Name: השתלת Subretinal של MACS מטוהרים פוטורצפטור קודמן תאים לתוך הרשתית עכבר בוגר (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 28 s
Description: למדו שיטת השתלת תאי קדם-פוטורצפטורים מטוהרים לרשתית עכבר בוגר באמצעות מיון תאים מגנטי CD73. שיטה זו מאפשרת חקר אינטגרציה תאית ופוטנציאל שיקום ראייה ברפואה רגנרטיבית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו אוהבים להודות לאנאנד סווארופ על שסיפק לעכברי NRL-GFP, יוכן האס על התמיכה הטכנית, וסינדי בוהם ואמלי לסמן על גידול בעלי חיים.	
	עבודה זו נתמכה על ידי דויטשה Forschungsgemeinschaft (DFG): FZT 111 - מרכז טיפולים רגנרטיביים דרזדן, תוכנית מענק זרע CRTD, SFB 655, ואת E.V ProRetina. קרן, תוכנית הבוגרים DIGS-BB דרזדן, ואת Fundação para a Ciência e Tecnologia (SFRH / BD / 60787/2009)

שימוש אתי וטיפול בבעלי חיים הצהרה:
כל הניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם לחוקי האיחוד האירופי והחוקים הגרמניים (Tierschutzgesetz) ודבקו בהצהרת ARVO לשימוש בבעלי חיים במחקר עיניים וחזון. כל הניסויים בבעלי חיים אושרו על ידי ועדת האתיקה לבעלי חיים של TU דרזדן ואת לנדסדריקציה דרזדן (מספר אישור: 24D-9168.11-1/2008-33).
1. לפני תחילת ניתוק תאים ומיון תאים
<ol><li>תווית שלושה צינורות תגובה 15 מ"ל עם: לשטוף (W), שבר חיובי (+) ושבר שלילי (-).</li>
</ol>2. דיסוציאציה של רשתית
<ol><li>ערפו את ראשם של גורי PN 4 בעזרת מספריים.</li>
	<li>לשטוף את הראש של הגורים זמן קצר 70% אתנול ואחריו כביסה PBS.</li>
	<li>מעבירים את הראש ל- HBSS קר ומעבירים את העין (חזרו על שלב זה לכל הראשים). כדי להסתגר, לפתוח את העפעפיים ולקבע את העין עם מלקחיים מעוגלים באזור עצב הראייה. ואז למשוך את העין בזהירות מחוץ למסלול.</li>
	<li>לאחר קיזוז כל העיניים, לבודד את הרשתית: להציג מספריים סגורים לתוך עצב הראייה ולפתוח את הלהבים. Peal RPE / chorid החוצה. הסר את העדשות וכלי הדם באמצעות מלקחיים מעוגלים.</li>
	<li>מעבירים את הרשתית המבודדת לצינור תגובה של 1.5 מ"ל המכיל את פתרון הפפאין (המסופק על ידי ערכת ניתוק הפפאין).</li>
	<li>דגירה הרשתיות בתמיסת פפאין במשך 30-60 דקות באמבט מים או שייקר (400 סל"ד) ב 37 מעלות צלזיוס.<ol>
<li>בעוד רטינות דגירה בתמיסת פפאין, פיפטה 1 מ"ל של פתרון ovomucoid צינור תגובה 15 מיליליטר (תווית "1").</li>
			<li>הוסף 60 μl של DNase I (10 מ"ג / מ"ל) + 60 μl של פתרון ovomucoid (מסופק על ידי הערכה) + 520 μl של EBSS לצינור תגובה 15 מ"ל (תווית "2").</li>
		</ol>
</li>
	<li>לאחר דגירה פפאין, להעביר את פתרון פפאין המכיל את הרשתית מתעכל חלקית צינור תגובה "2".</li>
	<li>באמצעות פיפטה מלוטשת אש, לבצע ניתוק מכני (10x למעלה ולמטה).</li>
	<li>פיפטה השעיית תא יחיד לצינור תגובה "1". נסה ליצור 2 שכבות על ידי שכבות בעדינות את המתלה התא על גבי הפתרון ovomucoid.</li>
	<li>צנטריפוגה למשך 5 דקות ב-300 x גרם (כ-1,300 סל"ד).</li>
	<li>השלך את supernatant ו resuspend התאים ב 500 μl של מאגר MACS.</li>
</ol>3. מיון תאים באמצעות מיון תאים משויך מגנטי (MACS)
<ol><li>הוסף נוגדן נגד CD73 עכברוש X μl ל 500 μl על מנת להשיג ריכוז סופי של 10 מיקרוגרם / מיליליטר.</li>
	<li>דגירה 5 דקות על קרח.</li>
	<li>מלאו את צינור התגובה של 15 מ"ל ל-10 מ"ל עם חיץ MACS וצנטריפוגה למשך 5 דקות במהירות של 300 x גרם.</li>
	<li>הסר את העל-טבעי.</li>
	<li>Resuspend גלולה ב 480 μl MACS חוצץ ולהוסיף 120 μl של עז נגד חולדה IgG microbeads.</li>
	<li>דגירה 15 דקות על קרח; אין להתסיס, לנער או לערבב אותו.</li>
