Name: תוספת תזונתית של חומצות שומן רב בלתי רוויות ב Elegans Caenorhabditis (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-29T16:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: למדו שיטה לתוספת חומצות שומן רב בלתי רוויות בתזונה של Caenorhabditis elegans. חקירה זו מאפשרת לבחון את השפעתן על פיזיולוגיית הנמטודה, פוריות ופיתוח באמצעות מניפולציה תזונתית מבוקרת.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לכריס ובסטר לביצוע הניסויים הראשוניים שמוצגים באיור 3 תוצאות הנציג וג&#39;ייסון ווטס וכריס וובסטר על הערות מועילות על כתב היד. מימון למחקר זה מסופק על ידי מענק מהמכון הלאומי לבריאות (ארה&quot;ב) (R01DK074114) לJLW. זני נמטודות חלקם משמשים בעבודה זו סופקו על ידי המרכז לגנטיקת Caenorhabditis, אשר ממומן על ידי משרד NIH של תוכניות תשתיות מחקר (OD010440 P40).

חומצות שומן רב בלתי רוויות הן רגישות לחום, אור וחמצן. לכן, יש להקפיד בעת הכנת צלחות תוספי חומצת שומן כך שחומצות שומן אינן חשופות לחום והאור עודפים. תקשורת NGM מכילה 0.1% Tergitol (NP-40) היא autoclaved ומקורר באופן חלקי, לאחר שמלחי נתרן חומצת שומן נוספים עם ערבוב מתמיד. הצלחות להתייבש בחושך. ספיגה של חומצות שומן על ידי ג elegans תרבית על צלחות אלה אז יכולים להיות במעקב על ידי גז כרומטוגרפיה. 1. הכנה של חומצות שומן בתוספת תקשורת <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדוד את רכיבי תקשורת לבקבוק בגודל מתאים. לכל 1 ליטר, להוסיף 17 גרם Bacto-אגר, 2.5 tryptone גרם, 3 גרם NaCl, 1 מיליליטר כולסטרול 5 מ&quot;ג / מיליליטר מומס באתנול, ו10 מיליליטר 10% Tergitol מומסים במים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 80% מנפח רצוי הסופי של המים Millipore וחיטוי התקשורת יחד עם בקבוקי זכוכית ריקה (שווה למספר שונהריכוז חומצות שומן להיבדק), כמו גם מתאים סיים צילינדרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדיה מגניב באמבט מים מוגדר 55 ° C. בעוד התקשורת היא הקירור להכין פתרון המניות החוזרת בסך של מלח נתרן של חומצות שומן על ידי שבירה הפתוחה בקבוקון הזכוכית, תוך שימוש באמצעי בטיחות ולהבטיח חלקיקי זכוכית לא מתערבבים עם חומצות השומן. לשקול את חומצת שומן מספיק כדי להפוך את המניה עובדת 100 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תביא את פתרון חומצת שומן לריכוז סופי של במים מטוהרים 100 מ&quot;מ. מלא המסת מלח נתרן חומצת שומן בדרך כלל לוקחת בערך 20-30 דקות. טהר את המניות החוזרות של חומצת שומן עם ארגון או חנקן, בגלל מגע עם גז אינרטי מונע חמצון. מכסה את הבקבוקון ולאחסן את המניה עובדת בחושך עד התקשורת התקררה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> (אופציונאלי) אם תקשורת RNAi היא רצויה, למדוד אמפיצילין ופתרונות איזופרופיל β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) כאן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר אגר מתקרר ל55 ° C להוסיף לL 1: 1מיליליטר של 1 M MgSO 4, 1 מיליליטר של 1 M CaCl 2, ו25 מיליליטר של חיץ פוספט (ז KH 108.3 2 PO 4 ו35.6 g K 2 HPO 4 לL 1 autoclaved). הוסף את אמפיצילין מעוקר המסנן ופתרונות IPTG אם עושה צלחות RNAi. לכל סוגי צלחות, להוסיף מים סטריליים כדי להביא את הנפח הסופי תקשורת ל1 ל &#39; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ליד להבה, להעביר את התקשורת לautoclaved והגודל מתאים גליל סיים ולאחר מכן להוסיף את המים סטריליים חמים לעצמה רצויה. להעביר את התקשורת בחזרה