ניתוח כמותי ואפיון של נגעים טרשת עורקים בסינוס אבי העורקים של העכברים
7 בדצמבר 2013
אנו מתארים הליכים לכימות ואפיון נגעים טרשת עורקים במודלים של עכברים באמצעות חתך מדויק של סינוס אבי העורקים ואבי העורקים העולה בשילוב עם ניתוח היסטוכימי ואימונוהיסטוכימי.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לאפיין ולכמת נגעים טרשת עורקים בסינוס אבי העורקים MI. זה מושג על ידי ניתוח לב שחולץ תחילה על מנת להפריד את החלק האפיקלי ולאתר את סינוס אבי העורקים. לאחר מכן מכינים קוביות פרפין עם החלק האפיקלי המעובד של הלב.
לאחר מכן חותכים את סינוס אבי העורקים ומורכבים על מגלשות. לבסוף, קטעי הרקמה מוכתמים. בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות המראות גדלים והרכבים שונים של נגעים טרשת עורקים באמצעות ניתוח היסטוכימי ואימונוהיסטוכימי.
מי שידגים את ההליך יהיה דניאל ונגה פנס, סטודנט לתואר שני מהמעבדה שלי. מועצת האתיקה למחקר בבעלי חיים של אוניברסיטת מקמאסטר אישרה מראש את כל ההליכים המתוארים כאן לאחר הרדמת עכבר LDLR שלילי כפול וחילוץ הדם המתת חסד ותיקון לפני בידוד הלב על פי פרוטוקול הטקסט, השתמש באזמל כדי לבצע חתך רוחבי בלב בניצב לאבי העורקים העולה. הניחו את החלק האפיקלי או העליון של הלב בקלטת הטמעה וטבלו אותה בפורמין.
לאחר מכן הכניסו את הקסטה למעבד טישו ועבדו למשך הלילה. באמצעות התוכנית המתוארת בפרוטוקול הטקסט של תבניות ההיסטולוגיה ממיסים שעוות פרפין למשך הלילה ב-62 מעלות צלזיוס. מניחים כל רקמת תהליך בתבנית היסטולוגית עמוקה, מוודאים שממשק הלב נוגע בבסיס התבנית, ולאחר מכן יוצקים שעוות פרפין מומסת למילוי מלא של התבנית.
השתמש בקלטת פלסטיק מסומנת כדי לכסות את התבנית. לאחר קירור התבניות על קרח או משטח קר, הפרד את הבלוק מהתבנית כדי לחתוך את אבי העורקים. מקם את הבלוק במחזיק הדגימה של המיקרוטום כך שניתן יהיה לחתוך אותו מבפנים לכיוון החלק העליון של הלב.
התאימו את המיקרוטום ל-10 מיקרון וחתכו את הלב. אסוף חלקים על שקופית זכוכית ובדוק תחת מיקרוסקופ אור כדי לקבוע מיקום וכיוון. הסינוס צריך להופיע כשלושה בסיסי שסתום דו-חלקיים עם עלונים מחוברים.
כאשר מתגלים שסתום אחד או שניים של סינוס אבי העורקים, התאם את זווית הבלוק לפי הצורך. כאשר מגיעים לשסתומים, כוונן את המיקרוטום כדי לחתוך אותו ארבעה עד חמישה מיקרון. הרכבת 10 החלקים הראשונים כל אחד בחלק העליון של שקופיות זכוכית בודדות, ולאחר מכן הרכבת כל קבוצה עוקבת של 10 חלקים במיקום הבא.
בשקופיות. המשך לאסוף חלקים עד שלא נצפה נגע טרשת עורקים. כדי להכתים קטעים עם המטין ואואין כדי לדמיין נגעים, הכניסו את השקופיות למייבש אוויר למשך שמונה דקות.
לאחר מכן חלק את החלקים על ידי שימוש בקסילן כדי לשטוף אותם ארבע פעמים במשך שלוש דקות כל אחד. שטפו את השקופיות ב-100% אתנול שלוש פעמים למשך שלוש דקות כל אחת. ואז 70% אתנול ו-50% אתנול.
שלוש פעמים למשך שלוש דקות כל אחת. השתמש במים מזוקקים כדי לשטוף את המגלשות ולאחר מכן לטבול אותן. המטין של MA למשך 15 דקות.
לשטוף ולרוץ. מי ברז למשך חמש דקות. לאחר מכן שטפו וזיקקו מים במשך חמש דקות לאחר הטבילה ב-eoin Y למשך דקה עד חמש דקות.
שטפו וזיקקו מים שלוש פעמים במשך חמש דקות כל אחת. 50% אתנול פעמיים למשך שתי דקות כל אחת. לאחר מכן 70% אתנול שלוש פעמים למשך שתי דקות כל שטיפה, ו-100% אתנול.
