Name: ספקטרומטריית מסה MALDI-TOF של תא שלם היא שיטה מדויקת ומהירה לניתוח מצבים שונים של הפעלת מקרופאגים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-26T13:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 25 s
Description: למדו לנתח מצבי הפעלה שונים של מקרופאגים באמצעות ספקטרומטריית מסה MALDI-TOF של תא שלם. השיטה המהירה והחסכונית מספקת טביעות אצבע ספקטרליות לזיהוי מדויק של תגובות תאיות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Richard Ouedraogo נתמך על ידי מענק ממשרד הבריאות של סאנטה (PHRC 2010). אנו מודים ללורן גורוול, כריסטוף פלודרופס וניקולס אמסטרונג על הסיוע הטכני.

בפרוטוקול הנוכחי, טכניקת MALDI-TOF של כל התא משמשת להשגת ספקטרום מסה הנחשב כטביעת אצבע של הדגימה. ניתוח ביואינפורמטי איפשר השוואה וסיווג של טביעות אצבע אלה. בפרוטוקול זה היו שלושה חלקים עיקריים:
<ol>
	<li>הכנת הדגימות הביולוגיות: בקרה על מקרופאגים ומקרופאגים מגורים עם אגוניסטים שונים.</li>
	<li>הניתוח של כל סוג של דגימה עם שכפולים טכניים על ידי MALDI-TOF MS של תא שלם.</li>
	<li>ניתוח ביואינפורמטי של נתונים גולמיים.</li>
</ol>
הכן פתרונות סטריליים לבידוד תאים ולתרבית. הכן ואחסן את כל הריאגנטים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס
1. הכנת מונוציטים אנושיים
<ol>
	<li>הכן מדיום תרבית תאים. יש להוסיף 55 מ"ל של סרום AB+ אנושי או סרום בקר עוברי (FBS) ו-5 מ"ל של תמיסת אנטיביוטיקה (פניצילין ב-10,000 UI/ml וסטרפטומיצין ב-10,000 מיקרוגרם/מ"ל; ריכוז סופי של 100 UI/ml לפניצילין ו-100 מיקרוגרם/מ"ל לסטרפטומיצין) ל-RPMI 1640 בינוני (500 מ"ל).
	<ol>
		<li>לבודד תאים חד-גרעיניים בדם היקפי (PBMCs) מלויקופאקים (תרכיזי לויקוציטים).
		<ol>
			<li>הכינו 50 מ"ל צינורות המכילים 15 מ"ל Ficoll. לדלל את הדם במי מלח (vol/vol, 1/10). הפקידו 30 מ"ל PBMCs מדוללים ב-Ficoll כפי שתואר קודם לכן26.</li>
			<li>צנטריפוגה ב-700 x גרם למשך 20 דקות. שחזר PBMCs בממשק בין Ficoll (צפיפות של 1.077 גרם/מ"ל) לפלזמה מדוללת. מדללים PBMCs במדיום תרבית וצנטריפוגה ב -300 x גרם למשך 5 דקות.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>הכן מונוציטים CD14+ מ-PBMCs באמצעות חרוזים מגנטיים המצופים בנוגדנים נגד CD14. 
		הערה: יש לשמור את המוצרים והתאים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד להתייצבות מונוציטים.
		<ol>
			<li>הכן מאגר רץ המורכב מ-pH 7.2 של מי מלח עם חוצץ פוספט (PBS), 0.5% אלבומין בסרום בקר (BSA) וחומצה אתילנדיאמינטטראצטית (EDTA) של 2 מ"מ.</li>
			<li>נתק בעדינות PBMCs עם כדורים (107 תאים לבדיקה) ל-80 מיקרוליטר של מאגר פועל.</li>
			<li>הוסף 20 מיקרוליטר CD14 MicroBeads ל-PBMCs. מערבבים ודוגרים PBMCs למשך 15 דקות. שטפו PBMCs עם 5 מ"ל של מאגר רץ וצנטריפוגה ב-300 x גרם למשך 5 דקות. פרק בעדינות PBMCs עם כדורים ל-500 מיקרוליטר של מאגר פועל עבור 108 PBMCs. 
			הערה: השתמש ב-500 מיקרוליטר של מאגר רץ עבור ריכוזי PBMC נמוכים מ-108 PBMCs.</li>
			<li>המשך להפרדה מגנטית. 
			הערה: עבור פחות מ-2 x 108 PBMCs, השתמש בעמודת MS; עבור יותר מ-2 x 108 PBMCs ופחות מ-2 x 109 PBMCs, השתמש בעמודת LS.</li>
			<li>שטפו את העמודה הקדמית והעמודה עם מאגר רץ (500 מיקרוליטר לעמודת MS או 3 מ"ל לעמודת LS).הוסף PBMCs לעמודה המקדימה (המתן עד שתאים ללא תווית יעברו דרך העמודה). יש לשטוף 3 פעמים עם מאגר פועל (500 מיקרוליטר לעמודת MS או 3 מ"ל לעמודת LS). הסר את העמודה המקדימה.</li>
			<li>הנח את העמוד על צינורות של 15 מ"ל. הוסף מאגר רץ (1 מ"ל לעמודת MS או 5 מ"ל לעמודת LS) על העמודה והסר תאי CD14+ על ידי הפעלת לחץ על העמודה.</li>
			<li>צנטריפוגה את ה-eluate ב-300 x g למשך 5 דקות. שטפו גלולת מונוציטים עם 10 מ"ל מדיום תרבית. 
			הערה: נתח את טוהר הכנת המונוציטים באמצעות נוגדנים נגד CD14 וזרימה ציטומטרית (גבוהה קלאסית מ-95%).</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>בידול מונוציטים למקרופאגים.
	<ol>
		<li>דגירה של מונוציטים (106 מונוציטים לבאר ב-6 צלחות באר) ב-3 מ"ל של מדיום תרבית המכיל 10% סרום אנושי AB+ ב-37 מעלות צלזיוס. לאחר 4 ימים, החלף את מדיום התרבית המכיל סרום אנושי במדיום תרבית של 3 מ"ל המכיל 10% FBS למשך 3 ימים נוספים.</li>
		<li>זהה את אוכלוסיית התאים המתקבלת כמקרופאגים שמקורם במונוציטים (MDMs) על ידי זרימה ציטומטרית (ראה איור 1).
		<ol>
			<li>החלף את מדיום התרבות ב -3 מ"ל PBS. גרד MDM עם שוטר גומי ואסוף מתלי MDM. צנטריפוגה ב-400 x גרם למשך 5 דקות. הוסיפו PBS המכיל 2% BSA ל-MDMs עם כדורים וערבבו בעדינות את תרחיף התאים. התאם את ריכוז התאים (10-6 MDMs ב-200 מ"ל PBS) ודגירה ב-4 מעלות צלזיוס.</li>
			<li>הוסיפו 10 מ"ל נוגדנים נגד CD14 ו-10 מ"ל נוגדנים נגד CD68 לתרחיף MDM ודגרו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות בחושך><.
			הערה: יש לסמן נוגדנים אלה בשני פלואורוכרומים שונים התואמים לניתוח ציטומטריית זרימה. לדוגמה, נוגדנים נגד CD14 עשויים להיות מצומדים עם פיקואריתרין בשילוב (לצביעה של מונוציטים) ונוגדנים נגד CD68 עם Alexa Fluor 647 (לצביעה של מקרופאגים).</li>
			<li>צנטריפוגות MDM ב-400 x גרם למשך 5 דקות. הסר סופרנטנטים. יש לפרק בעדינות את גלולת התא ולדגור MDM ב-250 מ"ל 3% פרפורמלדהיד (PFA) למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. צנטריפוגה MDM קבועה PFA ב-400 x גרם למשך 5 דקות. שטפו MDM עם PBS 3 מ"ל וצנטריפוגות MDM ב-400 x גרם למשך 5 דקות. יש להפריד בעדינות את כדור ה-MDM ב-400 מ"ל PBS.</li>
			<li>נתח את ההתמיינות של מונוציטים (המבטאים CD14 אך לא CD68) למונוציטים (המבטאים CD68 אך לא CD14). הערה: באופן קלאסי יותר מ-95% מהתאים הם MDM.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>גירוי של 18 שעות של MDM.
	<ol>
		<li>החלף את אמצעי התרבית של MDMs דבקים במדיום תרבית טרי של 3 מ"ל (המכיל 10% FBS).</li>
		<li>כדי לגרום לקיטוב M1 או M2, השתמש בציטוקינים הרקומביננטיים האנושיים הבאים: IFN-γ ו-TNF לקיטוב M1, ו-IL-4 לקיטוב M2. מקרופאגים M1 מתקבלים גם על ידי גירוי עם LPS. שימו לב שתמיסות מלאי של ציטוקינים נשמרות ב-80 מעלות צלזיוס וכי תמיסת המלאי של LPS נשמרת ב-20 מעלות צלזיוס.