לבקבוק ראשוני ומערבבים על ידי ערבוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ליד להבה, להעביר את התקשורת למספר הבקבוקים שווים למספר של ריכוזים להיבדק על ידי מדידה עם autoclaved וגודל מתאים גליל סיים. לשמור על תקשורת aliquoted כנוזלי באמצעות אמבט מים עד שהמנייה פועלת חומצת השומן נמסה באופן מלא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח בקבוק אחד בצלחת ומערבבים ומערבבים עד שהתקשורת היא חמה למגע, אך לא חמה. הקפד להשאיר את עצמך מספיקזמן לבחוש בפתרון מניות חומצת שומן ויוצקים צלחות לפני התקשורת מתחילה לחזק. אם צלחת ומערבבים יש בקרת טמפרטורה, להגדיר אותו 55 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את המניות פועלות חומצת שומן 100 מ&quot;מ לתוך התקשורת לריכוז הסופי הרצוי. תקשורת ומערבבים עד שהמשקע הלבן היא בפתרון (כ 1 דק &#39;). תקשורת עדיין עשויה להיות מעט מעונן לאחר מכן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> (אופציונאלי) אם תקשורת RNAi היא רצויה אמפיצילין תוספת ל0.1 מ&quot;ג / מיליליטר ו IPTG ל2 מ&quot;מ ריכוז סופי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים תקשורת באמצעות סיוע פיפטה אוטומטית וטפטף מיליליטר סטרילי 25, והוסיף 8 מיליליטר של תקשורת ל60 צלחת מ&quot;מ או 25 מיליליטר של תקשורת לכל 100 צלחת מ&quot;מ. חזור בנוסף חומצת שומן וצלחת לשפוך צעדים לבקבוקים שנותרו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר אגר יש הקרושה, לכסות את הצלחות בתוספת חומצת שומן עם תיבה או לאחסן בטמפרטורת חדר במגירה פרקה היטב כדי להגן מפני התחמצנות אור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרע E. coli OP50 לצלחות יומיים לאחר הצלחות התייבשו.לצלחות 60 מ&quot;מ, פיפטה 300 μl של תרבות לילה OP50 (גדלה על 37 מעלות צלזיוס). אם צלחות RNAi נוצקו, זרע עם 300 μl של חיידקי RNAi לאחר הצלחות התייבשו במשך ארבעה ימים. זמן ייבוש פלייט ייתכן שיצטרך להיות מותאם, בשל הבדלים בלחות בסביבות מעבדה שונות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הצלחות בסביבה חשוכה בטמפרטורת חדר ואילו דשא החיידקים מתייבש. </li></ol> 2. גרימת הרס תאים נבט על ידי תוספת של DGLA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> C. elegans גדל על צלחות המכילות 0.3 מ&quot;מ DGLA (20:03 n-6) הפך עקר בשל ההרס של תאי נבט בשני נמטודות הבמה והמבוגר הזחל. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את אוכלוסייה מסונכרנת של זחלי L1 ידי טיפול הרמפרודיטים הרה להולדת עם פתרון היפוכלוריט אלקליין (לפתרון 10 מיליליטר: 0.5 מיליליטר של 5M NaOH, 2.5 מיליליטר של אקונומיקה, ו7 מיליליטר H 2 O). נער בעדינות את הרמפרודיטים הרה להולדת בפתרון זה עד שהתולעת הבוגרתים לפזר. ביצים יישמרו, וניתן pelleted על ידי צנטריפוגה במהירות הנמוכה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף הכנת ביצה 3 פעמים בחיץ M9 (ז KH 3 2 PO 4, 6 גרם Na 2 HPO 4, 5 גרם NaCl, 1 מיליליטר 1 M MgSO 4, H 2 O ל 1 ל הוסף 4 MgSO לאחר מעוקר). כדי לספק מספיק חמצן, resuspend את הביצים בצינור פלסטיק 15 מיליליטר לנפח סופי של 5 מיליליטר של חיץ M9 ורוק על שייקר לילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זחלי L1 יש להוסיף לצלחות בתוספת שני ימים לאחר זריעה עם OP50, או יום אחד לאחר ציפוי חיידקי RNAi. דגירה תולעים ב20 מעלות צלזיוס למשך שלושה ימים או עד שהם מגיעים לשלב הבוגר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תולעים בוגרות יכולות להיות הבקיע על סטריליות באמצעות מיקרוסקופ לנתח עם הגדלה גבוהה מספיק כדי לדמיין את העוברים המתפתחים ברחם. אובדן תאי נבט מוצלח יופיע כחלל רחם ברור של ביצים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יכולים גם להיות הבקיע תולעים על ידי תיקון וצביעה עם הגרעיןdiamindinophenylindole CID צבע (DAPI), המאפשר ההדמיה של גרעינים בתאי נבט ועוברים מתפתחים. כתם DAPI מהיר מושגת על ידי בחירת תולעים לירידה של חיץ M9 על watchglass 9. