הם קשורים לבעיות שונות, כגון יעילות נמוכה, קיפול הפיך, וריאציות אצווה גדולות או קינטיקה איטית. הגישה המתוארת כאן ניתנת לשחזור, קלה להרחבה, ומאפשרת לשלוט במדויק בתזמון ובמצב של המרת עמילואיד.

<table><tbody><tr><td>2-(N-מורפולינו)חומצה אתנסולפונית (MES)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8250</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>BP358-10</td><td></td></tr><tr><td>1-ethyl-3-[3-dimethyl-aminopropyl] carbodiimide hydrochloride (EDC)</td><td>Thermo/Pierce</td><td>22980</td><td></td></tr><tr><td>DNA מזרע סלמון</td><td>Sigma</td><td>D1626</td><td></td></tr><tr><td>RNA משמרי טורולה</td><td>Sigma</td><td>R6625</td><td></td></tr><tr><td>הפרין מרירית מעי חזיר</td><td>Sigma</td><td>H3149</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Fisher</td><td>BP152-1</td><td></td></tr><tr><td>ציוד:</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>אמבט מים</td><td>Fisher Science</td><td>Isotemp 210</td><td></td></tr><tr><td>קלטת דיאליזה Slide-A-Lyzer</td><td>Thermo / Pierce</td><td>66380</td><td></td></tr></tbody></table>

דור מהיר של עמילואיד מחלבונים שפת אם<em&gt; במבחנה</em

Rapid Generation of Amyloid from Native Proteins In vitro

חלבונים לבצע משימות קריטיות באורגניזמים באמצעות הפעלת פונקציות שהושרו משלושה קפלי ממדים הספציפיים שלהם. למרות שמבני יליד פוליפפטידים להגשים מטרות רבות, עכשיו זה הכיר בכך שרוב החלבונים יכולים לאמץ הרכבה חלופית של עמילואיד ביתא העשיר גיליון. סיבי עמילואיד מסיסים בתחילה קשורים למחלות אנושיות מרובות, אבל הם מוצגים יותר ויותר כשחקנים פונקציונליים משתתפים בתהליכים תאיים חשובים שונים. בנוסף, עמילואיד הופקד ברקמות מטופל מכיל רכיבי nonproteinaceous, כגון חומצות וglycosaminoglycans (בדיחות) גרעין. cofactors אלה יכול להקל על היווצרות של עמילואיד, וכתוצאה מדור סוגים שונים של משקעים בלתי מסיסים של. על ידי ניצול של ההבנה שלנו כיצד חלבוני misfold באמצעות שלב ביניים של מקדים עמילואיד מסיס, שפתחנו שיטה להמיר חלבוני יליד סיבי עמילואיד במבחנה </em&gt;. גישה זו מאפשרת לאדם להכין עמילואיד בכמויות גדולות, בדוק את המאפיינים של עמילואיד נוצרו מחלבונים ספציפיים, ולהעריך את השינויים המבניים המלווים את ההמרה.

היכולת להמיר חלבונים טבעיים ישירות לאמילואיד נשענת על השינוי הקונפורמציונלי המתרחש בטמפרטורה גבוהה במערך MES. שקיעה בתמיסה מהווה אינדיקציה טובה לאגרגציה של חלבונים וייתכן שמעידה על היווצרות אמילואיד. מאידך, כדי לאפשר ייצוב של אוליגומרים של חלבונים ממיסים, נעשה שימוש ב-EDC ליצירת קשרים צולבים בין החלבונים, במטרה להקשיח את הקונפורמציה האוליגומרית שהשתחלה בתמיסת ה-MES. כתוצאה מכך, האוליגומרים המיוצבים של החלבונים הם חלבונים מולטמריים (איור 1), המובחנים מחלבון טבעי מונומרי או מאגרגטים המושרים על ידי חום כאשר...

חלבונים יכולים לאמץ מבנה מקורי או להתקפל בצורה לא נכונה לעמילואיד בלתי מסיס. תנאים המעדיפים את מסלול הקיפול הלא נכון מובילים להיווצרות סוגים שונים של סיבי עמילואיד. השיטות המתוארות כאן מאפשרות המרה מהירה של חלבונים מקומיים לעמילואיד במבחנה.

Proteins carry out crucial tasks in organisms by exerting functions elicited from their specific three dimensional folds. Although the native structures ...