		<ol>
			<li>יש לדלל את תמיסת המלאי של IFN-gγ (1 מ"ג/מ"ל) ב-1/100 בתרבית כדי לקבל דילול של 10 ננוגרם/מ"ל. יש להוסיף 6 מיקרוליטר של דילול IFN-γ זה ל-MDMs כדי לקבל ריכוז IFN-γ סופי של 20 ננוגרם/מ"ל.</li>
			<li>יש לדלל את תמיסת המלאי של TNF (1 מ"ג/מ"ל) ב-1/100 בתרבית כדי לקבל דילול של 10 ננוגרם/מ"ל. יש להוסיף 6 מיקרוליטר של דילול TNF זה ל-MDM כדי לקבל ריכוז TNF סופי של 20 ננוגרם/מ"ל.</li>
			<li>יש לדלל את תמיסת המלאי של IL-4 (1 מ"ג/מ"ל) ב-1/100 בתרבית כדי לקבל דילול של 10 ננוגרם/מ"ל. יש להוסיף 6 מיקרוליטר של דילול IL-4 זה ל-MDM כדי לקבל ריכוז סופי של IL-4 של 20 ננוגרם/מ"ל.</li>
			<li>הוסף 3 מיקרוליטר מתמיסת המלאי של LPS (1 מ"ג/מ"ל) ל-MDM כדי לקבל ריכוז LPS סופי של 1 מיקרוגרם/מ"ל.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>כדי לעורר MDM עם חיידקים, השתמש בחיידקים המומתים בחום. שטפו חיידקים חיים עם PBS וחממו אותם בטמפרטורה של 95 מעלות צלזיוס למשך שעה. השתמשו ב-Orientia tsutsugamushi (זן Kato (CSUR R163), Mycobacterium bovis (Bacillus Calmette-Guérin, BCG CIP זן 671203) ו-Coxiella burnetii (Nine Mile בשלב I) מכיוון שפתוגנים אלה ידועים כמדביקים מקרופאגים. לפיכך, הכינו תרחיף O. tsutsugamushi ב-109 חיידקים למ"ל. הוסף 50 מיקרוליטר ל- MDM . חזור על אותו שלב עבור M. bovis ו- C. burnetii.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>הכנת דגימות ביולוגיות ל-MALDI-TOF MS.
	<ol>
		<li>שטפו MDMs מגורים עם PBS ללא Ca2+ או Mg2+ (תאים עשויים להצטבר בנוכחות Ca2+ או Mg2+). גרד MDM עם שוטר גומי ואסוף מתלי MDM. צנטריפוגות MDM. יש לשטוף שוב MDM ב-PBS ללא Ca2+ או Mg2+ ב-400 x g למשך 5 דקות כדי להיפטר מזיהום FBS.</li>
		<li>התאם את ריכוז התאים (2 x 106 MDM לכל בדיקה). צנטריפוגות MDM ב-400 x גרם למשך 5 דקות והשליכו סופרנטנטים. אסוף כדורי תאים ב-20 מיקרוליטר של PBS ללא Ca2+ או Mg2+.</li>
		<li>נתח דגימות מיד או אחסן אותן ב-PBS בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס לפני הניתוח.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. ניתוח מקרופאגים על ידי Maldi-TOF MS של תא שלם
<ol>
	<li>הכנת מטריצת CHCA.
	<ol>
		<li>הוסף לבקבוקון 500 מיקרוליטר של אצטוניטריל, 250 מיקרוליטר 10% חומצה טריפלואורואצטית ו-250 מיקרוליטר של מים כרומטוגרפיה נוזלית (HPLC) בעלי ביצועים גבוהים. יש לדלל 10 מ"ג CHCA בתמיסה זו לריכוז סופי של 10 מ"ג/מ"ל. מערבבים וסוניקציה למשך 20 דקות לפחות. 
		הערה: סוניקציה תשפר את הרוויה של המטריצה אך שלב זה אינו חובה.</li>
		<li>צנטריפוגה ב-13,000 x גרם למשך 5 דקות. השליכו את הכדור ושמרו את ה-supernatant. 
		הערה: הכינו את תמיסת המטריצה ממש לפני השימוש. תמיסת מטריצה המכילה גבישים אינה מאפשרת יינון טוב של מולקולות הדגימה, והדבר עלול להשפיע על איכות הספקטרום.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>הכנת יעד פלדה MALDI.
	<ol>
		<li>הרטיבו את מטרת הפלדה המלוטשת במי ברז חמים. משפשפים בנייר ניגוב מדויק. מוסיפים 70% אתנול ומשפשפים. שוטפים במים על ידי שפשוף. מוסיפים 70% אתנול ומשפשפים בנייר מדויק.</li>
		<li>טבלו את המטרה ב-70% אתנול וסוניקט למשך 15 דקות לפחות. כסו את המטרה ב-500 מיקרוליטר עד 1 מ"ל של חומצה טריפלואורואצטית ב-80%. משפשפים ומנגבים בנייר מדויק. יש לשטוף במי HPLC מבלי לשפשף. יבש את המטרה בטמפרטורת החדר. 
		הערה: מטרה לא מנוקה כראוי עלולה להשפיע על איכות הספקטרום.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>הכנת פיקדונות.
	<ol>
		<li>הנח את המטרה הנקייה על תמיכה אופקית ומישורית כדי להשיג משקעים אחידים.</li>
		<li>הפשירו בעדינות דגימות MDM על קרח. הערה: הפשרה מהירה ונמרצת עלולה לשנות דגימות, ובכך להשפיע על איכות הספקטרום. הומוגניזציה של MDMs (על ידי פיפטינג קדימה ואחורה של תרחיף התאים) לפני שקיעה של 1 מיקרוליטר (המכיל כ-1 x 105 תאים) על מטרת MALDI. הוסף 1 מיקרוליטר של תמיסת מטריצת MALDI על המדגם. הימנע מנקודת ערבוב עם הפיפטה. ערבוב כתמים עם פיפטות משנה את איכות הספקטרום. להוציא 12-16 דגימות/בדיקה (שכפולים טכניים).</li>
		<li>מתאדים באופן ספונטני בטמפרטורת החדר. הערה: האידוי מתרחש בהדרגה ומוביל להיווצרות גבישי מטריצה/דגימה. ניתן לנתח את המשקעים באופן מיידי או לאחסן אותם בחושך במשך מספר ימים לפני הניתוח (עד שבועיים).</li>
		<li>על המשתמש לשלוט בכך שהציטוקינים או החיידקים המומתים בחום ששימשו בניסוי אינם מספקים שיאים בטווח הספקטרום של מקרופאגים מגורים. כאן, בדקנו שהציטוקינים והחיידקים שנהרגו בחום לבדם לא סיפקו שום אות בטווח הנחקר (0-20 kDa).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>כוונון ספקטרומטר מסה ורכישת נתונים.
	<ol>
		<li>הכנס את מטרת הפלדה המכילה דגימות בספקטרומטר המסה.</li>
		<li>הגדר את ספקטרומטר המסה והפעל רכישת נתונים. השתמש בתצורת ברירת המחדל לרכישה אוטומטית של הנתונים.</li>
		<li>הערה: תצוגה מפורטת של התצורה של תוכנת flexControl ניתנת בנספח/טבלה 1. זה עשוי להשתנות בהתאם לספקטרומטר המסה ולתוכנה בה נעשה שימוש.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. ניתוח ביואינפורמטי
הערה: הניתוח הביואינפורמטי בוצע באמצעות תוכנת הניתוח הסטטיסטי החינמית והקוד הפתוח R, יחד עם ספריות ניתוח ספציפיות (MALDIquant). ניתן להוריד את R באופן חופשי מאתר האינטרנט שלה <a href="http://cran.r-project.org/">http://cran.r-project.org/</a>. תיאור מפורט של קובץ ה- Script מסופק כ- <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50926/50926_MALDI_Ouedraogo_JoVE.tar.gz" target="_blank">חומר משלים.</a>
<ol>
	<li>טעינה וטיפול מקדים בנתונים גולמיים.
	<ol>
		<li>אחסן נתונים גולמיים במחשב המשויך לספקטרומטר המסה במספר קבצים ותיקיות. אחזר את תיקיית השורש של הניסוי עם כל תיקיות המשנה. העתק את תיקיית השורש למחשב האישי לצורך ניתוח.</li>
		<li>השתמש בספריות readBrukerFlexData ו-MALDIquant כדי לטעון ולנתח נתונים גולמיים. 
		הערה: readBrukerFlexData מאפשר טעינת נתונים גולמיים מספקטרומטר המסה לאובייקט ספציפי ב-R לצורך ניתוח נוסף. ראה תיאור MALDIquant למידע נוסף27.</li>