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מבול שעון זכוכית עם 1 מיליליטר של 0.2 ng / m. DAPI ב95% אתנול פתרון, תנו לשבת במשך כ 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיק תולעים לירידה של Vectashield בשקופית, ולאחר מכן לכסות עם coverslip. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> coverslip החותם ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס בלילה החשוך עבור מכתים אופטימלי, עם זאת, ניתן גם לראות שקופיות באופן מיידי. ציון לקיומו או העדרו של גרעין תא חיידק באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי מצויד במנורת UV ומסנן. </li></ol></li></ol> 3. המאשר את חומצת שומן ספיגה על ידי גז כרומטוגרפיה הרכב חומצות שומן כולל של ג elegans יכול להיקבע על ידי ייצור אסטרים מתילים של חומצות שומן (fames) אשר לאחר מכן הם נפרדו ולכמת באמצעות Chr גזomatography 4. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף 500-1,000 תולעים בוגרות על ידי שטיפתם מעל הצלחות עם מים והעברה לצינור silanized 13 מ&quot;מ x 100 מ&quot;מ בורג זכוכית עליון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בואו תולעים ליישב על ידי כוח הכבידה, ולאחר מכן להסיר כמה שיותר מים ככל האפשר עם זכוכית פיפטה פסטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף תולעי פעם אחת עם מים, ולאחר מכן שוב להסיר כמה שיותר מים ככל האפשר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Fames נוצרים על ידי הוספת 1 ​​מיליליטר של .2.5% H 2 SO 4 במתנול, ולאחר מכן חימום ב70 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 באמבט מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הצינורות מן אמבט המים ולקרר דקות 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלץ fames ידי הוספת 1.5 מיליליטר מים ו0.25 מיליליטר של הקסאן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צינורות וRecap לנער במרץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה צינורות בצנטריפוגה קלינית שולחן 1 דקות במהירות המרבית כדי להפריד הקסאן מממס מימיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר הקסאן (שכבה עליונה) כדי להוסיף בקבוקון GC בתוך בקבוקון GC, נזהר שלא להעביר כל השלב מימי. לGCnalysis, 1-2 μl של fames בהקסאן מוזרק על עמודת גז כרומטוגרפיה קוטב נימים מתאימה לניתוח fames. מזרק GC Agilent 7890 מוגדר ב250 מעלות צלזיוס, עם קצב זרימה של 1.4 מיליליטר / דקה, ותנור GC מתוכנת לטמפרטורה ההתחלתית של 130 ° C, המוחזקת על דקות 1. בהמשך לכך, הטמפרטורה היא ramped 10 ° C / min עד 190 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן שוב בramped 5 ° C / min עד 210 מעלות צלזיוס והוחזקה במשך 1 דקות נוספות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להבטיח ספיגה של DGLA אירעה, לנתח fames ידי זיהוי להבת יינון (FID) או ספקטרומטריית מסת זיהוי (MS), תוך שימוש בסטנדרטים אותנטיים לזיהוי ג elegans חומצות שומן. </li></ol>