	<li>מלאו את צינור התגובה של 15 מ"ל ל-5 מ"ל עם חיץ MACS וצנטריפוגה למשך 5 דקות ב-300 x גרם.</li>
	<li>כמו צינור התגובה הוא צנטריפוגה:<ol>
<li>כוונן עמודת LS לתוך המעמד המגנטי.</li>
			<li>הצב את מסנן קדם-השילוח מעל עמודת ה- LS.</li>
			<li>לחות את מסנן preseparation ואת עמודת LS עם 3 מיליליטר MACS מאגר ולאסוף את מאגר MACS לתוך הצינור לשטוף (W).</li>
		</ol>
</li>
	<li>הסר את העל-טבעי.</li>
	<li>Resuspend גלולה ב 500 μl MACS מאגר.</li>
	<li>לטעון את השעיית התא 500 μl למסנן, ולאחר מכן להוסיף 1 מיליליטר MACS מאגר למסנן ולאסוף את השבר השלילי לתוך צינור התגובה שבר שלילי (-).</li>
	<li>לאחר מכן, הוסף 3 x 3 מ"ל של מאגר MACS לעמודה כדי לשטוף את התאים שאינם מאוגדים לעמודה</li>
	<li>לאחר אלה 9 מיליליטר הם דרך עמודת LS, להסיר את העמודה מן המעמד המגנטי ולהתקין אותו על גבי צינור התגובה שבר חיובי (+).</li>
	<li>טען במהירות 5 מ"ל של מאגר MACS בעמודת ה- LS והצב את הכוכנה בעמודת LS והקש עליה כלפי מטה עד שהמאגר כולו יעבור דרך העמודה.</li>
	<li>צנטריפוגה צינור התגובה המכיל את השבר החיובי במשך 5 דקות ב 300 x g.</li>
	<li>הסר את supernatant, resuspend ב 500 μl של מאגר MACS ולשמור על 4 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>ספור את הכמות הכוללת של תאים באמצעות התקן נפוץ לספירת תאים.</li>
	<li>הכנת השעיית תא מהשבר הממוין החיובי המכיל 2 x 105 תאים/μl במאגר MACS ולשמור על 4 °C (70 °F)</li>
</ol>4. השתלה של MAC ממוין פוטורצפטור קודמן תאים לתוך הרשתית של העכבר
<ol><li>הקפד לקבל את כל הפתרונות הבאים מוכנים: 1 מיליליטר סטרילי PBS או HBSS, 10 μl DNAse I, 1-2 מיליליטר סטרילי deionized H2O, aliquots של שברי השעיית התא ב 4 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>הרדמה של העכבר הבוגר(כלומר 2-4 חודשים) עם הזרקה תוך-אישית של medetomidine הידרוכלוריד (0.01 מ"ג /10 גרם משקל גוף), קטמין (0.75 מ"ג / 10 גרם משקל גוף). לאחר מכן לעשות זריקה תת עורית של Buprenorphine (0.05 מ"ג / קילוגרם משקל גוף) להקלה על הכאב.</li>
	<li>תרחיב את התלמידים עם ירידה של פנילפרין 2.5%-טרופיקמיד 0.5%.</li>
	<li>תקן את העכבר במחזיק ראש העכבר והנח תחת מיקרוסקופ סטריאו.</li>
	<li>החל טיפה של ג'ל Visidic כדי למנוע ייבוש של העין.</li>
	<li>לעשות חור קטן בגבול בין סקלרה וקרנית (בהתאמה אורה serrata)באמצעות סטרילי 30 G 1/2 במחט.</li>
	<li>חותכים שקופית כיסוי משותפת לחתיכות קטנות (כ-5 מ"מ x 5 מ"מ) באמצעות עט יהלום, מניחים את אחת החתיכות האלה על גבי הקרנית, ומאפשרים הדמיה ישירה של הרשתית.</li>
	<li>לשטוף את מזרק microliter מעוקר מספר פעמים עם מים deionized.</li>
	<li>לטעון את מזרק microliter עם 1 μl של השעיית התא, מחט ישירה משיקת דרך הלחמית וסקלרה ומניחים תחת שליטה חזותית במחצית האף של הרשתית.</li>
	<li>אגרוף בעדינות חור לתוך הרשתית עד להגיע לחלל subretinal, להזריק את המתלה התא לתוך החלל subretinal.</li>
	<li>שימו לב לניתוק השוורי של הרשתית, שאמורה להיות אחידה, המכסה כ -1/4 משטח הרשתית ללא דימום.</li>
	<li>משוך את המזרק בעדינות, אטמי חור הרשתית באופן אוטומטי.</li>
	<li>לשטוף את מזרק microliter מספר פעמים עם מים deionized.</li>
	<li>שחרר את העכבר ממחזיק הראש.</li>
	<li>הער את העכבר על ידי הזרקת אטיפמוזולה הידרוכלוריד להיפוך של אפקט הידרוכלוריד medetomidine.</li>
	<li>מניחים את העכבר לזמן התעוררות בתא כהה וחם (כ 25 °C (60 °F).</li>
	<li>ביומיים הבאים לאחר ההשתלה, Buprenorphine (0.05 מ"ג / קילוגרם של משקל גוף) צריך להינתן על ידי הזרקה תת עורית בבוקר ואחר הצהריים להקלה על הכאב.</li>
</ol>

