פלטפורמה מבוססת FRET תואמת תפוקה גבוהה לזיהוי ואפיון של מודולטורים של שרשרת אור בוטולינום נוירוטוקסין

המטרה הכוללת של הליך זה היא לסנן מולקולות קטנות לנוירוטוקסין בוטולינום, עיכוב שרשרת קלה. זה מושג על ידי הכנה ראשונה של סדרות דילול מורכבות עם דיוק ודיוק גבוהים. השלב השני הוא העברת דילולים מורכבים לצלחת שחורה של 96 בארות.

לאחר מכן מוסיפים לצלחת אנזים שרשרת קלה מדולל והאנזים מודגר עם התרכובת למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. השלב האחרון הוא הוספת מצע השרשרת הקלה כדי ליזום את התגובה, המנוטרת באמצעות קורא לוחות פלואורסצנטי. בסופו של דבר, יש להשתמש במסכים משניים המשתמשים במצע פפטיד שאינו פלואורסצנטי כדי לאשר פעילות תרכובת ולקבוע קבועים קינטיים קפדניים יותר כגון קבוע הדיסוציאציה המעכב או ki.

היתרון העיקרי של בדיקה זו על פני שיטות קיימות כגון שיטות מבוססות HPLC או מבוססות תאים, הוא שהיא פשוטה לביצוע, אוטומטית בקלות וניתן להשתמש בה כדי להשוות את העוצמה היחסית של מספר תרכובות. אנשים עשויים להיאבק כאשר הם חדשים בשיטה זו בעת הכנת סדרת דילול מורכב וערבוב נכון של הצלחת לאחר הוספת כל הרכיבים. התחל הליך זה על-ידי הכנת המאגרים והריאגנטים כמתואר בפרוטוקול הטקסט.

הגדר את קורא הלוחות לנער את הצלחת במהירות בינונית למשך 10 שניות, ולאחר מכן לנטר את הקרינה באורך גל עירור של 490 ננומטר ואורך גל פליטה של 523 ננומטר כל חמש דקות במצב קינטי למשך שעה ו-30 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר קביעת טווח ריכוז התרכובות צינורות תווית עם שם התרכובת והריכוז המתאימים, Eloqua, 100% תחמוצת דימתיל סולף או DMSO לכל הצינורות כדי להכין אותם לדילול דגנים מורכבים. לאחר מכן, הכינו דילול סדרתי של התרכובות לסדרת הדילול הסטנדרטית אחת עד שלוש.

הוסף שני מיקרוליטר מהתרכובת הלא מדוללת לארבעה מיקרוליטרים של DMSO בצינור הראשון של סדרת הדילול, וערבב היטב עם קצה פיפטה חדש. הסר שני מיקרוליטר מהדילול הראשון והוסף לארבעה מיקרוליטרים של DMSO בתערובת הצינור השנייה. ובכן חזור על הדילולים הנותרים.

הקפידו לערבב היטב את דילולי התרכובות כדי להבטיח שריכוזי התרכובות מדויקים. מכסים את צינורות התרכובת ומניחים אותם בצד בטמפרטורת החדר, מקבלים תחתית שטוחה, צלחת באר שחורה אטומה 96. שימוש בהגדרת הצלחת המומלצת שניתן למצוא בפרוטוקול הטקסט.

הוצא ידנית מיקרוליטר אחד של דילול התרכובת המתאימה ישירות לתחתית כל באר מתאימה עבור בארות אחת עד תשע, חלק מיקרוליטר אחד מהריכוז הגבוה ביותר של התרכובת לבדיקה לבאר.11. לשמש כבקרת הקרינה הפנימית המורכבת. בקרה זו נועדה לקבוע אם התרכובות עצמן פלואורסצנטיות או משפיעות על הידרוליזה של המצע.

להוציא ידנית מיקרוליטר אחד של מעכב חזק ידוע לבאר, 12 כבקרה חיובית ומיקרוליטר אחד של 100% DMSO לבאר. 10 כבקרה שלילית עם חלוקת פיפטר אוטומטית. 79 מיקרוליטר של מאגר בדיקה לצד הבארות, אחד עד 10 ו -12 ו -89 מיקרוליטר לצד הבאר, 11.

הקפד לא לגעת בקצה לתחתית הבאר שבה קיימת תרכובת כדי למנוע זיהום צולב של הבארות. מערבולת, אנזים השרשרת הקלה המדולל, והשתמש בצינור אוטומטי כדי להוסיף 10 מיקרוליטר של האנזים לצד של כל באר, למעט באר 11. הקש בעדינות על הצלחת כדי להבטיח שהנפח הכולל של האנזים הנוסף יגיע לתחתית הבאר מערבבים בעדינות, מכסים ומדגרים את הצלחת למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.

דגירה זו מספקת שלב שיווי משקל מקדים לתרכובות להיקשר לשרשרת הקלה. לפני הוספת המצע, מערבול בעדינות את הנוירוטוקסין של הבוטולינום מצע שרשרת קלה. ואז בעזרת פיפטה אוטומטית, הוסף 10 מיקרוליטר מצע לצד כל אחד.

ובכן, הקפד להוסיף את המצע לצד הבאר הנגדית למקום שבו נוסף האנזים קודם לכן. הקש בעדינות על הצלחת כדי לערבב מיד את הריאגנטים. הנח את הצלחת בקורא צלחות מיקרוטיטר פלואורסצנטי והתחל את התוכנית שהוגדרה קודם לכן.