<ol><li>Haeggstrom, J. Z., Funk, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipoxygenase+and+leukotriene+pathways%3A+biochemistry%2C+biology%2C+and+roles+in+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Rev%22%5BJournal%5D)">Lipoxygenase and leukotriene pathways: biochemistry, biology, and roles in disease.</a> Chem. Rev. 111, 5866-5898 (2011).</li>
<li>de Lorgeril, M., Salen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+the+health+effects+of+dietary+saturated+and+omega-6+and+omega-3+polyunsaturated+fatty+acids%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Med%22%5BJournal%5D)">New insights into the health effects of dietary saturated and omega-6 and omega-3 polyunsaturated fatty acids.</a> BMC Med. 10, 50(2012).</li>
<li>Spychalla, J. P., Kinney, A. J., Browse, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+an+animal+omega-3+fatty+acid+desaturase+by+heterologous+expression+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Identification of an animal omega-3 fatty acid desaturase by heterologous expression in Arabidopsis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 1142-1147 (1997).</li>
<li>Watts, J. L., Browse, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+dissection+of+polyunsaturated+fatty+acid+synthesis+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Genetic dissection of polyunsaturated fatty acid synthesis in Caenorhabditis elegans.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 5854-5859 (2002).</li>
<li>Watts, J. L., Phillips, E., Griffing, K. R., Browse, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deficiencies+in+C20+Polyunsaturated+Fatty+Acids+Cause+Behavioral+and+Developmental+Defects+in+Caenorhabditis+elegans+fat-3+Mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Deficiencies in C20 Polyunsaturated Fatty Acids Cause Behavioral and Developmental Defects in Caenorhabditis elegans fat-3 Mutants.</a> Genetics. 163, 581-589 (2003).</li>
<li>Kahn-Kirby, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+Polyunsaturated+Fatty+Acids+Drive+TRPV-Dependent+Sensory+Signaling+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Specific Polyunsaturated Fatty Acids Drive TRPV-Dependent Sensory Signaling In Vivo.</a> Cell. 119, 889-900 (2004).</li>
<li>Brock, T. J., Browse, J., Watts, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+regulation+of+unsaturated+fatty+acid+composition+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Genetic regulation of unsaturated fatty acid composition in C. elegans.</a> PLoS Genet. 2, e108(2006).</li>
<li>Webster, C. M., Deline, M. L., Watts, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+response+pathways+protect+germ+cells+from+omega-6+polyunsaturated+fatty+acid-mediated+toxicity+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Stress response pathways protect germ cells from omega-6 polyunsaturated fatty acid-mediated toxicity in Caenorhabditis elegans.</a> Dev. Biol. 373, 14-25 (2013).</li>
<li>Kadyk, L. C., Lambie, E. J., Kimble, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((glp-3+is+required+for+mitosis+and+meiosis+in+the+Caenorhabditis+elegans+germ+line%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">glp-3 is required for mitosis and meiosis in the Caenorhabditis elegans germ line.</a> Genetics. 145, 111-121 (1997).</li>
<li>Watts, J. L., Browse, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dietary+manipulation+implicates+lipid+signaling+in+the+regulation+of+germ+cell+maintenance+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Dietary manipulation implicates lipid signaling in the regulation of germ cell maintenance in C. elegans.</a> Dev. Biol. 292, 381-392 (2006).</li>
<li>Pryor, W. A., Stanley, J. P., Blair, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoxidation+of+polyunsaturated+fatty+acids%3A+II.+A+suggested+mechanism+for+the+formation+of+TBA-reactive+materials+from+prostaglandin-like+endoperoxides%5BTitle%5D)+AND+%22Lipids%22%5BJournal%5D)">Autoxidation of polyunsaturated fatty acids: II. A suggested mechanism for the formation of TBA-reactive materials from prostaglandin-like endoperoxides.</a> Lipids. 11, 370-379 (1976).</li>
<li>Kniazeva, M., Shen, H., Euler, T., Wang, C., Han, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+maternal+phospholipid+composition+and+IP%283%29-dependent+embryonic+membrane+dynamics+by+a+specific+fatty+acid+metabolic+event+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Regulation of maternal phospholipid composition and IP(3)-dependent embryonic membrane dynamics by a specific fatty acid metabolic event in C. elegans.</a> Genes Dev. 26, 554-566 (2012).</li>
<li>Edmonds, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin%2FFOXO+signaling+regulates+ovarian+prostaglandins+critical+for+reproduction%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Insulin/FOXO signaling regulates ovarian prostaglandins critical for reproduction.</a> Dev. Cell. 19, 858-871 (2010).</li>
<li>O'Rourke, E. J., Kuballa, P., Xavier, R., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((omega-6+Polyunsaturated+fatty+acids+extend+life+span+through+the+activation+of+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">omega-6 Polyunsaturated fatty acids extend life span through the activation of autophagy.</a> Genes Dev. 27, 429-440 (2013).</li>
<li>Taubert, S., Van Gilst, M. R., Hansen, M., Yamamoto, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Mediator+subunit%2C+MDT-15%2C+integrates+regulation+of+fatty+acid+metabolism+by+NHR-49-dependent+and+-independent+pathways+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A Mediator subunit, MDT-15, integrates regulation of fatty acid metabolism by NHR-49-dependent and -independent pathways in C. elegans.</a> Genes Dev. 20, 1137-1149 (2006).</li>
<li>Lesa, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+chain+polyunsaturated+fatty+acids+are+required+for+efficient+neurotransmission+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Long chain polyunsaturated fatty acids are required for efficient neurotransmission in C. elegans.</a> J. Cell Sci. 116, 4965-4975 (2003).</li>
<li>Brock, T. J., Browse, J., Watts, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatty+acid+desaturation+and+the+regulation+of+adiposity+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Fatty acid desaturation and the regulation of adiposity in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 176, 865-875 (2007).</li>
<li>Goudeau, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatty+acid+desaturation+links+germ+cell+loss+to+longevity+through+NHR-80%2FHNF4+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Fatty acid desaturation links germ cell loss to longevity through NHR-80/HNF4 in C. elegans.</a> PLoS Biol. 9, e1000599(2011).</li>
<li>Yang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ARC%2FMediator+subunit+required+for+SREBP+control+of+cholesterol+and+lipid+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An ARC/Mediator subunit required for SREBP control of cholesterol and lipid homeostasis.</a> Nature. 442, 700-704 (2006).</li>
</ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