		<li>ניתוח ספקטרום שנוצר. 
		הערה: כל ספקטרום מורכב מרשימה של פסגות עם המסות והעוצמות שלהן (שפע יחסי). השתמש בשורש הריבועי של העוצמות כדי לשפר את ההדמיה הגרפית של הספקטרום. תקן את הרקע באמצעות אלגוריתם חיתוך שיא לא ליניארי רגיש לסטטיסטיקה להערכת קו בסיס27. השתמש ביחס אות לרעש של 6 כדי לזהות פסגות. קחו בחשבון שהפסגות שזוהו דומות על פני הספקטרום כאשר ערכי המסה/מטען (m/z) נמצאים בתוך חלון של 2,000 עמודים לדקה.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>הגדרת ציון וחישוב. סווג את הספקטרום באמצעות אשכולות היררכיים עם אלגוריתם מחלקה לצבירה ומטריצת אי-דמיון המבוססת על מרחק Jaccard. 
	הערה: מדד ז'קארד מודד את הדמיון בין קבוצות דגימה בוליאניות (כלומר נוכחות/היעדר רשימת פסגות).</li>
	<li>השוואה בין ספקטרום וצפייה.
	<ol>
		<li>נתח עלילות ספקטרום גולמיות. הערה: ציר x מייצג את יחס m/z (ב-Daltons) וציר ה-y מייצג את העוצמה (שפע יחסי).</li>
		<li>העריכו את הדמיון בין ספקטרום על ידי אשכולות היררכיים. מייצגים דמיון (או סטייה) כדנדרוגרמה.</li>
		<li>העריכו את יכולת השחזור באמצעות ייצוג תצוגת ג'ל וירטואלית. הערה: ייצוג תצוגת ג'ל וירטואלי הוא עלילת מפת חום שונה שבה השפע היחסי מקודד בצבע עם עוצמות הולכות וגדלות של כחול.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Mass Gross, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMass+Gross%2C+J+%22Spectrometry%3A+A+Textbook%22">Spectrometry: A Textbook</a>. , Springer-Verlag. Berlin. (2011).</li>
<li>Villanueva, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+Peptide+Profiling+by+Magnetic+Particle-Assisted%2C+Automated+Sample+Processing+and+MALDI-TOF+Mass+Spectrometry.%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Serum Peptide Profiling by Magnetic Particle-Assisted, Automated Sample Processing and MALDI-TOF Mass Spectrometry.</a> Anal. Chem. 76 (6), 1560-1570 (2004).</li>
<li>Diamandis, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+Spectrometry+as+a+Diagnostic+and+a+Cancer+Biomarker+Discovery+Tool+Opportunities+and+Potential+Limitations%5BTitle%5D)+AND+%22Molec.+Cell.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Mass Spectrometry as a Diagnostic and a Cancer Biomarker Discovery Tool Opportunities and Potential Limitations.</a> Molec. Cell. Proteomics. 3 (4), 367-378 (2004).</li>
<li>Pusch, W., Kostrzewa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+MALDI-TOF+Mass+Spectrometry+in+Screening+and+Diagnostic%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Application of MALDI-TOF Mass Spectrometry in Screening and Diagnostic.</a> 11 (20), 2577-2591 (2005).</li>
<li>Aebersold, R., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry-based+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry-based proteomics.</a> Nature. 422 (6928), 198-207 (2003).</li>
<li>Domon, B., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+Spectrometry+and+Protein+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mass Spectrometry and Protein Analysis.</a> Science. 312 (5771), 212-217 (2006).</li>
<li>Carbonnelle, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robustness+of+two+MALDI-TOF+mass+spectrometry+systems+for+bacterial+identification%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Robustness of two MALDI-TOF mass spectrometry systems for bacterial identification.</a> J. Microbiol. Methods. 89 (2), 133-136 (2012).</li>
<li>Bizzini, A., Jaton, K., Romo, D., Bille, J., Prod’hom, G., Greub, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix-Assisted+Laser+Desorption+Ionization%E2%80%93Time+of+Flight+Mass+Spectrometry+as+an+Alternative+to+16S+rRNA+Gene+Sequencing+for+Identification+of+Difficult-To-Identify+Bacterial+Strains%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization–Time of Flight Mass Spectrometry as an Alternative to 16S rRNA Gene Sequencing for Identification of Difficult-To-Identify Bacterial Strains.</a> J. Clin. Microbiol. 49 (2), 693-696 (2011).</li>
<li>Buchanan, C. M., Malik, A. S., Cooper, G. J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+visualisation+of+peptide+hormones+in+cultured+pancreatic+islet+alpha-+and+beta-cells+by+intact-cell+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Commun.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Direct visualisation of peptide hormones in cultured pancreatic islet alpha- and beta-cells by intact-cell mass spectrometry.</a> Rapid Commun. Mass Spectrom. 21 (21), 3452-3458 (2007).</li>
<li>Ouedraogo, R., Flaudrops, C., Ben Amara, A., Capo, C., Raoult, D., Mege, J. -L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+analysis+of+circulating+immune+cells+by+matrix-assisted+laser+desorption+ionization+time-of-flight+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Global analysis of circulating immune cells by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry.</a> PloS One. 5 (10), 13691 (2010).</li>
<li>Munteanu, B., von Reitzenstein, C., Hänsch, G. M., Meyer, B., Hopf, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+robust+and+automated+protein+analysis+of+cell+differentiation+and+of+primary+human+blood+cells+by+intact+cell+MALDI+mass+spectrometry+biotyping%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Bioanal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Sensitive robust and automated protein analysis of cell differentiation and of primary human blood cells by intact cell MALDI mass spectrometry biotyping.</a> Anal. Bioanal. Chem. 404 (8), 2277-2286 (2012).</li>