שלוש פעמים למשך שתי דקות כל אחת. לאחר מכן שוטפים וקסילן ארבע פעמים למשך שתי דקות כל אחת. השתמש במדיום הרכבה מבוסס קסילן כדי להרכיב את החלקים ולצלם תמונות תחת מיקרוסקופ אור.
השתמש בתוכנת הדמיה כדי לזהות ולכמת נגעים, אותם ניתן לקבוע במרחקים ספציפיים מהסינוס האאורטלי במרווחים של 40 עד 50 מיקרון, בהתאם לעובי החלקים, עיין בפרוטוקול הטקסט לצביעה אימונוהיסטוכימית ואימונופלואורסצנטית. LDLR בן חמישה שבועות. עכברים חיוביים הוזנו בתזונה סטנדרטית או בתזונה עתירת שומן במשך 10 שבועות לפני שליבם תוקן, בודד וחתך כפי שמוצג כאן.
כאשר עכברים ניזונים מתזונת צ'או סטנדרטית, התפתחות טרשת עורקים מוגבלת מאוד וייתכן שלא ניתן לזהות אותה בשבוע 15 של שמונה. תזונה עתירת שומן מאיצה משמעותית את האטרוגנזה במודל זה וגורמת להיווצרות נגעים מתקדמים גדולים המכילים ליבות א-תאיות כרוניות וכובעים סיביים. ניתן לאפיין נגעים טרשת עורקים עוד יותר על ידי צביעה לנוכחותם של סוגי תאים ספציפיים וגורמים המגדירים את שלבי התפתחות הנגע.
חדירת מונוציטים לתוך האינטימה מייצגת את אחד האירועים המוקדמים ביותר של אטרוגנזה אינטימה. מונוציטים מתמיינים למקרופאגים הבולעים פסולת תאית ושומנים. מקרופאגים גדושים בשומנים הידועים כתאי קצף יוצרים פס שומני בדופן העורק הנראה כאן.
ניתן לזהות תאי קצף מקרופאגים בכל שלבי התפתחות הנגע על ידי צביעה בנוגדנים כנגד סמני מקרופאגים ספציפיים כגון F 4 80 ו-MAC 3. תאי שריר חלק בכלי הדם או v SMCs מוגבלים לשכבה המדיאלית של עורק בריא. VSCs מושרים לנדוד ולהתרבות באינטימה במהלך התפתחות נגע מתקדם.
כפי שניתן לראות בפאנל זה, ניתן לזהות V SMCs על ידי צביעה עם נוגדן נגד אלפא אקטין לאחר התפתחותו. טכניקה זו שילמה את הדרך לחוקרים בתחום מחלות לב וכלי דם לחקור את ההתפתחות וההתקדמות של נגעים טרשת עורקים במוטות.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מתאר פרוצדורות לכימות ואפיון של נגעי טרשת עורקים במודלים של עכברים. השיטות כוללות חיתוך מדויק של סינוס האורטה והאורטה העולה, ולאחריו ניתוח היסטוכימי ואימונוהיסטוכימי.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה קרדיווסקולרית
- היסטולוגיה
רקע
- טרשכת עורקים היא מחלה קרדיווסקולרית מרכזית.
- מודלים של עכברים משמשים באופן נפוץ לחקר נגעים טרשכתיים.
- טכניקות היסטוכימיות ואימונוהיסטוכימיות הן חיוניות לצורך הניתוח.
- הבנת מאפייני הנגעים יכולה לסייע בפיתוחים טיפוליים.
מטרת המחקר
- לאפיין נגעים של טרשת עורקים בסינוס האורטות.
- לכמת את גודלם והרכבם של הנגעים.
- להשתמש בטכניקות היסטולוגיות מתקדמות לצורך ניתוח מפורט.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- ניתוח של הלב שהוצא על מנת לאתר את הסינוס האאורטלי.
- הכנת בלוקים של פראפין מהלב שעבר עיבוד.
- חיתוך של הסינוס האאורטלי והצמדה לשקופיות.
- צביעה של חתיכות הרקמה לצורך ניתוח.
תוצאות עיקריות
- זוהו נגעים טרשתיים בגדלים שונים.
- נצפו שינויים בהרכב הנגעים באמצעות צביעה.
- ניתוח היסטוכימי ואימונוהיסטוכימי סיפק תובנות מפורטות.
- התוצאות יכולות להנחות מחקרים עתידיים על טרשת עורקים.
מסקנות
- השיטות המתוארות יעילות לחקר נגעים אתרוסקלרוטיים.
- אפיון של נגעים יכול לשפר את ההבנה של מחלות קרדיווסקולריות.