<ol><li>Bartsch, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+cells+integrate+into+the+outer+nuclear+layer+and+differentiate+into+mature+photoreceptors+after+subretinal+transplantation+into+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Retinal cells integrate into the outer nuclear layer and differentiate into mature photoreceptors after subretinal transplantation into adult mice.</a> Exp. Eye Res. 86, 691-700 (2008).</li>
<li>MacLaren, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+repair+by+transplantation+of+photoreceptor+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Retinal repair by transplantation of photoreceptor precursors.</a> Nature. 444, 203-207 (2006).</li>
<li>Eberle, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outer+segment+formation+of+transplanted+photoreceptor+precursor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Outer segment formation of transplanted photoreceptor precursor cells.</a> PLoS One. 7, (2012).</li>
<li>Lakowski, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cone+and+rod+photoreceptor+transplantation+in+models+of+the+childhood+retinopathy+Leber+congenital+amaurosis+using+flow-sorted+Crx-positive+donor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mol.+Genet%22%5BJournal%5D)">Cone and rod photoreceptor transplantation in models of the childhood retinopathy Leber congenital amaurosis using flow-sorted Crx-positive donor cells.</a> Hum. Mol. Genet. 19, 4545-4559 (2010).</li>
<li>Barber, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repair+of+the+degenerate+retina+by+photoreceptor+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Repair of the degenerate retina by photoreceptor transplantation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 354-359 (2013).</li>
<li>Pearson, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restoration+of+vision+after+transplantation+of+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Restoration of vision after transplantation of photoreceptors.</a> Nature. , (2012).</li>
<li>Singh, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversal+of+end-stage+retinal+degeneration+and+restoration+of+visual+function+by+photoreceptor+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Reversal of end-stage retinal degeneration and restoration of visual function by photoreceptor transplantation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, (2013).</li>
<li>Eberle, D., Schubert, S., Postel, K., Corbeil, D., Ader, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+integration+of+transplanted+CD73-positive+photoreceptor+precursors+into+adult+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Increased integration of transplanted CD73-positive photoreceptor precursors into adult mouse retina.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52, 6462-6471 (2011).</li>
<li>Koso, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD73%2C+a+novel+cell+surface+antigen+that+characterizes+retinal+photoreceptor+precursor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">CD73, a novel cell surface antigen that characterizes retinal photoreceptor precursor cells.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 50, 5411-5418 (2009).</li>
<li>Lakowski, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+transplantation+of+photoreceptor+precursor+cells+selected+via+cell+surface+antigen+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Effective transplantation of photoreceptor precursor cells selected via cell surface antigen expression.</a> Stem Cells. 29, 1391-1404 (2011).</li>
<li>Akimoto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+of+GFP+to+newborn+rods+by+Nrl+promoter+and+temporal+expression+profiling+of+flow-sorted+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Targeting of GFP to newborn rods by Nrl promoter and temporal expression profiling of flow-sorted photoreceptors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 3890-3895 (2006).</li>
<li>Eiraku, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-organizing+optic-cup+morphogenesis+in+three-dimensional+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture.</a> Nature. 472, 51-56 (2011).</li>
<li>Nakano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-formation+of+optic+cups+and+storable+stratified+neural+retina+from+human+ESCs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs.</a> Cell Stem Cell. 10, 771-785 (2012).</li>
<li>Osakada, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+the+generation+of+rod+and+cone+photoreceptors+from+mouse%2C+monkey+and+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Toward the generation of rod and cone photoreceptors from mouse, monkey and human embryonic stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 26, 215-224 (2008).</li>
<li>Lee, M. Y., Lufkin, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+%26%2334%3BThree-step+MACS%26%2334%3B%3A+a+novel+strategy+for+isolating+rare+cell+populations+in+the+absence+of+known+cell+surface+markers+from+complex+animal+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+Tech%22%5BJournal%5D)">Development of the &#34;Three-step MACS&#34;: a novel strategy for isolating rare cell populations in the absence of known cell surface markers from complex animal tissue.</a> J. Biomol. Tech. 23, 69-77 (2012).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין אינטרסים כלכליים מתחרים.

השתלה תת-קרקעית של תאי מבשר פוטורצפטור מייצגת כלי אמין להשגת שילוב של תאים רגישים לאור אלה ברשתיות מארחות במספרים משמעותיים1,2. זה עשוי לאפשר הקמת טיפול בתא לטיפול במחלות ניווניות ברשתית בעתיד6. אוכלוסיית התורמים של תאים, מבודד כיום PN 4 רטינות, היא תערובת של סוגי תאים שונים, שממנו רק תאים מבשר photoreceptor לשלב לאחר הזרקת subretinal. באמצעות מיון MAC מבוסס CD73, ניתן להגדיל את שיעור הפוטורצפטורים בתוך המתלים של תאי התורם ל- ≈ 90% המאפשר שיעור אינטגרציה גבוה פי 3 בערך ברשתיות מארחות מסוג בר בהשוואה לאוכלוסיית התאים הלא...

