ניתוח פגמים בשרירי השלד בדג זברה זחל על ידי מבחני שבירה כפולה ותגובת בריחה מעוררת מגע

המטרה הכללית של הליך זה היא להעריך את מידת הארגון של הסיבים השריריים (myofibrillar organization) בזריקים שקופים של דגי זברה, ולכמת את מרחק השחייה שלהם בתגובה לגירוי מגע בשתי השיטות. דבר זה מושג תחילה על ידי הזווג של דגי הזברה, ולאחר מכן על ידי איסוף ביצים חיוניות בשלב השני של הבדיקה להערכת מבנה השריר. עובר דג זברה הרדומ ומצופה ממוקם ישירות בין שתי עדשות מקוטבות על במה של מיקרוסקופ סטריאוסקופי, כך שהדג מונח לאורך הציר הלטרלי של גופו ובמנח שטוח ככל האפשר.

לאחר מכן מ可וייזואליזציה של הביריפרנגנס (birefringence) ומבוצע כימות של שלמות השריר. בשלב השני של בדיקת בריחה המעוררת במגע, זחל מצופה בודד מוצב בתוך צלחת פטרי עמוקה ולאחר מכן ממרכזים אותו בשדה הראייה של מיקרוסקופ הסטריאו. גירוי חושי קטן מועבר לזחלים על ידי נגיעה בזנב באמצעות סיכה לחרקים, ותגובת בעל החיים מצולמת עד שהעובר מפסיק לשחות או שוחה אל מחוץ לשדה הראייה.

בסופו של דבר, ניתן לכמת הבדלים בארגון השרירים ובתגובות התנועה. היתרונות העיקריים של טכניקות לא פולשניות אלו הם היכולת לנתח במהירות מספר רב של דגים, והיכולת לנטר in vivo פגמים בשריר השלד באותו דג לאורך מספר ימים. הדגמות חזותיות של התקנת עדשות מקטבות ומיקום הלרוות באוריינטציה הנכונה הן קריטיות להבטחת ההצלחה.

בעזרת בדיקות אלו, הסירו את הביצים שאינן חיוניות מכל מקבצי הביצים שנאספו מדגי מבוגרים שהזדווגו. אלו נראות בדרך כלל לבנות ואטומות לעין בלתי מזוינת, או כצביר של תאים כהים ולא מאורגנים תחת המיקרוסקופ; החזירו את העובריים לאינקובטור להמשך גדילה שלושה עד שבעה ימים לאחר ההפריה. אם העובר הרלוונטי נשאר בתוך הקוריון שלו, השתמשו בפינצטה חדה כדי ליצור בעדינות קרע בקוריון של העובר הרלוונטי, ולאחר מכן הפכו אותו כך שהעובר ייפול החוצה.

הרדימו את העוברים המצופים באמצעות trica כדי לסייע במיקומם הנכון, ולאחר מכן התקינו במיקרוסקופ הדיסקציה עדשה מקוטבת הניתנת לסיבוב כדי להתאים את זווית האור המקוטב. לאחר שהעוברים התיישרו, מקמו עדשה מקוטבת שנייה על בסיס המיקרוסקופ ישירות מתחת לעדשה העליונה, והניחו את העוברים ישירות על העדשה השנייה. כל עובר רלוונטי צריך להיות ממוקם לאחר מכן לאורך הציר הלטרלי של גופו.

סובב את העדשה העליונה כאשר העובר הרלוונטי נמצא בשדה הראייה, עד שציר הקיטוב של שתי העדשות יהיה מכוון בזווית של 90 מעלות זה מזה והרקע יהיה חשוך לחלוטין. הזז את הדגים כדי לוודא שהם שוכבים בצורה שטוחה ככל האפשר. אם דג נמצא במצב כפוף, רק המקטעים בעלי אוריינטציה שטוחה יעבירו את האור המקוטב ויציגו by frt.

כעת, בחנו את פנוטיפ ה-bi frt של דגי הטיפוס הפראי. שרירים שלדתיים מאורגנים היטב מראים bi frt בהיר, כיוון שמקדם השבירה של האור המקביל לסיבי השריר (myo filaments) גבוה יותר מהאור המקוטב הניצב למבנים אלו. דגים עם שרירים שלדתיים לא מאורגנים, המרמזים על מיופתיה נוירודגנרטיבית או פגם התפתחותי, מראים בדרך כלל הפחתה כללית בביריפרנגס (birefringence) בדגים עם שרירים שלדתיים לא מאורגנים.

מאפיין של דיסטרופיה שרירית. נפוץ להראות תבנית דמוית טלאים של דו-שבירה (birefringence), כאשר אזורים כהים מייצגים ניוון שרירים בתוך אזורים בהירים של מבנה שרירי תקין. אסוף תמונות של הדג תחת אור מקוטב לצורך כימות של הדו-שבירה.

