ניתוח כמותי ואפיון של נגעים טרשת עורקים בסינוס אבי העורקים של העכברים
7 בדצמבר 2013
אנו מתארים הליכים לכימות ואפיון נגעים טרשת עורקים במודלים של עכברים באמצעות חתך מדויק של סינוס אבי העורקים ואבי העורקים העולה בשילוב עם ניתוח היסטוכימי ואימונוהיסטוכימי.
המטרה הכללית של הליך זה היא לאפיין ולכמת נגעים טרשוזיים בסינוס האאורטלי של ה-MI. מטרה זו מושגת תחילה על ידי נתיחה של לב שהוצא, כדי להפריד את החלק האפיקלי ולאתר את הסינוס האאורטלי. לאחר מכן, מוכנים בלוקי פאראפין עם החלק האפיקלי המעובד של הלב.
לאחר מכן, הסינוס האאורטלי נחתך ומועבר למשקופיות. לבסוף, נזבחי הרקמה נצבעים. בסופו של דבר, ניתן להפיק תוצאות המראות גדלים והרכבים שונים של נגעים אתרוסקלרוטיים באמצעות אנליזה היסטוכימית ואימונוהיסטוכימית.
את הפרוצדורה ידגים דניאל ונגה פנל, סטודנט לתואר שני מהמעבדה שלי. ועדת אתיקת המחקר בבעלי חיים של אוניברסיטת מקמסטר אישרה מראש את כל ההליכים המתוארים כאן; לאחר הרדמה של עכבר LDLR double negative ושאיבת דם, יש לבצע הריגה וקיבוע לפני בידוד הלב בהתאם לפרוטוקול הכתוב. השתמש בסכין מנתחים כדי לבצע חיתוך רוחבי של הלב, בניצב לאורטה העולה. הנח את החלק האפיקלי או העליון של הלב בקסטת הטמעה והטבל אותו בפורמלין.
לאחר מכן, הכניסו את הקסטה למעבד רקמות ובצעו עיבוד במהלך הלילה. בהתאם לתוכנית המפורטת בפרוטוקול הטקסט עבור תבניות ההיסטולוגיה, המיסו שעוות פראפין במהלך הלילה בטמפרטורה של 62 °C. מקמו כל רקמה שעובדה בתוך תבנית היסטולוגיה עמוקה, תוך וידוא שממשק הלב נוגע בתחתית התבנית, ולאחר מכן מזגו שעוות פראפין מומסת עד למילוי מלא של התבנית.
השתמשו בקסטה פלסטית מסומנת כדי לכסות את התבנית. לאחר קירור התבניות על קרח או על משטח קר, הפרידו את הבלוק מהתבנית כדי לבצע חיתוכים של האורטה. מקמו את הבלוק במחזיק הדגימות של המיקרוטום כך שניתן יהיה לחתוך אותו מהחלק הפנימי לכיוון החלק העליון של הלב.
כווננו את המיקרוטום ל-10 microns ובצעו חיתוך של הלב. אספו את החתכים על עלית זכוכית ובחנו אותם תחת מיקרוסקופ אור כדי לקבוע את המיקום והאוריינטציה. הסינוס אמור להיראות כשלושה בסיסי מסתמים דו-חלקיים עם עלונים צמודים.
כאשר אחד או שניים מהמסתמי הסינוס האורטלי הופכים גלויים, התאימו את זווית הבלוק לפי הצורך. עם ההגעה למסתמים, כווננו את המיקרוטום לחיתוך של 4 עד 5 מיקרון. הצמידו את 10 החתכים הראשונים, כל אחד בראשן של שקופיות זכוכית נפרדות, ולאחר מכן הצמידו כל קבוצה עוקבת של 10 חתכים במיקום הבא.
על השקופיות. המשיכו לאסוף חתכים עד שלא ייראו יותר נגעים אתרוסקלרוטיים. לצביעת החתכים ב-hematin ו-eosin לצורך ויזואליזציה של הנגעים, הכניסו את השקופיות למייבש אוויר למשך שמונה דקות.
לאחר מכן, בצעו דה-פראליזציה (deparaffinization) של החתכים על ידי שטיפה עם xylene ארבע פעמים למשך שלוש דקות בכל פעם. שטפו את השקופיות ב-100% ethanol שלוש פעמים למשך שלוש דקות בכל פעם. לאחר מכן, שטפו ב-70% ethanol וב-50% ethanol.
שלוש פעמים למשך שלוש דקות בכל פעם. השתמש במים מזוקקים כדי לשטוף את השקופיות ולאחר מכן טבול אותן ב-MA's hematin למשך 15 דקות.
שטוף תחת זרימה של מי ברז למשך חמש דקות. לאחר מכן, שטוף במים מזוקקים למשך חמש דקות לאחר טבילה ב-eoin Y למשך אחת עד חמש דקות.