- ניתן ליישם טכניקות אלו במודלים אחרים של מחקר קרדיווסקולרי.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
ניתוח כמותי של נגעים במודלים של סינוס אבי העורקים בעכברים מאפשר הערכה קפדנית של התקדמות טרשת העורקים והשפעה טיפולית בשלבי גילוי מוקדמים ובשלבים פרה-קליניים. מדידה מדויקת של שטח ונפח הנגע, בשילוב עם אפיון תאי, תומכת בביטחון חיזוי באישור מטרה (target validation) ובצמצום סיכונים מכניסטיים עבור פורטפוליו של תרופות קרדיווסקולריות. זרימת עבודה זו מהווה בסיס לרצף תרגומי מביולוגיה של גילוי להערכה במודלים פרה-קליניים במחקר של טרשת עורקים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשרת בדיקה כמותית של היפותזות בנוגע למניעים מולקולריים במודלים של טרשת עורקים.
- תומך בתיקוף תפקודי של המטרה על ידי קורלציה בין מאפייני הנגע להתערבויות גנטיות או תזונתיות.
- מאפשר הפחתת סיכונים מכניסטית באמצעות פרופיל תאי והרכבי של נגעים.
- מספק נתונים מהימנים לצורך מיון פורטפוליו ולקבלת החלטות מוקדמות של המשך או הפסקת הפרויקט (go/no-go).
סריקה ופיתוח בדיקות (Assays)
- מגדיר נקודות סיום היסטולוגיות סטנדרטיות וניתנות לשחזור עבור סריקת תרכובות.
- מספק מדדי נגעים כמותיים המתאימים להשוואות בין קבוצות.
- מאפשר הערכה ניתנת להרחבה (scalable) של יעילות ההתערבות במערכות עכברים מתוקשחות.
- תומך במוכנות הבדיקה עבור סריקות פנוטיפיות או מכניסטיות בהמשך.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאימה פנוטיפים של נגעים בעכברים למאפיינים רלוונטיים למחלה בבני אדם לצורך פיתוח ביומרקרים תרגומיים.
- מבטיחה רציפות משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני על ידי מתן אפשרות לכימות עקבי של הנגעים.
- מספקת בסיס להחלטות קידום מותאמות סיכון המבוססות על נתונים כמותיים ותאיים של הנגעים.
- מספקת תובנות מנגנוניות התומכות בהפחתת סיכונים חזויה בקווי פיתוח קרדיווסקולריים.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת נתונים
שיטה זו לניתוח כמיותי של נגעים משולבת החל משלב הגילוי המוקדם, דרך זיהוי מולקולות מובילות ועד לתיקוף פרה-קליני במסלולי מחקר של מחלות קרדיווסקולריות.
- ביולוגיה של הגילוי: תומך בבדיקת היפותזות ובבירור מסלולים על ידי כימות התגובת של הנגעים למודולציה גנטית או תזונתית.
- סריקה: מספק נקודות סיום כמותיות הניתנות לשחזור להערכת התערבויות מועמדות.
- אנליטיקה: מאפשר השוואה סטטיסטית של שטח הנגע, נפחו וההרכב התאי בין קבוצות ניסוי.
- מחקר תרגומי: מקשר בין ממצאים במודל עכברים למאפייני מחלה בבני אדם באמצעות ניתוח תאי והרכבי של הנגעים.
- שימוש חוזר ארגוני: מציע זרימת עבודה סטנדרטית וניתנת להתאמה עבור מודלים מגוונים של טרשעורקים ומחקרי התערבות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזיוי ומפחית עמימות מכניסטית בתיקוף יעדים לטיפול באתרוסקלרוזיס.
- ערך תפעולי: מספק כימות נגעים סטנדרטי, הדיר וניתן להרחבה בין מחקרים שונים.
- ערך אסטרטגי: משפר את איכות קבלת ההחלטות לגבי המשך פיתוח (go/no-go) ואת יעילות ההון על ידי אספקת נתונים פרה-קליניים חסונים.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעוד עדיפויות וקידום של נכסים קרדיווסקולריים בהתאם לסיכון.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בניתוח של מערכת לב-דם בעכברים ובעיבוד היסטולוגי.
- דורש גישה לתשתיות מיקרוטומיה, צביעה והדמיה לצורך חיתוך ואנליזה הניתנים לשחזור.
- מצריך סטנדרטיזציה בין-צוותית של זוויות החיתוך ושל נקודות ציון אנטומיות לצורך השוואת נתונים.
- ניתן להתאים למגוון מודלים של טרשת עורקים המושרים תזונתית או גנטית באמצעות התאמות לפרוטוקול.
- תלוי בזיהוי מדויק ובכימות של הנגעים כדי להבטיח את שלמות הנתונים.