<li>Feng, H., Sim, L. C., Wan, C., Wong, N. S. C., Yang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+characterization+of+protein+productivity+and+production+stability+of+CHO+cells+by+matrix-assisted+laser+desorption%2Fionization+time-of-flight+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Commun.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Rapid characterization of protein productivity and production stability of CHO cells by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry.</a> Rapid Commun. Mass Spectrom. 25 (10), 1407-1412 (2011).</li>
<li>Ouedraogo, R., Daumas, A., Ghigo, E., Capo, C., Mege, J. -L., Textoris, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-cell+MALDI-TOF+MS%3A+A+new+tool+to+assess+the+multifaceted+activation+of+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Whole-cell MALDI-TOF MS: A new tool to assess the multifaceted activation of macrophages.</a> J. Proteomics. 75 (18), 5523-5532 (2012).</li>
<li>Amann, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+profiling+of+proteins+in+lung+cancer+cells+from+fine-needle+aspirates+by+matrix-assisted+laser+desorption+ionization+time-of-flight+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Selective profiling of proteins in lung cancer cells from fine-needle aspirates by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry.</a> Clin. Cancer Res. 12 (17), 5142-5150 (2006).</li>
<li>Maurer, K., Eschrich, K., Schellenberger, W., Bertolini, J., Rupf, S., Remmerbach, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+brush+biopsy+analysis+by+MALDI-ToF+Mass+Spectrometry+for+early+cancer+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Oral+Oncol%22%5BJournal%5D)">Oral brush biopsy analysis by MALDI-ToF Mass Spectrometry for early cancer diagnosis.</a> Oral Oncol. 49 (2), 152-156 (2013).</li>
<li>Ishii, K. J., Koyama, S., Nakagawa, A., Coban, C., Akira, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+innate+immune+receptors+and+beyond%3A+making+sense+of+microbial+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Host innate immune receptors and beyond: making sense of microbial infections.</a> Cell Host Microbe. 3 (6), 352-363 (2008).</li>
<li>Mantovani, A., Sica, A., Locati, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+polarization+comes+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Macrophage polarization comes of age.</a> Immunity. 23 (4), 344-346 (2005).</li>
<li>Martinez, F. O., Sica, A., Mantovani, A., Locati, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+activation+and+polarization%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Biosci%22%5BJournal%5D)">Macrophage activation and polarization.</a> Front. Biosci. 13, 453-461 (2008).</li>
<li>Mosser, D. M., Edwards, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+the+full+spectrum+of+macrophage+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Exploring the full spectrum of macrophage activation.</a> Nat. Rev. Immunol. 8 (12), 958-969 (2008).</li>
<li>Murray, P. J., Wynn, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+and+pathogenic+functions+of+macrophage+subsets%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Protective and pathogenic functions of macrophage subsets.</a> Nat. Rev. Immunol. 11 (11), 723-737 (2011).</li>
<li>Benoit, M., Desnues, B., Mege, J. -L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+polarization+in+bacterial+infections%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Macrophage polarization in bacterial infections.</a> J. Immunol. 181 (6), 3733-3739 (2008).</li>
<li>Biswas, S. K., Sica, A., Lewis, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+of+macrophage+function+during+tumor+progression%3A+regulation+by+distinct+molecular+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Plasticity of macrophage function during tumor progression: regulation by distinct molecular mechanisms.</a> J. Immunol. 180 (4), 2011-2017 (2008).</li>
<li>Cassetta, L., Cassol, E., Poli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+polarization+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+World+J%22%5BJournal%5D)">Macrophage polarization in health and disease.</a> Sci. World J. 11, 2391-2402 (2011).</li>
<li>Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+activation+of+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Alternative activation of macrophages.</a> Nat. Rev. Immunol. 3 (1), 23-35 (2003).</li>
<li>Mantovani, A., Sica, A., Sozzani, S., Allavena, P., Vecchi, A., Locati, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemokine+system+in+diverse+forms+of+macrophage+activation+and+polarization%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">The chemokine system in diverse forms of macrophage activation and polarization.</a> Trends Immunol. 25 (12), 677-686 (2004).</li>
<li>Delaby, A., Gorvel, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+monocyte+dynamics+in+Q+fever+granuloma+deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Defective monocyte dynamics in Q fever granuloma deficiency.</a> J. Infect. Dis. 205 (7), 1086-1094 (2012).</li>
<li>Gibb, S., Strimmer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MALDIquant%3A+a+versatile+R+package+for+the+analysis+of+mass+spectrometry+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">MALDIquant: a versatile R package for the analysis of mass spectrometry data.</a> Bioinformatics. 28 (17), 2270-2271 (2012).</li>
</ol>