שטוף במים מזוקקים שלוש פעמים למשך חמש דקות בכל פעם. שטוף ב-50% ethanol פעמיים למשך שתי דקות בכל פעם. לאחר מכן, שטוף ב-70% ethanol שלוש פעמים למשך שתי דקות בכל שטיפה, וב-100% ethanol.
שלוש פעמים למשך שתי דקות בכל פעם. לאחר מכן, שטפו וטבלו ב-xylene ארבע פעמים למשך שתי דקות בכל פעם. השתמשו בחומר הרכבה מבוסס xylene להרכבת הסרטים וצלמו תמונות תחת מיקרוסקופ אור.
השתמשו בתוכנת דימות כדי לזהות ולכמת נגעים, אותם ניתן לקבוע במרחקים ספציפיים מהסינוס האורטלי במרווחים של 40 עד 50 מיקרון, בהתאם לעובי החתכים; עיינו בפרוטוקול הטקסט עבור צביעה אימונוהיסטוכימית ואימונופלואורסצנציה. עכברים LDLR-positive בני חמישה שבועות הוכזנו בתזונה סטנדרטית או בתזונה עשירה בשומן למשך 10 שבועות לפני שhearts שלהם קובעו, בודדו ונחתכו כפי שמוצג כאן.
כאשר עכברים ניזונים מתזונה סטנדרטית (standard chow), התפתחות העקתורים היא מוגבלת מאוד ועשויה שלא להיות ניתנת לגילוי בגיל 15 שבועות. תזונה עשירה בשומן מאיצה משמעותית את התהליך האתרוגני במודל זה ומשרה היווצרות של נגעים מתקדמים וגדולים המכילים ליבות א-תאיות כרוניות וכיסויים סיביים. ניתן לאפיין את הנגעים האתרוסקלרוטיים באופן נוסף באמצעות צביעה לנוכחות של סוגי תאים וגורמים ספציפיים המגדירים את שלבי התפתחות הנגע.
חדירה של מונוציטים אל האינטימה מייצגת את אחד האירועים המוקדמים ביותר של האתרוגנזה באינטימה. מונוציטים מבדילים למקרופאגים הבולעים פסולת תאית וליפידים. מקרופאגים רוויים בליפידים, הידועים כתאי קצף, יוצרים פס ליפידי בדופן העורק כפי שניתן לראות כאן.
ניתן לזהות תאי קצף מאקרופאגיים בכל שלבי התפתחות הנגע על ידי צביעה בנוגדנים כנגד סממני מאקרופאג ספציפיים כגון F4/80 ו-MAC3. תאי שריר חלק וסקולריים (vSMCs) מוגבלים לשכבה המדיאלית של עורק בריא. תאי vSMCs מונעים להגר ולשכפל את עצמם באינטימה במהלך התפתחותו של נגע מתקדם.
כפי שניתן לראות בלוח זה, ניתן לזהות SMCs של ורידים באמצעות צביעה בנוגדן נגד alpha actin לאחר פיתוחה. טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום מחלות כלי הדם והלב לחקור את הפיתוח וההתקדמות של נגעי טריוסיקלרוזיס בחולדות.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מתאר פרוצדורות לכימות ואפיון של נגעי טרשת עורקים במודלים של עכברים. השיטות כוללות חיתוך מדויק של סינוס האורטה והאורטה העולה, ולאחריו ניתוח היסטוכימי ואימונוהיסטוכימי.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה קרדיווסקולרית
- היסטולוגיה
רקע
- טרשכת עורקים היא מחלה קרדיווסקולרית מרכזית.
- מודלים של עכברים משמשים באופן נפוץ לחקר נגעים טרשכתיים.
- טכניקות היסטוכימיות ואימונוהיסטוכימיות הן חיוניות לצורך הניתוח.
- הבנת מאפייני הנגעים יכולה לסייע בפיתוחים טיפוליים.
מטרת המחקר
- לאפיין נגעים של טרשת עורקים בסינוס האורטות.
- לכמת את גודלם והרכבם של הנגעים.
- להשתמש בטכניקות היסטולוגיות מתקדמות לצורך ניתוח מפורט.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- ניתוח של הלב שהוצא על מנת לאתר את הסינוס האאורטלי.
- הכנת בלוקים של פראפין מהלב שעבר עיבוד.
- חיתוך של הסינוס האאורטלי והצמדה לשקופיות.
- צביעה של חתיכות הרקמה לצורך ניתוח.
תוצאות עיקריות
- זוהו נגעים טרשתיים בגדלים שונים.
- נצפו שינויים בהרכב הנגעים באמצעות צביעה.
- ניתוח היסטוכימי ואימונוהיסטוכימי סיפק תובנות מפורטות.
- התוצאות יכולות להנחות מחקרים עתידיים על טרשת עורקים.
מסקנות
- השיטות המתוארות יעילות לחקר נגעים אתרוסקלרוטיים.