חזון הוא אחד החושים העיקריים של בני האדם. פגיעה בתחושה זו ועיוורון הם אחת הסיבות העיקריות לנכות במדינות המתועשות. הסיבה העיקרית לליקוי ראייה או עיוורון היא ניוון רשתית, המאופיינת באובדן תאים פוטורצפטורים, שכן ניתן לראותה בניוון מקולרי, רטיניטיס פיגמנטוזה, ניוון חרוט-מוט ותנאים אחרים. נכון להיום, טיפול יעיל כדי לשחזר את הראייה שאבדו אינו זמין. בשנים 2006 ו -2008 שתי מעבדות שונות דיווחו, ללא תלות זו בזו, השתלה מוצלחת של תאי מבשר פוטורצפטור מוט לעכברים מסוג פראי בוגר רשתית1,2. לכן, הנובעים האפשרות של השתלת תא מבשר photoreceptor גם לתוך רשתית מנוונת, להחליף פוטורצפטורים מנוונים ולשחזר את הראייה. אכן, הוכח לאחרונה, כי תאים מבשר פוטורצפטור מושתלים כאלה מעוררים קריטריונים מורפולוגיים של קולטני פוטורצפטורים מסוג פראי בוגרים, כגון מקטעים החיצוניים שפותחו כראוי3, מסופים סינפטיים בסמיכות לתאים דו קוטביים אנדוגניים וגוף תא עגול הממוקם בשכבה הגרעינית החיצונית2-4, כמו גם את היכולת להשתלב באופן פונקציונלי במעגלים העצביים המארחים5-7. אחד העקרונות העיקריים של אסטרטגיה זו הוא השימוש ביום שלאחר הלידה 4 (PN 4, PN0 מוגדר כיום לידה) רשתית עכברים צעירים, וכתוצאה מכך תערובת של סוגי תאים שונים להשתלה. על רקע יישום טיפולי בעתיד, תערובת זו צריכה להיות מטוהרת עבור תאים מבשר photoreceptor. CD73 תוארה כסמן פני התא הראשון הספציפי עבור פוטורצפטורים צעירים ברשתית8-10. כאן, אנו מדגימים שיטת טיהור תאים מבשר פוטורצפטור המבוססת על סמן משטח תא זה ועם השימוש בטכניקת מיון התאים המגנטיים (MACS). ל- MACS עשויים להיות יתרונות בהשוואה לטכניקות מיון תאים המופעלות על-ידי פלואורסצנט, עקב זמני מיון מהירים והתאמה קלה יותר לתנאי GMP. אנחנו יכולים להדגים העשרה של ~ 90% ושיעור אינטגרציה גבוה פי 3 בעת השתלת האוכלוסייה המועשרת לחלל התת-קרקעי ברשתיות מסוג בר למבוגרים. לכן, MACS מבוססי photoreceptor הקדמה העשרת תאים השתלה subretinal, הם טכניקות אמינות ומבטיחות לפיתוח אסטרטגיה טיפולית רגנרטיבית לטיפול ניוון רשתית.

<table><tbody><tr><td>מערכת דיסוציאציה פפאין</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>LK003150</td><td>סיפקה DNase I אינו משמש בשיטה</td></tr><tr><td>עכברוש מטוהר נגד עכבר CD73, שיבוט TY/23</td><td>BD Pharmingen</td><td>550738</td><td>ריכוז מלאי 0.5 מ"ג/מ"ל</td></tr><tr><td>עז נגד חולדות IgG MicroBeads</td><td>Miltenyi</td><td>130-048-501</td><td>נפח כולל של 2 מ"ל</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010-015</td><td>משמש לספירת המספר הכולל של התאים</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma</td><td>D5025-150KU</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco</td><td></td><td>14025050 משמש לדיסוציאציה של הרשתית</td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>Sigma</td><td>Fluka93595</td><td>משמש לספירת המספר הכולל של התאים</td></tr><tr><td>Vidisic</td><td>Dr. Mann Pharma / Andreae-Noris Zahn AG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Domitor</td><td>Pfizer</td><td>76579</td><td></td></tr><tr><td>קטמין 10%</td> <td>רציופארם</td><td>7538843</td><td></td></tr><tr><td>אנטיסדאן</td><td>פייזר</td><td>76590</td><td></td></tr><tr><td>פנילפרין 2.5%-טרופיקמיד 0.5%</td> <td>מרפאות אוניברסיטאיות דרזדן בית מרקחת</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מסנני הפרדה</td><td>Miltenyi</td><td>130-041-407</td><td></td></tr><tr><td>LS עמודות</td><td>Miltenyi</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>MACS MultiStand</td><td>Miltenyi</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>מפריד QuadroMACS</td><td>Miltenyi</td><td>130-090-976</td><td></td></tr><tr><td>זכוכית פולנית אש פסטר פיפטה</td><td>מותג</td><td>74777 20</td><td>הפיפטה' הטיפים צריכים להיות מלוטשים באש ולבצע חיטוי.</td></tr><tr><td>מתלה צינורות MACS 15 מ"ל</td><td>Miltenyi</td><td>130-091-052</td><td></td></tr><tr><td>תא ספירת תאים</td><td>Carl Roth</td><td>T728.1</td><td></td></tr><tr><td>צינורות סטריליים 15 מ"ל</td><td>Greiner Bio-One</td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>Leica M651 MSD</td><td>Leica</td><td>M651 MSD</td><td>ניתן להשתמש במקום Olympus SZX10</td></tr><tr><td>Olympus SZX10 Olympus SZX10 Olympus SZX10</td><td>ניתן</td><td></td><td>להשתמש במקום Leica M651 MSD</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ סטריאו הפוך אולימפוס CKX41</td><td>אולימפוס</td><td>CKX41</td><td></td></tr><tr><td>קולט אדים לתרבית תאים Thermo Scientific MSC-Advance</td><td>Thermo Scientific</td><td>51025411</td><td></td></tr><tr><td>1.5 מ"ל צינור תגובה</td><td>Sarstedt</td><td>727706400</td><td></td></tr><tr><td>2 מ"ל צינור תגובה</td><td>Sarstedt</td><td>72695</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה אפנדורף 5702</td><td>VWR (Eppendorf)</td><td>521-0733</td><td></td></tr><tr><td>מחזיק ראש עכבר</td><td>myNeurolab</td><td>471030</td><td></td></tr><tr><td>BD Microlance 3 30 G 1/2 in</td><td>BD Pharmingen</td><td>304000</td><td></td></tr><tr><td>מזרק מיקרוליטר המילטון 5 ומיקרו; l, 75RN</td><td>המילטון</td><td>065-7634-01</td><td>נמסר ללא מחטים</td></tr><tr><td>המילטון RN מחט מיוחדת 34 G</td><td>המילטון</td><td>065-207434</td><td>קהה, אורך 12 מ"מ</td></tr><tr><td>Vannas-T&uuml; מספריים קפיציים של bingen - 5 מ"מ להבים ישרים</td><td>כלי מדע עדינים</td><td>15003-08</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #7 מלקחיים - טיטניום ביולוגי</td><td>Fine Science Tools</td><td>11272-40</td><td></td></tr><tr><td>עט יהלום</td><td>Tools-tech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 מ"מ x 15 מ"מ כיסוי מחליק</td><td>ניצוצות</td><td>MIC3366</td><td></td></tr></tbody></table>