למחברים אין ניגוד אינטרסים להצהיר עליהם. RO, JLM ו-CC הם ממציאים של פטנט בינלאומי WO 2011/154650, בשם "Procédé d'identification de cellules de mammifères par spectrométrie de masse MALDI-TOF".

פרוטוקול זה מתאר את השימוש ב-MALDI-TOF-MS על תאים שלמים אוקריוטיים. כאן, אנו מדגימים את הדיוק של השיטה על ידי ניתוח מצבי ההפעלה המרובים של מקרופאגים בתגובה למיקרו-סביבה שלהם.
הצלחת הפרוטוקול מסתמכת על כמה צעדים קריטיים. ראשית, כל מזהם תמיסה עשוי לשנות את הספקטרום. לדוגמה, חשוב לשטוף תאים ב-PBS כדי להסיר מדיום תרבית וחלבוני סרום לפני התצהיר על המטרה. יש צורך גם בריכוז תאים של 1 x 105 תאים/מיקרוליטר כדי להבטיח תוצאות הניתנות לשחזור. שנית, ההתגבשות היא שלב חשוב בפרוטוקול. כדי להבטיח תו...

ספקטרומטריית מסה של זמן טיסה (MALDI-TOF MS) היא טכניקת ספקטרומטריית מסה פופולרית לחקר דגימות ביולוגיות. שימוש בקרן לייזר ובמטריצה סופגת אנרגיה מאפשר תהליך יינון רך: אידוי ויצירה של ביומולקולות גדולות בעיקר חד-טעונות. תהליך זה נקרא ספיגה/יינון, המצדיק את ראשי התיבות MALDI. יונים אלה מואצים לאחר מכן על ידי הפעלת מתח ונכנסים למנתח TOF המאפשר הפרדה של יונים אלה וכימות המסות שלהם1.
MALDI-TOF MS נמצא בשימוש נרחב בביולוגיה, כימיה ורפואה לזיהוי מולקולות וסמנים ביולוגיים2-4 או לניטור שינויים לאחר תרגום ב-proteins5,6. לאחרונה, מספר קבוצות יישמו את MALDI-TOF MS לזיהוי מיקרואורגניזמים מדגימות קליניות7,8. יישום מיקרוביולוגי זה משמש כיום באופן שגרתי במסגרות הקליניות. ל-MALDI-TOF של תא שלם יתרונות רבים בהשוואה ליישומים קלאסיים של MALDI-TOF MS. דגימות המכילות תאים שלמים מעובדות ישירות, תוך הימנעות משלבים גוזלי זמן לפיצול או הפרדה של כמויות גדולות של חומר. יתר על כן, אין צורך באפיון הפסגות השונות: הספקטרום כולו נחשב כטביעת אצבע של הדגימה, ואלגוריתמים תואמים משווים את הספקטרום הנבדק למסד נתונים של ספקטרום ייחוס.
אנחנו ואחרים יישמנו את טכניקת ניתוח התאים השלמים הזו על תאים אוקריוטיים. יישומים רבים עשויים להיגזר מטכניקה זו: (1) לזהות את סוגי התאים העיקריים ממדגם מעורב9-11; (2) להעריך את הכדאיות של תרביות תאים לאורך זמן (כולל בקרת איכות, יישומים תעשייתיים)12; (3) לנטר מצבי הפעלה של תא בודד מסוג13; (4) להעריך את הטרנספורמציה הממאירה של מדגם קליני14,15.
כאן, אנו מתארים את השימוש ב-MALDI-TOF MS של תאים שלמים כדי לחקור את פנוטיפים הקיטוב השונים של מקרופאגים בתגובה לציטוקינים או חיידקים שנהרגו בחום. מקרופאגים ממלאים תפקיד מרכזי בתגובה החיסונית לפתוגנים מיקרוביאליים. הם מזהים גורמים זיהומיים ברקמות באמצעות קולטנים לזיהוי דפוסים המסוגלים לזהות דפוסים מיקרוביאליים משומרים, כגון ליפופוליסכריד (LPS)16. מקרופאגים הם תאים מקצועיים המציגים אנטיגן המקיימים אינטראקציה עם תאי T כדי להגביר את התגובה החיסונית הנרכשת. תאי T משפיעים על מקרופאגים על ידי שחרור ציטוקינים המחזקים או מווסתים את פעילות קוטלי המיקרופגים של מקרופאגים. באנלוגיה לקיטוב הלימפוציטים Th1/Th2, מקרופאגים דלקתיים, קוטלי חיידקים וקוטלי גידולים סווגו למקרופאגים M1 ומקרופאגים מווסתים חיסוניים כמקרופאגים M217-19. המונח M1 מתייחס להפעלה קלאסית של מקרופאגים על ידי ציטוקינים מסוג I, כגון אינטרפרון (IFN)-γ וגורם נמק גידול (TNF), או תוצרי חיידקים, כגון LPS18,20-23, בעוד שמקרופאגים המופעלים על ידי מסלולים חלופיים (אינטרלוקין (IL)-4, IL-10, Transforming Growth Factor-β1 נחשבים למקרופאגים M219,24,25. הפלסטיות הפנוטיפית והתפקודית הגבוהה של מקרופאגים בתגובה למיקרו-סביבה שלהם הופכת את המקרופאגים הללו לשימושיים לניתוח שינויים עדינים על ידי גישת MALDI-TOF MS.