שמרו את התמונות כקבצי tiff. פתחו את תמונות הבירפרינגנס (birefringence) בתוכנה לעיבוד תמונות. בשימוש ב-Image J כפי שמוצג כאן, עבור כל תמונה, השתמשו תחילה בכלי בחירת הפוליגון (polygon selections tool) כדי לשרטט קו מסביב לגוף הדג, במטרה להגדיר את שטח שריר הזבברהיש (zebrafish) למדידה.

לאחר מכן, בתפריט הנפתח "analyze", בחרו ב-"set measurements" כדי לבחור את הנתונים הסטטיסטיים הנדרשים עבור התמונה. סמנו את התיבות עבור "area mean gray value" ו-"min and max gray value" כדי להגדיר את בדיקת התנהגות המילוט המעוררת ממגע בין יומיים לשבעה ימים לאחר ההפריה. העבירו את הדגים המצופים הרלוונטיים באופן אינדיבידואלי לכלי Petri עמוקים, תוך עבודה עם עובר אחד בלבד בכל פעם.

מרכזו את הדג בשדה הראייה של מיקרוסקופ סטריאו המצויד במערכת מצלמה דיגיטלית והתחילו בצילום רצפי בקצב פריימים של 30 hertz או יותר. לאחר מכן, בעזרת סיכת חרקים, געו בזנב של העובר כדי להעביר את הגירוי החושי, והפסיקו את הצילום כאשר העובר הפסיק לשחות או שחחה אל מחוץ לשדה הראייה. לבסוף, המירו את התמונות הרצפיות לקובץ וידאו או נתחו את הפריימים הבודדים של תמונות ה-time-lapse.

ניתן להשתמש בבדיקת דו-שבירה (birefringence) מחוץ למקום (offline) כבדיקה לא פולשנית ויעילה להבנת מצב הארגון של סיבי השריר (myofibrillar organization) בעוברים חיים של דגי זברה; דגי זברה מסוג בר (wild type) חמישה ימים לאחר ההפריה מראים שרירי שלד בעלי דו-שבירה גבוהה תחת אור מקוטב בשל המערך המסודר של הפילמנטים השריריים (myofilaments). לעומת זאת, עוברים בגיל תואם שהם הומוזיגוטים למוטציה פתוגנית בגן ה-distroglycan או DAG1 מראים דו-שבירה כתמית המעידה על אזורים של ניוון שרירים. תבנית כתמית זו וההתקדמות המהירה של ניוון השרירים במהלך ההתפתחות המוקדמת עקביות עם מודלים אחרים של דגים עם דיסטרופיה.

כימות הביריפרנגס (birefringence) חמישה ימים לאחר ההפריה במוטנטים של DAG one עם דיסטרופיה, מעלה הפחתה משמעותית בבהירות ל-27.9 plus or minus 5.3% מהביריפרנגס המקסימלי שנצפה באחיהם מסוג הבר (wild type). הפחתה זו חמורה יותר מההפחתה ל-52.4 plus or minus 5.5% שנצפתה בשלושה ימים לאחר ההפריה ב-mtm one morphines עם מיופתיה. מודלים של דגים עם מיופתיה נוטים להראות במקום זאת הפחתה כללית בביריפרנגס בהשוואה לטיפוס הבר, שכן לעיתים קרובות קיימת חוסר ארגון של סיבי השריר (myofibrillary disorganization) בשרירי השלד האקסיאליים העיקריים, אך אין עדות לשינויים דגנרטיביים. ניתן להשתמש בהתנהגויות בריחה ממוקדות מגע כדי להדגים שדגמי דגי הזברה למחלות של שרירי השלד מראים פגמים בתנועתיות וקשיים בשחייה.

סרטון זה מציג בדיקה של התנהגות בריחה המעוררת על ידי מגע בדגי זברה מסוג בר. שימו לב כי חמישה ימים לאחר ההפריה, הדגיגים הנורמליים שוחים הרחק במהירות רבה. בתגובה למגע בסרטון השני, תועדה התנהגות בריחה המעוררת על ידי מגע בדגיגים בני יום אחד.

שימו לב כי עוברים מוטנטיים בחמישה ימים לאחר ההפריה מראים תגובה לקויה למגע ואינם יוצאים משדה הראייה לאחר גירוי. לאחר מכן נותחו הסרטונים פריים אחר פריים כדי לאשר כי מוטנטים של DAG one מראים תנועה לקויה בהשוואה לבקרי wild type בתגובה לגירויים מגעים. המרחקים ששני סוגי העוברים הצליחו לעבור בפרק זמן קבוע חושבו כממוצע ומצביעים על תפקוד מוטורי מופחת במוטנטים של DAG one.

ברגע שטכניקות אלו נלמדו היטב, ניתן לבצען על כמויות גדולות של דגים בפרק זמן קצר, דבר קריטי בעת ביצוע סריקות כימיות או סריקות מוטגנזה בתפוקה גבוהה. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע גישות פולשניות יותר, כגון אימונוהיסטוכימיה או מיקרוסקופיה אלקטרונית, כדי לחקור פגמים בשריר השלד ברמות המולקולרית והמבנית.