לאחר סיום התוכנית, חשב את מהירויות האנזים על ידי גרף של יחידת הקרינה היחסית לעומת הזמן וחישוב שיפוע הקו במהלך התקופה הליניארית של התגובה. התכוננו לפעולה אוטומטית לבדיקת תפוקה גבוהה כמתואר בפרוטוקול הטקסט, הדגמת חלק מפרוטוקול הסינון בתפוקה גבוהה תהיה דה יאנג פוסט-דוקטורט במעבדה שלי. הוא יראה כיצד תרכובות מועברות לצלחות לסינון תפוקה גבוהה באמצעות ציוד אוטומציה במעבדה לאחר הפצת נוירוטוקסין בוטולינום מדולל, אנזים שרשרת קל לתוך לוחית הבדיקה.

הקצה אזורים על פלטפורמת המטפל בנוזלים עבור לוחות התרכובת, לוחות הבדיקה והמיכלים עם פתרונות ניקוי. תכנת את המטפל בנוזלים למקם את לוחות התרכובת ואת לוחות הבדיקה במיקומים המיועדים ולהסיר את מכסי הצלחות לפני ההחתמה. כייל את תוכנת תוכנית ההטבעה וודא שסיכות ההטבעה שקועות אך לא מגרדות את החלק התחתון של לוחית הבדיקה.

החתמת 50 ננוליטר של התרכובת ישירות לתוך לוחית הבדיקה המכילה שמונה מיקרוליטרים של נוירוטוקסין בוטולינום. שרשרת קלה. נקו את הסיכות לאחר כל צלחת על ידי טבילתם ב-DMSO ולאחר מכן ייבוש על נייר סופג וחזרה על תהליך זה עם איזופרופנול ומתנול.

לבסוף, יבש את הסיכות מעל המאוורר לאחר שהתרכובות הוטבעו בלוחות הבדיקה עם אנזים. בנפרד, ערמו את לוחות תרכובת המלאי ולוחות הבדיקה מכסים את לוחית הבדיקה העליונה בערימה כדי למנוע אידוי ומניחים בצד. הקפידו לדגור את שרשרת האור בתרכובות למשך חמש דקות לפחות בטמפרטורת החדר.

ניתן להשתמש בזמני דגירה ארוכים יותר בעת החתמת מספר רב של צלחות. לבסוף, הוצא את המצע לתוך לוחות הבדיקה ומדוד את הקרינה כמתואר בפרוטוקול הטקסט. בין אם מבצעים את בדיקת הנוירוטוקסין בוטולינום המבוססת על שרשרת קלה בתפוקה נמוכה או בתפוקה גבוהה, יש להבחין בעלייה בקרינה לאורך זמן כאשר הנוירוטוקסין של הבוטולינום, שרשרת קלה מודגרת עם המצע.

אם נבדקים דילולים סדרתיים של תרכובת, לעתים קרובות מתקבלת סדרה של קווים עם שיפועים משתנים. הנה. הריכוז הסופי של תרכובת מבוססת הידרוקסי רשום ביחידות מיקרו-מולריות. ובכן, 10 בפריסת הלוחית המתוארת כאן משמש כבקרה שלילית שבה מתווסף רכב בלבד.

קצב תגובה זו מוגדר כ-100% פעילות אנזימים וניתן לנרמל את השיעורים בנוכחות תרכובת לקצב זה כדי לקבל את השיעור היחסי או אחוז העיכוב. כאשר הבדיקה מבוצעת עם דילול סדרתי של תרכובת, ניתן להשתמש בגרף של קצב התגובה לעומת ריכוז המעכב כדי לקבוע את ריכוז המעכב החצי מקסימלי או IC 50. יש לבחור את טווח הדילול כך שהחלקה תיראה בצורת סיגמואיד להתאמת עקומה אופטימלית.

ערך IC 50 הוא מדד יחסי של עוצמה המתואר בצורה הטובה ביותר כערך KI לכאורה מכיוון שהוא תלוי בריכוז האנזים הקיים בבדיקה. לאחר מכן ניתן להשתמש בערך זה כדי להשוות ולדרג את העוצמה של מספר תרכובות אם נבדק. במקביל, ערבוב נכון של הצלחת לאחר הוספת כל רכיב הוא חיוני להשגת עלייה ליניארית חלקה בקרינה לאורך זמן, הנחוצה כדי לקבוע במדויק את המהירויות ההתחלתיות.

תרשים זה מציג ניסוי מייצג שבו לא היה ערבוב מספיק, וקצב היווצרות המוצר אינו ליניארי לאורך זמן. ניתוח נתונים מבלבל לאחר שליטה בטכניקה זו, ניתן לבצע תוך פחות משעתיים עבור עד שמונה תרכובות. לאחר ניסוי זה, ניתן לבצע בדיקות אחרות עם מצעי פפטיד שאינם פלואורסצנטיים כדי לאשר שתרכובות מעכבות רעלן עצבי בוטולינום, שרשרת קלה ופעילות סומטית.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לקבוע את העוצמה היחסית של מעכבי שרשרת קלה של רעלן עצבי בוטולינום. הפרוטוקול הושג בשלושה שלבים. ראשית, הכנת סדרת דילול מורכבת.

שנית, תוספת של אנזים שרשרת אור רקומביננטי, ושלישית, תוספת של מצע פלואורסצנטי ומדידה לאחר מכן על קורא צלחות פלואורסצנטיות.