השתלת subretinal של macs מטוהרים פוטורצפטור קודמן תאים לתוך הרשתית עכבר בוגר

Subretinal Transplantation of MACS Purified Photoreceptor Precursor Cells into the Adult Mouse Retina

ליקוי ראייה ועיוורון עקב אובדן תאי חישת האור של הרשתית, כלומר פוטורצפטורים, מייצגים את הסיבה העיקרית לנכות במדינות המתועשות. החלפת פוטורצפטורים מנוון על ידי השתלת תאים מייצגת אפשרות טיפול אפשרית ביישומים קליניים עתידיים. ואכן, מחקרים פרה-קליניים אחרונים הראו כי פוטורצפטורים לא בוגרים, מבודדים מהרשתית של עכבר יילודים ביום 4 שלאחר הלידה, יש פוטנציאל להשתלב ברשתית העכבר הבוגרת לאחר השתלת תת-רשתית. תאים תורמים יצרו מורפולוגיה פוטורצפטורית בוגרת הכוללת מקטעים פנימיים וחיצוניים, גוף תא עגול הממוקם בשכבה הגרעינית החיצונית, ומסופים סינפטיים בסמיכות לתאים דו קוטביים אנדוגניים. ואכן, דיווחים אחרונים הראו כי פוטורצפטורים תורמים משתלבים באופן פונקציונלי במעגלים העצביים של עכברים מארחים. עבור יישום קליני עתידי של גישה כזו החלפת תאים, השעיות מטוהרות של התאים של בחירה צריך להיווצר ולהציב בעמדה הנכונה עבור שילוב תקין לתוך העין. להעשרה של מבשרי פוטורצפטור, המיון צריך להיות מבוסס על אנטיגנים ספציפיים משטח התא כדי למנוע שינוי כתב גנטי של תאים תורמים. כאן אנו מראים מיון תאים הקשורים מגנטית (MACS) - העשרה של מבשרי מוט מושתל photoreceptor מבודד מן הרשתית יילודים של עכברי כתב ספציפי photoreceptor מבוסס על סמן פני התא CD73. דגירה עם נוגדנים נגד CD73 ואחריו נוגדנים משניים מצומדים מיקרו חרוזים אפשרו העשרה של מבשרי פוטורצפטור מוט על ידי MACS לכ -90%. בהשוואה cytometry זרימה, MACS יש את היתרון כי זה יכול להיות קל יותר להחיל על תקני GMP וכי כמויות גבוהות של תאים ניתן למיין בתקופות זמן קצר יחסית. הזרקת השעיות תאים מועשרות לחלל התת-קרקעי של עכברים בוגרים מסוג פראי הביאה לשיעור אינטגרציה גבוה פי 3 בהשוואה למתלי תאים לא ממוינים.

על מנת להעריך את היכולת של רוד photoreceptors להשתלב ברשתית העכבר, קו כתב העכבר שימש, שבו GFP מונע על ידי רוכסן רשתית עצבית (Nrl, Nrl-GFP) מקדם11. Nrl הוא הסמן המוקדם ביותר של פוטורצפטורים מוט מתחיל את הביטוי שלה ב E12.5 לאורך כל הבגרות, המאפשר תיוג ספציפי של תאים פוטורצפטור מוט התורם.
PN 4 גורי NRL-GFP נערפו והעיניים היו חדורים. לאחר מכן, הרשתית בודדה ונותקו בשיטה שתוארה לעיל. לאחר מכן מוין השעיית התא שנוצרה באמצעות MACS מבוסס CD73 (איורים 1 ו- 2)....