ספקטרומטריית מסה maldi-tof של תא שלם היא שיטה מדויקת ומהירה לניתוח מצבים שונים של הפעלת מקרופאגים

Whole-cell MALDI-TOF Mass Spectrometry is an Accurate and Rapid Method to Analyze Different Modes of Macrophage Activation

MALDI-TOF היא טכניקת ספקטרומטריית מסה בשימוש נרחב בכימיה ובביוכימיה. הוא יושם גם ברפואה לזיהוי מולקולות וסמנים ביולוגיים. לאחרונה נעשה בו שימוש במיקרוביולוגיה לזיהוי שגרתי של חיידקים הגדלים מדגימות קליניות, ללא שלבי הכנה או פיצול. אנו ואחרים יישמנו בהצלחה את טכניקת ספקטרומטריית המסה MALDI-TOF של תאים שלמים על תאים אוקריוטיים. היישומים הנוכחיים נעים בין זיהוי סוג תא להערכת בקרת איכות של תרבית תאים ויישומי אבחון. כאן, אנו מתארים את השימוש בו כדי לחקור את פנוטיפים הקיטוב השונים של מקרופאגים בתגובה לציטוקינים או לחיידקים שנהרגו בחום. זה איפשר זיהוי של טביעות אצבע ספציפיות למקרופאגים המייצגות את מגוון התגובות הפרוטאומיות של מקרופאגים. יישום זה ממחיש את הדיוק והפשטות של השיטה. הפרוטוקול שתיארנו כאן עשוי להיות שימושי לחקר תגובת המארח החיסוני במצבים פתולוגיים או עשוי להיות מורחב ליישומי אבחון רחבים יותר.

מטרת הפרוטוקול הנוכחי היא להדגים את הדיוק של MALDI-TOF MS של תאים שלמים להערכת התגובתיות של מקרופגים לסביבתם המיקרוסקופית.
איור 1 מתאר את הכנתם של מקרופאגים מעוררים מדגימות דם. איור 2 מציג את הניתוח של מונוציטים ו-MDMs באמצעות ציטומטריה של זרימה. שימו לב כי מונוציטים ביטאו CD14 אך לא CD68 (איור 1A). בניגוד לכך, MDMs ביטאו CD68 אך לא CD14 (איור 1B).
איור 3 מתאר את העיקרון של MALDI-TO...

פרוטוקול זה מתאר את השימוש בספקטרומטריית מסה של תאים שלמים MALDI-TOF על תאים אוקריוטיים. כאן, אנו מדגימים את הדיוק של הטכניקה הזו על ידי ניתוח מצבי ההפעלה המרובים של מקרופאגים בתגובה למיקרו-סביבה שלהם.

ספקטרומטריית מסה MALDI-TOF של תא שלם היא שיטה מדויקת ומהירה לניתוח מצבים שונים של הפעלת מקרופאגים

MALDI-TOF is an extensively used mass spectrometry technique in chemistry and biochemistry. It has been also applied in medicine to identify molecules and ...