- אפיון של נגעים יכול לשפר את ההבנה של מחלות קרדיווסקולריות.
- ניתן ליישם טכניקות אלו במודלים אחרים של מחקר קרדיווסקולרי.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
ניתוח כמותי של נגעים במודלים של סינוס אבי העורקים בעכברים מאפשר הערכה קפדנית של התקדמות טרשת העורקים והשפעה טיפולית בשלבי גילוי מוקדמים ובשלבים פרה-קליניים. מדידה מדויקת של שטח ונפח הנגע, בשילוב עם אפיון תאי, תומכת בביטחון חיזוי באישור מטרה (target validation) ובצמצום סיכונים מכניסטיים עבור פורטפוליו של תרופות קרדיווסקולריות. זרימת עבודה זו מהווה בסיס לרצף תרגומי מביולוגיה של גילוי להערכה במודלים פרה-קליניים במחקר של טרשת עורקים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשרת בדיקה כמותית של היפותזות בנוגע למניעים מולקולריים במודלים של טרשת עורקים.
- תומך בתיקוף תפקודי של המטרה על ידי קורלציה בין מאפייני הנגע להתערבויות גנטיות או תזונתיות.
- מאפשר הפחתת סיכונים מכניסטית באמצעות פרופיל תאי והרכבי של נגעים.
- מספק נתונים מהימנים לצורך מיון פורטפוליו ולקבלת החלטות מוקדמות של המשך או הפסקת הפרויקט (go/no-go).
סריקה ופיתוח בדיקות (Assays)
- מגדיר נקודות סיום היסטולוגיות סטנדרטיות וניתנות לשחזור עבור סריקת תרכובות.
- מספק מדדי נגעים כמותיים המתאימים להשוואות בין קבוצות.
- מאפשר הערכה ניתנת להרחבה (scalable) של יעילות ההתערבות במערכות עכברים מתוקשחות.
- תומך במוכנות הבדיקה עבור סריקות פנוטיפיות או מכניסטיות בהמשך.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאימה פנוטיפים של נגעים בעכברים למאפיינים רלוונטיים למחלה בבני אדם לצורך פיתוח ביומרקרים תרגומיים.
- מבטיחה רציפות משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני על ידי מתן אפשרות לכימות עקבי של הנגעים.
- מספקת בסיס להחלטות קידום מותאמות סיכון המבוססות על נתונים כמותיים ותאיים של הנגעים.
- מספקת תובנות מנגנוניות התומכות בהפחתת סיכונים חזויה בקווי פיתוח קרדיווסקולריים.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת נתונים
שיטה זו לניתוח כמיותי של נגעים משולבת החל משלב הגילוי המוקדם, דרך זיהוי מולקולות מובילות ועד לתיקוף פרה-קליני במסלולי מחקר של מחלות קרדיווסקולריות.
- ביולוגיה של הגילוי: תומך בבדיקת היפותזות ובבירור מסלולים על ידי כימות התגובת של הנגעים למודולציה גנטית או תזונתית.
- סריקה: מספק נקודות סיום כמותיות הניתנות לשחזור להערכת התערבויות מועמדות.
- אנליטיקה: מאפשר השוואה סטטיסטית של שטח הנגע, נפחו וההרכב התאי בין קבוצות ניסוי.
- מחקר תרגומי: מקשר בין ממצאים במודל עכברים למאפייני מחלה בבני אדם באמצעות ניתוח תאי והרכבי של הנגעים.
- שימוש חוזר ארגוני: מציע זרימת עבודה סטנדרטית וניתנת להתאמה עבור מודלים מגוונים של טרשעורקים ומחקרי התערבות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזיוי ומפחית עמימות מכניסטית בתיקוף יעדים לטיפול באתרוסקלרוזיס.
- ערך תפעולי: מספק כימות נגעים סטנדרטי, הדיר וניתן להרחבה בין מחקרים שונים.
- ערך אסטרטגי: משפר את איכות קבלת ההחלטות לגבי המשך פיתוח (go/no-go) ואת יעילות ההון על ידי אספקת נתונים פרה-קליניים חסונים.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעוד עדיפויות וקידום של נכסים קרדיווסקולריים בהתאם לסיכון.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בניתוח של מערכת לב-דם בעכברים ובעיבוד היסטולוגי.
- דורש גישה לתשתיות מיקרוטומיה, צביעה והדמיה לצורך חיתוך ואנליזה הניתנים לשחזור.
- מצריך סטנדרטיזציה בין-צוותית של זוויות החיתוך ושל נקודות ציון אנטומיות לצורך השוואת נתונים.
- ניתן להתאים למגוון מודלים של טרשת עורקים המושרים תזונתית או גנטית באמצעות התאמות לפרוטוקול.
- תלוי בזיהוי מדויק ובכימות של הנגעים כדי להבטיח את שלמות הנתונים.