השתלת תאים מייצגת אסטרטגיה לטיפול ניוון רשתית המאופיינת על ידי אובדן פוטורצפטור. כאן אנו מתארים שיטה להעשרת פוטורצפטורים הניתנים להשתלה והשתלתם התת-קרקעית בעכברים בוגרים.

השתלת Subretinal של MACS מטוהרים פוטורצפטור קודמן תאים לתוך הרשתית עכבר בוגר

Vision impairment and blindness due to the loss of the light-sensing cells of the retina, i.e. photoreceptors, represents the main reason for disability ...

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא להשתיל תאי אב מועשרים של פוטו-רספטורים (קולטני אור) לרשתית של עכבר מקבל. דבר זה מושג תחילה על ידי בידוד רשתית העין של חיות תורמות צעירות. בשלב השני, תאי האב של הפוטו-רספטורים postnatal מבודלים מאוכלוסיית תאי הרשתית באמצעות מיון תאים מגנטי המבוסס על CD 73.בשלב הבא, מושתלים קדמי-הפוטורצפטורים אל החלל הסוב-רטינלי של בעלי החיים המקבלים כדי להקל על שילובם ברשתית המקבלת. בסופו של דבר, ניתן לנתח את פוטנציאל השילוב וההתנהגות של תאי קדמי-הפוטורצפטורים המושתלים באמצעות מיקרוסקופיית אימונופלורסצנציה. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום הרגנרציה של הרשתית, כגון מהי יכולתם של פוטורצפטורים מושתלים להשתלב במעגלים העצביים של המארח לצורך שחזור הראייה.ההשלכות של טכניקה זו חורגות מעבר לטיפול במחלות ניווניות של הרשתית. ברגע שההשתלה וההעשרה של תאי קדם-פוטורצפטורים על ידי max יותאמו בקלות לתנאי GMP, הדגמה ויזואלית של שיטה זו תהיה קריטית. מכיוון ששלבי השתלה קשים ללמידה, הטיפול העדין והמיקום של המחט בחלל התת-רשתי הם חיוניים להבטחת הצלחה מרבית ויכולת שחזור. כדי להפריד את הרשתית, התחל בשטיפה קצרה של ראשי גורי עכברים ביום postnatal day four ב-70% ethanol, ולאחר מכן בשטיפה עם PBS.לאחר מכן, העבירו את הראשים ל-HBSS קר כדי לבצע גרעין (nucleate) לכל אחת מהעיניים. ראשית, פתחו את העפעף. לאחר מכן, השתמשו בצבת מעוקלת.אחזו באיבר באזור העצב האופטי ומשכו בזהירות את העין מתוך מחלול העין. לאחר מכן, כדי לבודד את הרשתית, הכניסו את קצותיהן של מספריים סגורים אל תוך העצב האופטי ופתחו את הלהבים. קלפו החוצה את אפיתל הפיגמנט של הרשתית ואת הכורויה, והשתמשו בפינצטה מעוקלת כדי להסיר את העדשה ואת כלי הדם.דגרו את הרשתיות המבודדות בתוך מבחנה לתגובה של 1.5 מיליליטר המכילה תמיסת פאפאין למשך 30 עד 60 דקות בשייקר במהירות של 400 RPM ובטמפרטורה של 37 degrees Celsius. בזמן דגירת הרשתיות, העבירו מיליליטר אחד של תמיסת OVO moid למבחנה לתגובה של 15 מיליליטר המסומנת כ-"one", ולאחר מכן למבחנה לתגובה של 2 מיליליטר המסומנת כ-"two" העבירו 60 microliters של DNAs one, 60 microliters של תמיסת OVO MOID ו-520 microliters של EBSS. לאחר הדגירה, העבירו את תמיסת הפאפאין המכילה את הרשתיות שעברו עיכול חלקי למבחנה לתגובה מספר שתיים, ולאחר מכן בצעו טריטורציה של הרשתיות 10 פעמים באמצעות פ pipette שעברה ליטוש באש.שכבו בעדינות את תרחיף התאים הבודדים מעל תמיסת ה-OVO MOID במבחנת תגובה אחת, וסובבו את תמיסת התאים בצנטריפוגה למשך חמש דקות ב-300 Gs ובטמפרטורת החדר. לאחר מכן, השליכו את העלייה (supernatant) ותלה את התאים מחדש ב-500 microliters של max buffer. כדי לבצע מיון לפי max, דגרו תחילה את התאים ב-10 micrograms per milliliter של נוגדן rat anti CD 73 על קרח.לאחר חמש דקות, שטפו את התאים ב-10 milliliters של max buffer. לאחר מכן, השעיו מחדש את המשקע ב-480 microliters של max buffer, והדגירו את התאים ב-120 microliters של go anti RET IgG microbeads על קרח ללא רעידה, ניעור או ערבוב. לאחר 15 דקות, שטפו את התאים ב-five milliliters של max buffer; במהלך השטיפה, הניחו עמודת LS על max magnet והניחו מסנן הפרדה מוקדמת (pres separation filter) בחלק העליון של העמודה.