ניסוי זה עושה שימוש בספקטרומטריית מסות של תאים שלמים. כדי לנתח במדויקת את מצבי ההפעלה המרובים של מקרופגים, גזור תחילה את המקרופגים ממונוציטים חיוביים ל-CD 14 ולאחר מכן גרה את התאים באמצעות אגוניסטים כגון ציטוקינים וחיידקים. נתח את הדגימות באמצעות moly to על גבי מטרה מפלדה, תוך הפרדת החלבונים והשגת ספקטרום עבור כל דגימה.תוצאות של טביעות אצבע ספציפיות יכולות להבחין בין מצבי הפעלה שונים של תא אוקריוטי בודד, המקרופאג, בהתבסס על ניתוח ביו-אינפורמטי של הספקטרה שהתקבלו באמצעות ספקטרומטריית מסות של תא שלם. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו זרימה הוא שהיא מהירה, פשוטה ואינה יקרה. בניסוי זה, אנו מראים כי ספקטרה הניתנות לשחזור התקבלו ממקרופאגים וכי מצבי הפעלה שונים הובחנו באמצעות ov של תא שלם.אנו מקבלים ספקטרום גם מ-BBMC, שעשוי להיות שימושי לאבחון תגובת המארח לזיהום. שיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי מצבי ההפעלה של תאי מערכת החיסון. ניתן ליישמה גם במערכות אחרות, כגון פרופיילינג של מושגים כדי להחליף, למשל, ניתוח נוסף במהלך ניתוח. יש לבודד את התאים מ-opax במבחנות של 50 milliliter.הוסיפו 15 מיליליטר, דללו את הדם פי עשרה בתמיסת סליין. לאחר מכן, הפרידו 30 מיליליטר של הדם המדולל על גרדיאנט. לאחר השגת טבעת ה-PBMCs, שמרו את התאים על קרח.פרוק בעדינות את תרחיף ה-P BMCs לתוך 80 µL של running buffer. הוסף 20 µL של חרוזי מגנט מצופים בנוגדני anti CD 14. ערבב והדגר למשך 15 דקות.שטפו פעם אחת עם 5 mL של בופר הרצה וסובבו בצנטריפוגה ב-300 Gs למשך חמש דקות. פרקו בעדינות את משקע התאים לתוך 500 µL של בופר הרצה. בחרו את העמודה המתאימה להפרדה מגנטית.שטפו את עמודת ה-preco ואת העמודה עם בופר הרצה. לאחר מכן, העמיסו את ה-pbmc אל ה-preco. החילו שדה מגנטי ושטפו שלוש פעמים עם בופר הרצה.הסירות את מסנן הקדם-כיול (pre-cal) והניחו את העמודה על מבחנה של 15 milliliters. הוסיפו באפר הרצה ושחררו את התאים החיוביים ל-CD 14 על ידי הפעלת לחץ על העמודה. לאחר מכן, בצעו סרכוז.סובבו במהירות של 300 Gs למשך חמש דקות. השליכו את העלייה. שטפו את משקע המונוציטים עם 10 milliliters של מצע גידול.קחו מנה (aliquot) של המצע כדי לקבוע את טוהר הכנת המונוציטים באמצעות ציטומטריית זרימה (flow cytometry) תוך שימוש בנוגדנים נגד CD 14. זרעו את המונוציטים ב-3 mL של מצע תרבית המכיל 10% סרום אנושי מסוג AB positive למשך ארבעה ימים. לאחר מכן, החליפו את המצע ב-RPMI המועשר ב-10% FBS. זהו את אוכלוסיית התאים שהתקבלה כמאקרופגים ממקור מונוציטי באמצעות ציטומטריית זרימה.גרה את הדגימות בהתאם לתכנון הניסוי. לאחר שטיפת ה-MDMs המגורים ב-PBS, גרד את התאים באמצעות שפשף גומי (rubber policeman) ואסוף את תרחיפי ה-MDM. שקע את התאים על ידי סנטריפיגציה, ולאחר מכן שטוף פעם אחת ב-PBS כדי להסיר שאריות של FBS.שקעו את ה-M dms באמצעות צנטריפוגציה ושספו מחדש את המשקעים ב-20 microliters של PBS. נתחו את התאים באופן מיידי או שמרו אותם ב-PBS בטמפרטורה של minus 80 degrees Celsius לפני הניתוח. להכנת מטריצת CHCA, הוסיפו למבחנה 500 microliters של acetyl nitrile, 250 microliters של 10%tri Fluor acetic acid, ו-250 microliters של מים בדרגת HPLC.לאחר מכן, הוסיפו 10 µL של תמיסת CHCA ובצעו סוניקציה למטריקס למשך 20 דקות לפחות. סובבו בצנטריפוגה ב-13,000 Gs למשך חמש דקות, שמרו את supernatant והשליכו את ה-pellet. לאחר מכן, הרטיבו את מטרת הפלדה המלוטשת במי ברז חמים ושפשפו בעזרת נייר לבן מדויק.הוסיפו 70% ethanol ושפשפו את ה-RINs עם מים. לאחר מכן, הוסיפו 70% ethanol ושפשפו בעזרת נייר מדויק. טבלו את המטרה ב-70% ethanol ובצעו סוניקציה למשך 15 דקות לפחות.כסו את המטרה ב-500 µL עד 1 mL של 80% dry fluoro acidic acid, שפשפו ונגבו בעזרת נייר מדויק. לאחר מכן, שטפו במים בדרגת HPLC ללא שפשוף. ייבשו את המטרה בטמפרטורת החדר.כעת הפשילו בעדינות את דגימות ה-MDM על קרח. ערבבו את תרחיית תאי ה-MDM באמצעות פיפטינג והניחו מיקרוליטר אחד על מטרת ה-MALDI. הוסיפו מיקרוליטר אחד של תמיסת המטריצה של ה-MALDI על הדגימה.עבור שכפולים טכניים. יש להשקיע 12 עד 16 דגימות לכל בדיקה; האידוי מתרחש באופן ספונטני בטמפרטורת החדר. כעת, הכנס את מטרת הפלדה המכילה את הדגימות לספקטרומטר המסות.הגדירו את ספקטרומטר המסה והפעילו את רכישת הנתונים. כל ספקטרום מורכב מרשימה של שיאים עם המסות והעוצמות המתאימות, המצביעות על שכיחות יחסית. השתמשו בשורש הריבועי של העוצמות כדי לשפר את הוויזואליזציה הגרפית של הספקטרומים.לאחר מכן, תקנו את הרקע באמצעות אלגוריתם גזירת שיאים (peak clipping) לא-ליניארי הרגיש לסטטיסטיקה. להערכת קו הבסיס, השתמשו ביחס אות לרעש של שישה כדי לזהות שיאים. החשיבו כי השיאים שזוהו דומים בין ספקטרום לספקטרום כאשר ערכי המסה למטען נמצאים בטווח של 2000 PM.בניסוי זה, הוכנו מקפגים שעברו גרייה מדגימות דם. מונוציטים סווגו (gated) על פי ביטוי של CD 14, אך לא של CD 68. לעומת זאת, מקפגים שנגזרו ממונוציטים זוהו על פי ביטוי של CD 68, אך לא של CD 14.נתונים אלה מדגימים את תפקיד הכנת הדגימות בפרשנות של תוצאות MALDI toff MS. ספקטרום באיכות טובה מכיל בדרך כלל שיא מרכזי סביב חמישה kilodaltons. ריכוז תאים מינימלי נדרש כדי לקבל דגימות טובות, כפי שניתן לראות בספקטרום באיכות ירודה זה, שהתקבל עם ריכוז תאים נמוך.תוצאות דומות ודלות מתקבלות כאשר הדגימה מעורבבת עם המטריצה לפני ההשקעה על לוחית המטרה. כאן, ספקטרא מדגימות שונות מוצגים כמיפוי חום (heat map). שפע יחסי מסומן בצבע לפי עוצמות של כחול.ייצוג זה של תצוגת ג'ל וירטואלית ממחיש את השחזוריות של הדגימות בתוך כל מחלקה. ניתוח לא מפוקח באמצעות clustering היררכי מסוכם כתרשים. כל הדגימות השתבצו בתוך שלוש קבוצות שונות.MDMs לא מגורים, MDMs מגורים ב-IFN Gamma, או MDMs מגורים ב-IL four. באופן משמעותי, ניתוח MALDI TOF מאפשר הבחנה בין מקרופאגים מסוג M1 למקרופאגים מסוג M two ובין MDMs לא מגורים. ייצוג הפסגות של ספקטרום ייחוס עבור MDMs מגורים ב-IFN gamma, ב-IL four, או לא מגורים, מראה פסגות ספציפיות לכל סוג.ניתן להשרות טביעות אצבע ספציפיות על ידי מספר אגוניסטים כדי להדגים את הדיוק של maloff של תא שלם. ספקטרא מכל הדגימות המגורות הופרדו בבירור מאלו של מקרופאגים שאינם מגורים. MDMs הראו גם טביעות אצבע ספציפיות שהושרות על ידי חיידקים שהומתו בחום.תוצאות אלו תומכות בהשערה שניתן להשתמש ב-MALDI כדי לנתח תאים במחזור הדם להערכת התגובה של המארח לזיהום או למחלות דלקתיות במסגרת קלינית כאשר הדגימה מוכנה. טכניקה זו יכולה להסתיים תוך שעה אחת אם היא מבוצעת כראוי. לאחר צפייה בסרטון זה, צריכה להיות לכם הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן להעריך מצבי הפעלה של תאים כאוטיים באמצעות ספקטרומטריית מסה של תאים שלמים.