כאן אנו מתארים שיטה של תוספת של ג elegans עם חומצות שומן בלתי רוויות בתזונה. כפי שהוזכר לעיל, יש להקפיד בהכנת צלחות PUFA תוספת בגלל אופי התגובה של הקשרים כפולים בPUFAs גורם לחומצות שומן אלו להיות רגישות לחמצון באמצעות חום ו11 אור. כדי למנוע חמצון, חשוב להוסיף PUFA למדיום אגר הנוזלי לאחר שהתקשורת מקורר 55 מעלות צלזיוס וצלחות חנויות בסביבה חשוכה. אחרים הציגו חומצות שומן חופשיות לג elegans</e...

חומצות שומן הם מרכיבים חיוניים מבניים של ממברנות, כמו גם מולקולות אחסון אנרגיה יעילה. בנוסף, יכולות להיות ביקע חומצות שומן מקרומים תאיים על ידי lipases ולהיות שונה אנזימים כדי לייצר effectors איתות 1. חומצות שומן רב בלתי רוויות באופן טבעי (PUFAs) מכילות שניים או יותר קשרים כפולים cis. אומגה 3, חומצות השומן וחומצות שומן אומגה 6 נבדלות זה מזה המבוססים על עמדותיהם של קשרים כפולים ביחס לסוף מתיל של חומצת השומן. תזונה בריאה דורשת שתי אומגה 3, חומצות שומן אומגה 6 ו. עם זאת, תזונה מערבית עשירה במיוחד באומגה 6 וחומצות שומן ודלות באומגה 3, חומצות שומן. גבוהה של אומגה 6 לאומגה 3 יחס חומצת שומן קשורה לסיכון מוגבר למחלות לב וכלי דם ודלקת, עם זאת, הפונקציות מועילות ומזיקות המדויקים של חומצות שומן מסוימות אינן מובנות 2 כן. Elega Caenorhabditis התולעת העגולהNS הוא שימושי בחקר התפקוד של חומצות שומן כי זה מסנתז את כל האנזימים הדרושים לייצור מגוון של חומצות אומגה -6 ואומגה -3, כולל desaturase אומגה 3, פעילות שאינה קיים ברוב בעלי החיים 3,4. מוטנטים חסרי אנזימי desaturase חומצת שומן מצליחים לייצר PUFAs הספציפית, מה שמוביל למגוון של ליקויים התפתחותיים ונוירולוגי 4-6. כדי לחקור את ההשפעות הפיזיולוגיות של חומצות שומן בתזונה, פיתחנו assay ביוכימיים בקנה אחד עם ניתוח גנטי הן באמצעות מוטציה וטכניקות לדפוק למטה RNAi בג elegans. תוספת של PUFAs הספציפית מושגת על ידי הוספת תמיסת מלח נתרן חומצת שומן למדיום אגר לפני המזיגה. התוצאה היא ספיגת PUFA על ידי א &#39; מקור מזון coli, שבו הוא מצטבר בקרומים חיידקיים. ג elegans לבלוע חיידקי PUFA המכיל, ותוספי תזונה די בכך כדי להציל את defects של מוטציות PUFA לקויות. תוספת של רוב חומצות שומן אין השפעות מזיקות על בעלי חיים מסוג בר, לעומת זאת, חומצות ספציפיות אומגה 6 וחומצות שומן, במיוחד חומצת dihomo גמא לינולנית (DGLA, 20:03 n-6) גורם להרס קבוע של ג תאי נבט elegans 7,8. גז כרומטוגרפיה משמשת כדי לפקח על הספיגה של חומצות שומן בתוספת במקור חיידקי מזון (או OP50 או HT115), כמו גם בנמטודות. התוספת של Tergitol חומר הניקוי (NP-40) בתקשורת מאפשרת חלוקה שווה של חומצות שומן דרך כל הצלחת והספיגה יעילה יותר של חומצות שומן על ידי א &#39; coli ונמטודות. מצאנו כי חומצות שומן בלתי רוויות נלקחות בקלות על ידי חיידקים וג elegans, אבל הספיגה של חומצות שומן רוויות היא הרבה פחות יעיל. מאמר זה יתאר צעד אחר צעד כיצד להשלים את התקשורת אגר עם חומצות שומן, כמו גם כיצד לפקח על ספיגת חומצת שומן בהנמטודות דואר באמצעות גז כרומטוגרפיה.