בשלב הבא, יש להספיג את המסנן ואת העמודה בשלושה מיליליטר של max buffer. את הבופר יש לאסוף למבחנה של 15 מיליליטר המסומנת ב-W עבור שטיפה (wash). בסיום סבוב התאים במצב צנטריפוגה, יש להחזיר את המשקע לתליה ב-500 microliters של max buffer ולהעביר את התאים למסנן.הוסיפו 1 mL של max buffer מעל התאים, ולאחר מכן אספו את הפרקציה השלילית למבחנה תגובה של 15 mL המסומנת ב-minus עבור שלילי. לאחר מכן, הוסיפו 3 mL של max buffer לעמודה שלוש פעמים כדי לשטוף אותה. כעת הסירו את העמודה מהמעמד המגנטי.התקינו אותה מעל מבחנת תגובה של 15 milliliter המסומנת ב-plus עבור חיובי. טענו במהירות 5 milliliter של max buffer לתוך העמודה. העבירו את כל הבאפר דרך העמודה, ולאחר סבב צנטריפוגה להורדת הפרקציה החיובית, השביו את המשקע ב-500 microliters של max buffer.הנח את התאים בטמפרטורה של 4 °C וספור אותם. לאחר מכן, כוונן את הריכוז ל-2 × 10⁵ תאים ל-µL ב-max buffer, תוך שמירה על התאים בטמפרטורה של 4 °C. לצורך השתלה של תאי קדמון הפוטורצפטורים המבודדים, הרחב את האישונים של עכבר בוגר תחת הרדמה באמצעות טיפה של phenyl epinephrine בעוד האישונים מתרחבים. השתמש בעט יהלום כדי לחתוך זכוכית כיסוי לחתיכות של כ-5 × 5 מ"מ.הנח את העכבר תחת מיקרוסקופ סטריאו, קבע את בעל החיים במחזיק ראש לעכברים, ולאחר מכן מרח טיפה של ג'ל ICIC על כל עין כדי למנוע התייבשות. כעת, השתמש במחט במידה 30 gauge ובאורך חצי אינץ' כדי ליצור חור קטן בגבול שבין הלובן (sclera) לקרנית (cornea). לאחר מכן, הנח את אחת זכוכיות הכיסוי בגודל חמישה על חמישה מילימטרים מעל הקרנית, כדי לאפשר ויזואליזציה ישירה של הרשתית.בשלב הבא, שטפו מספר פעמים מזרק מיקרוליטר שעקר מראש במים דיוניים סטריליים, ולאחר מכן מלאו את המזרק באחת מתרחיפי התאים הממוינים. החדירו את המחט באלכסון דרך הקונג'וקטיבה והסקלרה, ומיקמו אותה בחצי הנחרי של הרשתית. לאחר מכן, נקבו בעדינות חור דרך הרשתית אל החלל התת-רשתי והזריקו את התאים.יש לוודא את ההיפרדות הבולוזית (שלפוחית) והאחידה של הרשתית, אשר צריכה לכסות כרבע משטח הרשתית ללא כל דימום. לאחר מכן, יש למשוך את המזרק בעדינות ולשטוף אותו מספר פעמים נוספות עם המים המיוננים. לבסוף, יש לשחרר את העכבר מהמכשור למניעת תנועה.הזריקו לבעל החיים aamaz oil hydrochloride כדי להפוך את השפעות ההרדמה ואפשרו לו להתאושש בתא חשוך בטמפרטורה של 25 degrees Celsius, וזאת כדי להעריך את יכולתם של פוטורצפטורים מסוג rod להשתלב ברשתית העכבר. נעשה שימוש בקו עכברים רפורטר שבו GFP מובע תחת ה-promoter של neural retina losing zipper או NRL, כפי שמוצג בהיסטוגרמות אלו. תרחיף תאי הרשתית הראשוני הכיל 30.4% פוטורצפטורים מסוג rod חיוביים ל-GFP.בעקבות מיון max מבוסס CD 73, נצפתה העשרה של עד 86.9% של תאי קדמוני פוטורספטורים חיוביים ל-GFP בפרקציה החיובית ל-CD 73. בפרקציה השלילית ל-CD 73, רק 9.9% מהתאים היו חיוביים ל-GFP. כמו כן, נצפתה העשרה של תאים חיוביים ל-N-R-L-G-F-P בעקבות מיון max מבוסס CD 73.לאחר הזריעה in vitro, תאי התור נשארים באתר ההזרקה כפי שהוגדר על ידי הרשתית המופרדת בבועה של המאכסן, ומשתלבים בשכבה הגרעינית החיצונית של רשתית המאכסן תוך רכישת המורפולוגיה של פוטורצפטורים בוגרים. ברגע שבוצע מיון תאים מגנטי (master magnetic associated cell sorting) כראוי, ניתן לבצעו בתוך שעתיים. ניתן להתאים הליך זה גם להעשרה של פוטורצפטורים המופקים מתאי גזע או אפילו לתאי גזע רשתיים אחרים.בהינתן הזמינות של נוגדנים ספציפיים למתן תשובות לשאלות נוספות בנוגע לשיקום או הצלה באמצעות טרנסמוטציה תאית של הרשתית, לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה מעמיקה לגבי אופן השתלת תאי קדם של פטורצפטורים המועשרים ב-Photo max למרחב הסוב-רטינלי של עכברים מקבלים.