whole-cell-maldi-tof-mass-spectrometry-is-an-accurate-rapid-method-to

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

ספקטרומטריית מסה MALDI-TOF של תאים שלמים היא שיטה מדויקת ומהירה לניתוח מצבי הפעלה שונים של מקרופאגים

מקרופאגים הם תאי המפתח המעורבים בפתוגניות של המארח. מקרופאגים מציגים מגוון פנוטיפי ותפקודי שניתן לנתח ולזהות על ידי ניתוח פרוטאומי. מאמר זה מתאר כיצד לבצע אלקטרופורזה דו-ממדית של תרביות ראשוניות של מקרופאגים אנושיים המובחנים לפנוטיפ M1 או M2.

Proteomic פרופיל של המקרופאגים על ידי 2D אלקטרופורזה

תכנות מחדש מטבולי הוא מאפיין ותנאי מוקדם לקיטוב מקרופאגים M1 ו-M2. כתב יד זה מתאר מבחן למדידת פרמטרים בסיסיים של גליקוליזה ותפקוד מיטוכונדריאלי במקרופאגים שמקורם במח עצם של עכבר. ניתן ליישם כלי זה כדי לחקור כיצד גורמים מסוימים משפיעים על חילוף החומרים והפנוטיפ של המקרופאגים.

אפיון חילוף חומרים של מקוטב M1 והמקרופאגים נגזר מח עצם M2 באמצעות ניתוח תאי שטף בזמן אמת

אנו מתארים את הגילוי של הפעלת inflammasome NLRP3 על בסיס הסלולר באמצעות מיקרוסקופ פלורסצנטיות, צביעת עבור קספאז פעיל-1 ואת המתאם, עולה. Assay שחרורו לקטט דהידרוגנאז מוצג כדי לזהות פירוק pyroptotic על בסיס האוכלוסייה. טכניקות אלו ניתן להתאים ללמוד היבטים רבים של ביולוגיה inflammasome.

זיהוי של Inflammasome ההפעלה ומוות תא Pyroptotic של מקרופאגים הנגזרות מח עצם מאתר

שיטה של הכנת הדוגמא פותחה כדי להתאים coculture תאים ורקמות לזהות מולקולה קטנה exchange באמצעות ספקטרומטר מסה הדמיה.

לכידת תקשורת מולקולה קטנה בין רקמות ותאים באמצעות הדמיה ספקטרומטר מסה

דוח זה מתאר פרוטוקול אוטומטי לבדיקות אימונופלואורסצנטיות מרובות (mIF) על מכתים שקופיות אוטומטי. זה מדגים את יכולת השחזור הגבוהה של פרוטאומיקה מרחבית על צביעות רקמות סטנדרטיות בתפוקה גבוהה ומצלמות פלואורסצנטיות שלמות, שהיא אידיאלית עבור מבחני mIF מותאמים אישית על פני מספר רב של שקופיות רקמה במחקר תרגומי.

מבחני אימונופלואורסצנציה אוטומטיים מרובים בתפוקה גבוהה למחקר תרגומי

כאן, אנו מתארים בפירוט שיטות לחילוץ מקרופאגים ממח העצם, הטחול והלב האוטם, ולאחר מכן הערכת שטף מטבולי בתאים חיים.

ניתוח שטף מטבולי ex vivo במקרופאגים של הטחול והלב, ומונוציטים של מח העצם

פרוטוקול זה מתאר את השימוש במיקרוMS לספקטרומטריית מסה MALDI-2 חד-תאית מונחית פלואורסצנטית, המאפשרת פרופיל מולקולרי משופר של תאי עצב ראשוניים של חולדות.

ספיגה/יינון לייזר בסיוע מטריצה פלואורסצנטית עם ספקטרומטריית מסה פוסטיוניזציה המושרה בלייזר של תאים עצביים בודדים של חולדה

פרוטוקול זה מתאר גישה פשוטה דבק, סרט המבוסס על מדגם של עגבניות ושאר משטחים תוצרת טרייה, ואחריו איתור מהיר של כל...

שילוב של הדגימה דבק קלטת מבוססי פלואורסצנטי באתרו הכלאה עבור איתור מהיר של סלמונלה על תוצרת טרייה

מקרופאגים הנגזרות מונוציטים הם תאים חשובים של מערכת החיסון המולדת. כאן, אנו מתארים קלים...

<em&gt; במבחנה</em&gt; מודל ללמוד ההטרוגניות של בידול Macrophage אדם וקיטוב

הנויטרופילים הם תאי דם הלבנים הנפוצים ביותר בדם. נויטרופילים בעלי פונקציות מוסדרות תעתיק כגון ייצור של ציטוקינים ועיכוב של אפופטוזיס מעודדים דלקת. פונקציות אלה יכולות להיות למדו בשיטה שהוצגה כאן, המאפשרת זיהוי וכימות גורמים גרעיניים על ידי cytometry זרימה בגרעינים...

פשוט ויעילה שיטה לגילוי הפעלת פקטור גרעינית בנויטרופילים אדם על ידי זרימת cytometry

למדו לנתח מצבי הפעלה שונים של מקרופאגים באמצעות ספקטרומטריית מסה MALDI-TOF של תא שלם. השיטה המהירה והחסכונית מספקת טביעות אצבע ספקטרליות לזיהוי מדויק של תגובות תאיות.

ספקטרומטריית מסה MALDI-TOF של תא שלם היא שיטה מדויקת ומהירה לניתוח מצבים שונים של הפעלת מקרופאגים

גלה סרטונים נוספים