שימוש במשטח סורקים לאיסוף תמונות-פקע זמן ברזולוציה גבוהה של ארבידופסיס רוט Gravitropic התגובה
25 בינואר 2014
פרוטוקול זה מתאר תהליך לאיסוף מהיר של תמונות של שתילי ארבידופסיס להגיב לגירוי הכבידה באמצעות סורקים שטוחים, זמינים מסחרי. השיטה מאפשרת לכידה של תמונות ברזולוציה גבוהה נוחות לניתוח אלגוריתמים במורד הזרם זול, בנפח גבוה.
המטרה הכוללת של סרטון זה היא להמחיש שיטה מבוססת סורק של לכידת תמונה ברזולוציה גבוהה של התגובה הטרופית השורשית באופסיס של צמח המודל. כדי להתחיל בפרוטוקול זה, זרעים ממלאי הזרעים המיועד נשתלים על צלחות פטרי המכילות מצע שקוף לאחר שהזרעים נבטו לפרק הזמן המיועד, צלחות פטרי מוסרות מתא הגידול, מוכנות לסריקה, ואז מונחות בסורקים שטוחים בכיוון אנכי. לאחר מכן הופכים את הלוחות ב-90 מעלות ונסרקים לפרק זמן מוגדר.
התמונות נשמרות במחשב או בהתקן אחסון נתונים ומשמשות מאוחר יותר לעיבוד תמונה. לפני רכישת התמונה, הכינו צלחות אגה המכילות את שתי רקמות הצמח הסרוקות B. ראשית, ספגו כל עיבוי שנאסף על המכסה והדפנות של צלחת ה-AGA בעזרת מגבון קים.
לאחר מכן, יש למרוח כמות נדיבה של Triton X 100 כדי למנוע עיבוי עתידי. לבסוף, סיים תהליך זה על ידי עטיפת הצלחת בסרט מיקרופור כדי לאבטח את המכסה ולאפשר לאוורור להתחיל ברכישת תמונה. הגדר תיקיות לשמירת התמונות במיקום הרצוי.
כל שם תיקיה מורכב מאוסף של מטה-נתונים המתייחסים למידע שיש לסרוק. בדוגמה זו, גיל, גודל ומלאי זרעים ייחודיים היו נתונים שנכללו בשמות התיקיות. לאחר מכן ניתן להעתיק ולהדביק מטה-נתונים אלה בשם תיקיה.
פרוטוקול זה מניח שנעשה שימוש ביותר מסורק אחד לאיסוף תמונות ומספק הוראות לחיבור סורקים מרובים למחשב אחד. מסיבה זו, מוגדרות שלוש תיקיות לשמירת תמונות. השלב הבא הוא הגדרת הטיימרים לזמן איסוף ייעודי.
מכיוון שיש עדיין לא מעט הכנה לעשות בשלב זה, הקפד לכוון את הטיימרים לקצת יותר זמן. לאחר מכן, הפעל את הסורק הראשון ופתח את תוכנית הסריקה view. תחת הכרטיסייה קלט, הגדר את המקור לסורק הנכון ואת התיבה הנפתחת חזרה אוטומטית לללא תחת הכרטיסייה חיתוך.
הגדר את אזור התצוגה המקדימה למקסימום ולחץ על תצוגה מקדימה. בחר תיבת חיתוך שתלכוד את אזור העניין והגדר את אזור התצוגה המקדימה לתיבת חיתוך. לאחר מכן הציגו שוב תצוגה מקדימה של התמונה.
כדי לשמור את הנתונים שנאספו במיקום הרצוי, לחץ על לשונית הפלט ומצא את שמות התיקיות שנוצרו בעבר התואמים לכל סורק. הפעל את הסורק הבא וחזור על סריקת התצוגה. הגדר הוראות עבור שני הסורקים האחרים, והקפד לבחור את התיקיות הנכונות לשמירת הנתונים.
חשוב גם לעבור על כל כרטיסייה ולוודא שכל הגדרות הסורק הן כרצונך. המעבדה שלנו מצאה שההגדרות הבאות מתאימות ביותר לסוג איסוף התמונות שמתבצע. עם זאת, סוגים שונים של איסוף תמונות עשויים לדרוש הגדרות אחרות.
לאחר בדיקת כל ההגדרות, בחר את כרטיסיית הקלט והגדר את התיבה הנפתחת חזרה אוטומטית לרציפה בכל שלושת הסורקים. הנח את הלוחות המוכנים בסורקים כשהשתילים מכוונים אופקית והנח באופן זמני את צד הלבד של הרקע כנגד הלוחות כדי להבטיח יציבות בסורק. אם מבצעים פרוטוקול זה עם בן זוג, אדם אחד מסובב את הלוחות ב-90 מעלות ומיד את הרקע המורגש, האדם השני לוחץ על כפתור הסריקה ושניהם מאבטחים את הרקע לסורק באמצעות כבל בנג'י.