subretinal-transplantation-macs-purified-photoreceptor-precursor

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

כאן אנו מציגים פרוטוקול מקובל על הקהילה בפורמט מולטימדיה להזרקה תת-רשתית של תאי RPE בחולדות ועכברים. גישה זו יכולה לשמש לקביעת פוטנציאל הצלה, פרופילי בטיחות ויכולות הישרדות של תאי RPE מושתלים עם השתלה במודלים של ניוון רשתית בבעלי חיים.

ביצוע subretinal זריקות במכרסמים כדי לספק תאי הרשתית פיגמנט האפיתל בהשעיה

אפיתל הפיגמנט ברשתית (RPE) אסטרטגיות החלפה וטיפול מבוססי גנים נחשבים במשך כמה תנאים ניווניות ברשתית. לתרגום קליני, במודלים של בעלי חי עין גדולים נדרשים ללמוד טכניקות ניתוחיות בחולים ישימות. כאן אנו מציגים מודל ארנב לניתוח subretinal המיועד השתלת רשתית, אשר היא תכליתי וחסכוני.

צעד אחר פרוטוקול שלב לכירורגיה subretinal בארנבונים

הזרקת subretinal הוחל נרחב במחקרים פרה של טיפול בתאי גזע חלופי עבור ניוון מקולרי הקשור לגיל. במאמר זה דמיינו, נתאר טכניקה הזרקת subretinal פחות מסוכן, הדירים בדיוק ששונתה באמצעות הגישה הטרנס-scleral להעביר תאים לתוך עיניו חולדה.

פיתוחו של פרוטוקול מעודן עבור השתלת Subretinal טרנס-scleral של תאי אפיתל הפיגמנט ברשתית האנושי בעיניים עכברוש

תאים אפיתל הפיגמנט ברשתית יכול לשמש כטיפול חלופי תא עבור הטופס מתקדם של ניוון מקולרי הקשור לגיל יבש. פרוטוקול זה מתאר את הדור של מודל גדול-עיניים של אטרופיה גיאוגרפית והשתלות את subretinal של תאי אפיתל כנגד האדם מתחלקים נגזר תאי הפיגמנט ברשתית לתוך מודל זה של המחלה.

השתלת subretinal של תאי גזע עובריים אנושיים לתאי האפיתל של פיגמנט הרשתית נגזר למודל גדול-עיניים של אטרופיה גיאוגרפית

מוצגת כאן טכניקה כירורגית להשתלת רקמת רשתית שמקורה בתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hPSC) בחלל התת-רשתית של מודל בעל חיים גדול.

השתלה תת-רשתית של רקמת רשתית שמקורה בתאי גזע עובריים אנושיים במודל של בעלי חיים גדולים אצל חתולים

הפרימט הלא אנושי (NHP) הוא מודל אידיאלי לחקר טיפולי תאי רשתית אנושית בשל הדמיון האנטומי והגנטי. כתב יד זה מתאר שיטה להשתלה תת-עינית של תאי אפיתל פיגמנט רשתית בעין NHP ואסטרטגיות למניעת סיבוכים תוך ניתוחיים הקשורים למניפולציה מקולרית.

השתלת אפיתל פיגמנט רשתית במודל פרימטים לא אנושי למחלות רשתית ניוונית

פרוטוקול זה מציג גישה טרנס-סקלרלית מונחית ראייה טרנס-אישונים להעברה בטוחה ומדויקת של שתלים תאיים תת-רשתית, עם שיעור נמוך של סיבוכים כירורגיים, במושתלי עכבר עם או בלי ניוון רשתית.

השתלה טרנס-סקלרלית מונחית אישונים של שתלים תת-רשתית במודל עכבר ניוון רשתית

אנו מתארים פרוטוקול מפורט להכנת תאי אב קולטי אור שמקורם בתאי גזע עובריים עובריים (photoreceptor) שמקורם בהקפאה, ואת ההעברה התת-רשתית של תאים אלה בעכברי RD10 .

העברה תת-רשתית של אבות פוטורצפטור שמקורם בתאי גזע עובריים אנושיים בעכברי RD10

במודל עכבר של בתוך הרחם השתלה

טכניקה ניתוחית זו ממחישה את הזריקה של וקטורים בריפוי גנטי ותאי גזע לתוך חלל subretinal של עין העכבר.

הזרקת subretinal של וקטורי ריפוי גנטי ותאי גזע לעיניים המאוסות

למדו שיטת השתלת תאי קדם-פוטורצפטורים מטוהרים לרשתית עכבר בוגר באמצעות מיון תאים מגנטי CD73. שיטה זו מאפשרת חקר אינטגרציה תאית ופוטנציאל שיקום ראייה ברפואה רגנרטיבית.

השתלת Subretinal של MACS מטוהרים פוטורצפטור קודמן תאים לתוך הרשתית עכבר בוגר

גלה סרטונים נוספים