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא להשיג במהירות עמילואיד fis מכל חלבון במבחנה. זה מושג על ידי המסת החלבון הנבחר במאגר MES כדי לגרום לקיפול שגוי של המבנה. לאחר מכן ניתן לדגור את החלבון בטמפרטורה גבוהה, מה שמקדם היווצרות עמילואיד בהיעדר גורמים משלימים אחרים.לחלופין, החלבון מקושר על ידי EDC על מנת ליצור רצועות חלבון מסיסות מיוצבות, קודמן העמילואיד. לבסוף, גורמים משלימים שאינם חלבונים מעורבבים עם אוליגומרים של חלבון מסיס מיוצב כדי לאפשר היווצרות של עמילואיד היברידי מתקבלות תוצאות המראות כי ניתן להמיר חלבונים מקומיים בקלות לאישור עמילואיד כאשר הם מקלים על ידי תנאים נוחים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח במחלות קיפול שגוי של חלבונים, כגון כיצד בדיוק נוצר עמילואיד מאוליגומרים של חלבונים מסיסים, והאם לסוגים שונים של עמילואיד יש פונקציות ביולוגיות ופתולוגיות מובהקות.כדי להתחיל, הכן מאגר MES כמתואר בפרוטוקול הטקסט הן עבור חלבון עמילואיד בלבד והן עבור חלבון מסיס מיוצב. לאחר מכן כל הרצועות שוקלות את החלבון הנבחר ומרכיבות אותו מחדש ל-10 מיליגרם למיליליטר במאגר MES. בהדגמה זו משתמשים באלבומין בסרום אנושי או HSA, דגירה על התמיסה ב-65 מעלות צלזיוס באמבט מים למשך ארבע שעות.בסוף התקופה נראה משקע לבן בתמיסה. נטרל את הדגימה עם 10% נפח לנפח. T tris, HCL מבצעת דיאליזה של החלבון בקלטת דיאליזה למשך הלילה כדי להחליף למאגר הרצוי.לניתוח נוסף, הכינו דגימת בקרה של חלבון מקומי על ידי ביצוע השלבים הבאים ללא משקעי חום. להכנת חלבון מסיס מיוצב, כל הרצועות שוקלות את החלבון הנבחר ומרכיבות אותו מחדש ל-10 מיליגרם למיליליטר. במאגר MES, השאירו את תמיסת החלבון בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות.הכן מלאי טרי של 20 מיליגרם למיליליטר EDC במאגר MES. מערבבים את תמיסות החלבון וה-EDC ביחס של שתיים עד חמש, ואז מדגרים בטמפרטורת החדר למשך שעתיים לאחר הדגירה. נטרל את הדגימה עם 10% נפח לנפח של tris HCL דיאליזה של החלבון בקלטת דיאליזה למשך הלילה להחלפה למאגר הרצוי.לניתוח נוסף. אחסן את החלבון המסיס המיוצב כל הרצועה בארבע מעלות צלזיוס למשך עד ארבעה שבועות. תרחיף זה ישמש להכנת עמילואידים היברידיים להכנת ה-DNA המכיל עמילואיד וה-RNA המכיל עמילואיד.מערבבים, חומצת הגרעין והחלבון המסיס המיוצב כולם רצועות ביחס של אחד לאחד. השאירו את התערובת בחום של ארבע מעלות צלזיוס למשך שעתיים לפחות במהלך תקופה זו. משקעים בלתי מסיסים נראים בתמיסה כאשר ריכוז החלבון הראשוני הוא 0.5 מיליגרם למיליליטר ומעלה.כדי להכין את תערובת הפרין המכילה עמילואיד הפרין וחלבון מסיס מיוצב, כל הרצועות ביחס של אחד לאחד לפני הדגירה בארבע מעלות צלזיוס למשך שעתיים לפחות. בדומה לחומצת הגרעין המכילה עמילואידים במשקעים מסיסים נראית בתמיסה. כאשר ריכוז החלבון הראשוני הוא 0.5 מיליגרם למיליליטר ומעלה, היכולת להמיר חלבונים מקומיים ישירות לעמילואיד מסתמכת על השינוי המאשר שנוצר בטמפרטורה גבוהה.במאגר MES, משקעים בתמיסה הם אינדיקציה טובה לצבירת חלבונים והיווצרות עמילואיד אפשרית כדי לאפשר לאוליגומרים של חלבונים מסיסים להתייצב. EDC משמש לקישור צולב של החלבונים כדי למצק את האישור האוליגומרי המושרה במאגר MES. כתוצאה מכך, החלבון המיוצב allgas הם חלבונים מולטימריים הנבדלים מחלבון מקומי מונומרי או אגרגטים המושרים על ידי חום.כאשר מופרדים על ידי חלבון מסיס מיוצב בדף SDS, כל הרצועות יכולות להיקשר בקלות לחומצות גרעין, כולל DNA ו-RNA באופן בלתי תלוי ברצף. לכן, ניתן לבצע בדיקת הסטת ג'ל כדי לדמיין את האינטראקציה הישירה בין החלבון המסיס המיוצב, כל הרצועות וה-DNA, מה שיגרום לנדידה מפגרת של DNA על ג'ל AROS. ציטוטוקסיות היא אופי ארכיטיפי של חלבון מסיס.כל הרצועות ייצבו חלבון מסיס, כל הרצועות הושרו במינון תלוי מוות תאים הניתן לזיהוי על ידי מיון תאים מופעל פלואורסצנטי. כפי שמוצג כאן, תאי RP I 8 2 2 6 רגישים ביותר לחלבון מסיס, כל המוות הנגרם על ידי רצועה הנמדד על ידי צביעת פרופידיום יודיד. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להכין סוגים שונים של עמילואיד מכל חלבון לבחירתך במבחנה.

rapid-generation-of-amyloid-from-native-proteins-in-vitro

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

SDD-AGE היא טכניקה יעילה לגילוי ואפיון של עמילואיד פולימרים דמויי תאים. כאן אנו מדגימים עיבוד שעושה בטכניקה זו מקובל יישומים בקנה מידה גדול.