חזרה על תהליך זה עבור סורקים 2 ו-3. סריקה מלאה של כל תמונה אמורה להימשך כשתיים עד שלוש דקות התמונות הסופיות יופיעו כפי שמוצג. מומלץ לבדוק את התיקיות שבהן נשמרות התמונות כדי לוודא שכולן נשמרות כהלכה.
אידיאלי לשמור את הסורקים באזור שיהיה נקי מהפרעות לסריקת הזמן המיועדת. כמו כן, כדאי לקחת בחשבון את התנאים הסביבתיים באזור הסריקה כדי להבטיח תגובות פנוטיפיות אידיאליות. התמונות הבאות הן דוגמאות לתמונות שנאספו בשיטה המתוארת בסרטון זה.
לוחות A ו-B ו-C ו-D הם התמונות הראשונות והאחרונות מתקופת סריקה אחת. A ו-B מציגים את האזור הסרוק המלא. בעוד ש-C ו-D הם אזור קצוץ של האזור הסרוק המציג לוח יחיד, ניתן להבחין במספר חוסר עקביות.
איור A מראה שונות בנביטה ובמסלול הגדילה. תמונה B מראה שצלחות יכולות לצבור עיבוי בעוד שתמונות C ו-D נחשבות לתוצאות טובות בשל הצמיחה החזקה של שתילים ואיכות התמונה לאורך כל הריצה. ההליך המתואר במאמר זה מתאים לנישה משלו בעולם הדמיית השורשים בכך שהוא תפוקה גבוהה ורזולוציה גבוהה תוך שהוא עדיין זול יחסית.
יתרון נוסף של גישה זו הוא שניתן להתאים אותה בקלות כדי להתאים לצרכי ההדמיה של קבוצת מחקר מסוימת. השיטה מותאמת גם להדמיה של אחרים.
סקירה כללית
פרוטוקול זה מפרט שיטה לדגימה של תמונות ברזולוציה גבוהה של נבטי Arabidopsis בתגובה לכבידה באמצעות סורקים שטוחים. גישה זו היא חסכונית ומאפשרת איסוף של כמות גדולה של תמונות המתאימה לניתוחים המשכיים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- ביולוגיה של צמחים
- ניתוח תמונות
- תגובה טרופית של שורשים
רקע
- Arabidopsis משמש כאורגניזם מודל במחקר צמחים.
- הבנת תגובות השורש לכבידה היא קריטית למחקרי התפתחות צמחים.
- טכניקות דימוי ברזולוציה גבוהה משפרות את איסוף הנתונים לניתוח פנוטיפי.
- סורקים מישוריים (Flatbed scanners) מספקים פתרון משתלם לדימוי בתפוקה גבוהה.
מטרת המחקר
- להדגמה של שיטה מבוססת סורק ללכידת תגובות טרופיות של שורשים.
- להקל על איסוף תמונות לצורך ניתוח עוקב.
- לספק פרוטוקול דימוי הניתן להתאמה אישית עבור קבוצות מחקר.
שיטות מעבדה שנעשה בהן שימוש
- זרעים מונבטים על מצע שקוף בתוך צלחות פטרי.
- הצלחות נסרקות באמצעות סורקים שטוחים בעמידה אנכית.
- ניתן לחבר מספר סורקים למחשב אחד כדי להגביר את היעילות.
- הגדרות רכישת התמונה מותאמות לקבלת תוצאות אופטימליות.
תוצאות עיקריות
- התמונות שצולמו מראות וריאציות במסלולי הנבט והצמיחה.
- צוינו בעיות של עיבוי על הפלטות, אשר השפיעו על איכות התמונה.
- התקבלו תמונות באיכות גבוהה, המדגימות צמיחה חסונה של השתילים.
- השיטה מאפשרת דימוג בהספק גבוה וניתן להתאמה אישית.
מסקנות
- הפרוטוקול מספק אמצעי יעיל לדמיון של תגובות שורשים.
- הוא ניתן להתאמה לצרכי דמיון שונים במסגרות מחקר.
- הגישה מאזנת בין עלות ליעילות באיסוף הנתונים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
דימות פנוטיפי ברזולוציה גבוהה של תגובה גרביטרופית של שורשים מאפשר הפחתת סיכונים מכניסטית בשלבי אימות היעד המוקדמים לגילוי תרופות מבוססות צמחים. גישת דימות זו, בעלת עלות נמוכה ותפוקה גבוהה, תומכת בביטחון חיזוי במחקרי תפקוד גנים באמצעות יצירת נתונים כמותיים בשיטת time-lapse המתאימים למסלולי ניתוח תמונות במצב downstream. השיטה נותנת מענה לאתגרי סקביליות בביולוגיה של גילוי תוך שמירה על שלמות הנתונים לרצף תרגומי.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות באמצעות מדידה כמותית של מסלולי גדילת השורשים כקריאה פנוטיפית של תפקוד גנים.
- ערך תפעולי: מספק הפחתת סיכונים ביולוגיים באמצעות לכידה בסביבה בעלת תפוקה גבוהה של 216 תגובות בודדות ליום ברזולוציה של 4,800 dpi.