<table><tbody><tr><td>Bacto-Agar</td><td>Difco</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>טריפטון</td><td>דיפקו</td><td>211705</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>J.T. בייקר</td><td>3624-05</td><td></td></tr><tr><td>טרגיטול</td><td>סיגמא</td><td>NP40S-500 מ"ל</td><td></td></tr><tr><td>כולסטרול</td><td>סיגמא</td><td>C8667-25G</td> <td>(5 מ"ג/מ"ל באתנול)</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>J.T. Baker</td><td>2504-01</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>J.T. Baker</td><td>1311-01</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>J.T. Baker</td><td>3254-05</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>J.T. Baker</td><td>3246-05</td><td></td></tr><tr><td>נתרן דיהומוגמה לינולנאט</td><td>NuCHEK</td><td>S-1143</td><td></td></tr><tr><td>מים</td> <td>חמים סטריליים Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מים סטריליים לאיסוף תולעים</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מים ללא נוקלאז לתמיסת מלאי DGLA</td><td>אמביון</td><td>AM9932</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1760-25</td><td>100 מ"ג/מ"ל במים (עבור צלחות RNAi)</td></tr> <tr><td>איזופרופיל-בטא-D-תיוגלקטופירנוזיד (IPTG)</td><td>Gold Biotechnology</td><td>12481C100</td><td>1 M במים (עבור לוחות RNAi)</td></tr><tr><td>HSO4</td><td>J.T. Baker</td><td>9681-03</td><td></td></tr><tr><td>מתנול</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>A452-4</td><td></td></tr><tr><td>הקסאן</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>H302-4</td><td></td></tr><tr><td>דיאמינדינופנילינדול (DAPI)</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>VectaShield</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>זכוכית</td><td>בקבוק קורנינג</td><td>4980-2L</td><td></td></tr><tr><td>בקבוקי זכוכית הניתנים לחיטוי עם מוטות ערבוב</td><td>Fisherbrand</td><td>FB-800</td><td></td></tr><tr><td>צילינדר בוגר זכוכית ניתנת לחיטוי</td><td>Fisherbrand</td><td>08-557</td><td></td></tr><tr><td>צלחת ערבוב</td><td>VWR</td><td>97042-642</td><td></td></tr><tr><td>אמבט מים ב-55+ & deg; סי</td><td>דיוק סיינטיפיק בע"מ</td><td>66551</td><td></td></tr><tr><td>פקק בורג בקבוקון זכוכית חום</td><td>שמש SRI</td><td>200 494</td><td></td></tr><tr><td>מיכל</td><td></td><td></td><td></td>גז ארגון</tr> אוטומטי <tr><td>סיוע פיפטה</td> פיפטה-אייד <td></td><td>P-90297</td><td></td></tr><tr><td>פיפטות סרולוגיות סטריליות (25 מ"ל)</td> <td>קורנינג</td><td>4489</td><td></td></tr><tr><td>מבער בונסן</td><td>VWR</td><td>89038-534</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ דיסקציה</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TLB3000 צינור זכוכית סילאני</td><td>תרמו מדעי</td><td>STT-13100-S</td><td>עבור FAMEs נגזרת</td></tr><tr><td>PTFE מכסי בורג</td><td>Kimble-Chase</td><td>1493015D</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה קלינית לשולחן</td><td>IEC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GC בקבוקון מלחץ</td><td>SUN SRi</td><td>200 000</td><td></td></tr><tr><td>GC בקבוקון הכנס</td><td>SUN SRi</td><td>200 232</td><td></td></tr><tr><td>GC כובע בקבוקון</td><td>SUN SRi</td><td>200 100</td><td></td></tr><tr><td>כרומטוגרף גז</td><td>Agilent</td><td>7890A</td><td></td></tr><tr><td>גלאי ספקטרומטריית מסה</td><td>Agilent</td><td>5975C</td><td></td></tr><tr><td>עמודה לכרומטוגרפיית גז</td><td>Suppelco</td><td>SP 2380</td><td>30 m x 0.25 מ"מ עמוד נימי סיליקה התמזגו</td></tr></tbody></table>