הקרנת עבור צבירת עמילואיד על ידי חצי Denaturing אלקטרופורזה דטרגנט-agarose ג&#39;ל

מקור: Balczon, R., et al. שיטות לאיתור עמילואידים ציטוטוקסיים בעקבות זיהום של תאי אנדותל ריאתיים על ידי Pseudomonas aeruginosa. J. Vis. Exp. (2018)סרטון זה מדגים את ההליך ליצירת סופרנטנט ציטוטוקסי מתאי אנדותל ריאתיים לאחר זיהום ב-Pseudomonas aeruginosa. הוא מתאר כיצד חלבוני אפקטור חיידקיים משבשים את מבנה התא המארח וגורמים לשחרור של אוליגומרים עמילואידים ציטוטוקסיים לתוך הסופרנטנט.

השגת עמילואידים ציטוטוקסיים בעקבות זיהום חיידקי של תאי אנדותל ריאתיים של חולדות

אנו מתארים שיטות ללמוד היבטים של amylopathies...

<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em&gt; מערכת מודל לחקר Amylopathy

שיטה כרומטוגרפית דו-שלבית מתוארת לטיהור חלבון Shadoo רקומביננטי המתבטא כגופי הכללה ב-Escherichia coli, כמו גם פרוטוקול לסיבית Shadoo מטוהר למבני עמילואיד.

טיהור וקפל שוב לעמילואיד סיבים של (שלו)<sub&gt; 6</sub&gt; חלבון רקומביננטי Shadoo -tagged מבוטא גופי הכללה ב<em&gt; חיידק</em

פרוטוקול ביטוי קל לשימוש ונטול תאים לשילוב ספציפי לשאריות של אנלוגים של חומצות אמינו לא קנוניות בחלבונים, כולל ניתוח במורד הזרם, מוצג למחקרים רפואיים, פרמצבטיים, מבניים ופונקציונליים.

שאריות ספציפיות התאגדות של חומצות אמינו Noncanonical לחלבוני דגם שימוש<em&gt; Coli Escherichia</em&gt; חינם-Cell מערכת-תמלול תרגום

יש דרישה לעשות ניסויים פרה-קליניים של בדיקות עבור מחלקה הרומן של תרופות היתום"בשם מלווים תרופתי לשחזור, מהיר ויעיל. פיתחנו assay המבוסס על תרבות של תאים פשוטים מאוד מתוקננת, תכליתי למסך המטופלים זכאים, כמו גם רומן המלווה תרופתי סמים.

במבחנה אנזים המדידה לנקודת מבחן תגובתיות המלווה תרופתי פאברי, מחלת הפומפה

שיטות פשוטות מתוארים על הפגנת הייצור של amyloids ציטוטוקסיות בעקבות זיהום של אנדותל ריאתי על ידי Pseudomonas aeruginosa.

שיטות זיהוי ציטוטוקסיות Amyloids הבאים זיהום של אנדותל תאי הריאות על ידי Pseudomonas aeruginosa

כאן אנו מציגים פרוטוקול לנתח אספרגילוס flavus צמיחה וייצור aflatoxin ב תירס גרעינים ביטוי של חלבונים נגד פטריות.  באמצעות זן GFP-לבטא flavus א לנו פיקוח זיהום או התפשטות הפטרייה ב גרעינים בוגרת בזמן אמת. וזמינותו היא מהירה, אמינה, לשחזור.

עיכוב של צמיחה אספרגילוס flavus Aflatoxin ייצור הטרנסגניים תירס לבטא מעכב α-עמילאז מן Lablab purpureus ל'

בתנאי זה הוא פרוטוקול לחקירת האינטראקציות בין הצורה הטבעית, prefibrillar, ו-עמילואיד בוגרים של פפטידים וחלבונים שונים עם המיטו, מבודדים מרקמות שונות ואזורים שונים של המוח.

אינטראקציות עם חדירות ממברנה של המיטותית המוח על ידי עמילואיד Fibrils

כאן, אנו מתארים מערכת שמרים המשחזרת γ-הפרשה אנושית. מערכת זו מאפשרת זיהוי ומחקר של מוטציות המשפיעות על הפעילות ובדיקת מעכבי γ-סקרטאז (GSI). תוך ניצול תכונות אובדן התפקוד של מוטציות משפחתיות של מחלת אלצהיימר, ניתן לסנן מאפנני γ-סקרטאז (GSM).

שמרי אפייה (Saccharomyces cerevisiae) מודלים של מחלת אלצהיימר לסינון גנים, מוטציות וכימיקלים המשפיעים על ייצור בטא עמילואיד על ידי γ-secretase

למד שיטה מהירה ליצירת סיבי עמילואיד מחלבונים במבחנה באמצעות חימום וקישור כימי. שיטה זו מאפשרת חקר מנגנוני קיפול חלבונים שגוי ומחלות קשורות.

דור מהיר של עמילואיד מחלבונים שפת אם

גלה סרטונים נוספים