- ערך ניבוי: תומך במיון תיקי פיתוח על ידי הפקת נתוני תמונה איכותיים בשפע עבור יישומי ניתוח תמונה המבהירים וריאציות במסלולי גדילה.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: הכנה של מערכות ביולוגיות מתוקפות (נבטי Arabidopsis על מצע שקוף) עבור תהליכי סריקה סטנדרטיים וניתנים לשחזור של תרכובות או גנים.
- ערך תפעולי: פתרון למוכנות הבדיקה באמצעות רכישת תמונות אוטומטית במרווחי זמן של דקות בודדות, תוך שימוש בסורקים שטוחים זולים.
- ערך סקלאביליות: מאפשר שימוש חוזר בפלטפורמה והתאמה בין קבוצות מחקר בזכות עיצוב פרוטוקול הניתן להתאמה אישית וחיבור של מספר סורקים למחשב אחד.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך תרגומי: שומר על רצף של מערכת רלוונטית למחלה, משלב הגילוי ועד לכמותיות פנוטיפית של תגובת הטרופיזם של השורש, מנגנון שמור באורגניזמי מודל.
- הפחתת סיכונים מכניסטיים: מפחית עמימות באישור המטרה על ידי בידוד המשתנה הבלתי תלוי (העתקת וקטור הכבידה) ומדידת המשתנה התלוי (צמיחה מתקנת) ברזולוציה זמנית גבוהה.
- ביטחון חיזוי: תומך בהחלטות קידום מותאמות סיכון על ידי אספקת פלטים כמותיים המאפשרים ניתוח סטטיסטי של וריאציות במסלול הנביטה והצמיחה.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
שיטה זו משתלבת ברצף הגילוי, החל מבדיקת היפותזות ועד לזיהוי מובילים (leads), על ידי אספקת נתונים פנוטיפיים כמותיים וסטנדרטיים המנחים החלטות של go/no-go בשלב מוקדם של תיקוף מטרות.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת השערות ובבירור מסלולים ביולוגיים על ידי מתן אפשרות לתצפית על צמיחה מתקנת בשורשי נבטים שהוסטו מיישור וקטור הגרוויטציה.
- סריקה: מספקת סטנדרטיזציה של הבדיקה ושחזור באמצעות הכנה מבוקרת של פלטות (מניעת עיבוי באמצעות Triton X-100 וסרט micropore) ופרוטוקולים עקביים לשמירת תמונות.
- אנליטיקה: מייצרת מערכי נתונים של תמונות בשיטת time-lapse ברזולוציה של 4,800 dpi, המתאימים למדידות כמותיות של מסלולי צמיחה ועקביות נביטה.
- מחקר תרגומי: מקשרה לרצף פרה-קליני על ידי אספקת מדדי פנוטיפ רלוונטיים למחלה במערכת מודל הניתנת להפרעה גנטית ופארמקולוגית.
- שימוש חוזר ארגוני: משמשת כיכולת דימוג רב-פעמית ולא כטכניקה לשימוש חד-פעמי, בשל עלות נמוכה, תפוקה גבוהה וקלות התאמה בין קבוצות מחקר.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: ביטחון ניבוי בתיקוף מטרות באמצעות הפחתת עמימות מכניסטית באפיון פנוטיפי של תגובה גרביטרופית.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה, הדירות ויכולת הרחבה שהושגו באמצעות פרוטוקולי סריקה אוטומטיים ושמי nazw תיקיות מונע על ידי מטא-נתונים לארגון נתונים.
- ערך אסטרטגי: קבלת החלטות משופרת לגבי המשך או הפסקת תהליך (go/no-go), יעילות הון והפחתת סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים באמצעות הפחתת סיכונים פנוטיפיים מוקדמת תוך שימוש בדימות בנפח גבוה וברזולוציה גבוהה.
- השפעה על הפורטפוליו: תיעדוף והחלטות קידום מותאמות לסיכון, המאפשרות נתוני תמונה איכותיים בשפע התומכים ביישומי ניתוח תמונה.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות מדעית בביולוגיה של צמחים ובפרוטוקולים לרכישת תמונות עבור דימוי שורשי Arabidopsis.
- הציוד הנדרש כולל סורקים שטוחים בעמידה המסוגלים לרזולוציה של 4,800 dpi וקישוריות למחשב יחיד להפעלה של מספר סורקים במקביל.
- סטנדרטיזציה בין צוותים מחייבת הכנה עקבית של פלטות (בקרת עיבוי באמצעות Triton X-100 וסרט micropore) ושמי papers של תיקיות המבוססות על מטא-נתונים לשמירה רפרודוקבילית של הנתונים.
- שיקולי התאמה בין מערכות מודל כוללים התאמה של אוריינטציית הסורק והכנת הפלטות עבור גדלי שתילים ותנאי גידול שונים.
- מגבלות מעשיות כוללות ניהול עיבוי על הפלטות והבטחת אוריינטציה יציבה של השתילים במהלך סיבוב של 90 מעלות להשראת תגובה גרביטרופית.