תוספת תזונתית של חומצות שומן רב בלתי רוויות ב<em&gt; elegans caenorhabditis</em

Dietary Supplementation of Polyunsaturated Fatty Acids in Caenorhabditis elegans

חומצות שומן חיוניות לתפקודים תאיים רבים. הם משמשים מולקולות אחסון אנרגיה יעילה כמו, מרכיבים את הליבה ההידרופובי של ממברנות, ולהשתתף במסלולי איתות שונים. Caenorhabditis elegans מסנתז את כל האנזימים הדרושים לייצור מגוון של חומצות אומגה -6 ואומגה -3. זה, בשילוב עם האנטומיה ומגוון של כלים גנטיים זמינים הפשוטים, להפוך אותו למודל אטרקטיבי ללמוד לתפקד של חומצות שומן. על מנת לחקור את המסלולים הגנטיים המתווכים את ההשפעות הפיזיולוגיות של חומצות שומן בתזונה, פיתחנו שיטה כדי להשלים את ג דיאטת elegans עם חומצות שומן בלתי רוויות. תוספת היא אמצעי יעיל כדי לשנות את הרכב חומצות שומן של תולעים ויכולה לשמש גם כדי להציל את הפגמים במוטנטים חומצת שומן לקוי. השיטה שלנו משתמשת באגר נמטודות צמיחה הבינוני (NGM) בתוספת מלחי acidsodium השומן. חומצות השומן בתוספת הצלחות הפכו incorporaטד לממברנות של מקור החיידקים שבמזון, אשר לאחר מכן הוא נלקח על ידי ג elegans שניזונים מהחיידקים בתוספת. גם אנו מתארים פרוטוקול גז כרומטוגרפיה לעקוב אחר השינויים בהרכב חומצות שומן המתרחשים בתולעים בתוספת. זוהי דרך יעילה כדי להשלים את התזונה של אוכלוסיות קטנות וגדולות של ג elegans, המאפשר מגוון רחב של יישומים לשיטה זו.

תוספת של ג דיאטת elegans היא מוגבלת על ידי יכולתו של מקור חיידקים שבמזון לספיג ולשלב חומצת שומן לתוך קרום החיידק. כדי לקבוע את היכולת של א &#39; coli OP50 להטמיע חומצות שומן שונות לקרומיו, OP50 היה מצופה על תקשורת ללא תוספת, 0.1 מ&quot;מ ו0.3 ריכוזי מ&quot;מ של חומצה סטארית (18:00), oleate נתרן (18:01 n-9), ונתרן DGLA (20 : 3N-6). צלחות היו יבשות בטמפרטורת חדר למשך 2 ימים בחושך, וטופחו על 20 מעלות צלזיוס במשך 3 ימים. מדשאות חיידקים נאספו על ידי בעדינות מ...

Elegan &lt;em&gt; Caenorhabditis &lt;/ em&gt; הוא מודל שימושי כדי לחקור את הפונקציות של חומצות שומן רב בלתי רוויות בפיתוח ופיזיולוגיה. פרוטוקול זה מתאר שיטה יעילה להשלמת ג &lt;em&gt; elegans &lt;/ em&gt; דיאטה עם חומצות שומן רב בלתי רוויות.

תוספת תזונתית של חומצות שומן רב בלתי רוויות ב<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em

Fatty acids are essential for numerous cellular functions. They serve as efficient energy storage molecules, make up the hydrophobic core of membranes, ...

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא להשתמש באמצעים תזונתיים כדי לשנות את הרכב חומצות השומן של אלגנטיות הים על מנת לחקור את תפקוד וויסות חומצות השומן. זה מושג על ידי טיפוח מקור המזון של הנמטודה בנוכחות חומצות שומן בלתי רוויות. לאחר מכן, אלגנטיות הים מוזנים בחיידקים התוספים המאפשרים ספיגת חומצת השומן ושילובם בתולעת.לאחר מכן השומנים משתנים באלגנטיות הים. הרכב חומצות השומן מאושר על ידי ניתוח ספקטרומטריית מסה של כרומטוגרפיית גז. לבסוף, לאחר שניזונו מחומצות שומן בלתי רוויות, התולעים נקבעות לסטריליות.מתקבלות תוצאות המראות את ההשפעות הפיזיולוגיות של שינוי בהרכב חומצות השומן באמצעות התנהגות התפתחותית, ושינויים בביטוי הגנים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחומי התפתחות אלגנטיות הים והפיזיולוגיה מכיוון שאנו יכולים להשתמש הן במניפולציה גנטית והן בתרומות תזונתיות כדי לשנות את הרכב חומצות השומן ולעקוב אחר ההשלכות. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו חייבים להיות זהירים וזהירים מכיוון שקשה להשיג תוצאות עקביות בשל הרגישות של חומצות שומן בלתי רוויות לחמצן ולטמפרטורות גבוהות.להכנת ליטר אחד של מדיום בתוספת חומצות שומן, מדוד את המרכיבים הבאים לבקבוק. הוסף מיליפור-מים עד 800 מיליליטר ובצע חיטוי של המדיום יחד עם בקבוק זכוכית ריק לכל ריכוז חומצות שומן לבדיקה, כמו גם צילינדרים מדורגים מתאימים בזמן שהמדיום

dietary-supplementation-polyunsaturated-fatty-acids-caenorhabditis

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

כאן אנו מציגים פרוטוקול לביצוע הגבלה מוצק צלחת מבוססי...

Solid פלייט מבוססי הגבלת תזונתיים ב Caenorhabditis elegans</em

בסיסי<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; שיטות: סנכרון תצפית

אנו מציגים שיטות ביוכימיות ומיקרוסקופיות חזקות...

הערכה ביוכימית ותפוקה גבוהה מיקרוסקופית של מסת שומן ב<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em

במאמר זה, אנו מתארים הליך אופטימלי להפקת וניתוח של פרוסטגלנדינים ואחרים...

הפקה וניתוח בפרוסטגלנדין<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em

כדי לחקור את הקשר בין הומאוסטזיס חלבון, מתח והזדקנות, עקבנו אחר שינויים בקיפול החלבון על ידי מעקב אחר תפקוד לקוי של חלבון, לוקליזציה של חלבון בתא ויציבות החלבון ברמת האורגניזם, התא והחלבון, תוך שימוש במטזואן Caenorhabditis elegans הניתן לטיפול גנטי כמערכת מודל.

שימוש ב-Caenorhabditis elegans כמערכת מודל לחקר הומאוסטזיס חלבון באורגניזם רב-תאי

כאן, אנו מציגים assay Caenorhabditis elegans- Specific שנועד להעריך שינויים התנהגות הנטייה נחושת ואת היכולת לאתר מקור מזון משותף, כמו האורגניזם מתקדמת ממצב תזונה רעב עד כדי רעב.

א<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; מצב תזונתיים מבוססי Assay Assersion

הנילוס אדום צביעה של קבוע Caenorhabditis elegans הוא שיטה למדידה כמותית של משקעי השומנים נייטרלי, בעוד שמן אדום O צביעת מקלה על הערכה איכותית של השומנים התפלגות בין רקמות.

כימות של השומנים לשפע, הערכה של השומנים הפצה Caenorhabditis elegans ע י הנילוס אדום אדום שמן מכתים O

כאן, אנו מציגים עבור בידודו של RNA DNA, חלבונים מדגם זהה, פרוטוקול, במאמץ להפחית את הווריאציה לשפר הפארמצבטית, להקל על פרשנויות.

משולב נוקלאוטיד שיחולץ חלבון ב Caenorhabditis elegans

כדי להשתמש ב- Caenorhabditis elegans (C. elegans) במחקר omics, יש צורך בשיטה כדי ליצור אוכלוסיות גדולות של תולעים שבהן ניתן למדוד מדגם יחיד על פני פלטפורמות לניתוחים השוואתיים. כאן מוצגת שיטה לתרבות C. elegans אוכלוסיות על לוחות תרבות בקנה מידה גדול (LSCPs) ולתעד את גידול האוכלוסייה.

תרבות ו Assay של בקנה מידה גדול מעורב שלב Caenorhabditis אוכלוסיות אלגנים

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטות לתוספי שומנים בתרביות נוזליות ובתרביות על צלחת עבור Caenorhabditis elegans, יחד עם מחקרי אורך וניתוח שעתוק גנים מכמות גדולה או כמה תולעים ורקמות תולעים.

תוספי שומנים לאריכות ימים וניתוח שעתוק גנים ב - Caenorhabditis elegans

פרוטוקול זה מתאר בדיקה לכימות קצב ההזנה של Caenorhabditis elegans בהתבסס על מדידת פינוי החיידקים בתרבית נוזלית.

כימות צריכת המזון ב- Caenorhabditis elegans על ידי מדידת פינוי חיידקים

למדו שיטה לתוספת חומצות שומן רב בלתי רוויות בתזונה של Caenorhabditis elegans. חקירה זו מאפשרת לבחון את השפעתן על פיזיולוגיית הנמטודה, פוריות ופיתוח באמצעות מניפולציה תזונתית מבוקרת.

תוספת תזונתית של חומצות שומן רב בלתי רוויות ב

גלה סרטונים נוספים