Name: ניתוח כמותי ואפיון של נגעים טרשת עורקים בסינוס אבי העורקים של העכברים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-07T22:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 43 s
Description: למד שיטות לאפיון וכימות נגעים טרשתיים בסינוס אבי העורקים של עכברים באמצעות היסטוכימיה ואימונוהיסטוכימיה. טכניקות אלו מאפשרות ניתוח מפורט של גודל ורכב הנגעים למחקר קרדיולוגי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה מומן על ידי מענק תפעולי מהמכונים הקנדיים למדעי הבריאות והאגודה הקנדית לסוכרת. DEV נתמך על ידי מלגה מ-Comisión Nacional de Investigación Científica y Tecnológica (CONICYT, צ'ילה).

ועדת האתיקה למחקר בבעלי חיים באוניברסיטת מקמאסטר אישרה מראש את כל ההליכים המתוארים כאן.
1. קצירת לב ואבי העורקים
<ol>
	<li>הרדמו את העכבר ופתחו בזהירות את חלל החזה כדי לחשוף את הלב ואת אבי העורקים הפרוקסימלי.
	<ol>
		<li>חלץ את הדם מהעכבר על ידי פיסוק ישיר של החדר הימני של הלב. 
		הערה: ניתן לאחסן את הדם ולהשתמש בו לניתוח שומנים בפלזמה וגורמים אחרים הנישאים בדם.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>המתת חסד של העכבר על ידי פריקת צוואר הרחם.</li>
	<li>שוטפים את כלי הדם עם 5 מ"ל מי מלח. 
	הערה: זה מושג על ידי זלוף כוח הכבידה דרך ניקוב מחט לתוך החדר השמאלי. כדי לאפשר ניקוז, מבצעים חתך קטן באטריום הימני. לאחר שטיפת כלי הדם, ניתן לאסוף דגימות רקמה של רקמת כבד, שריר ושומן, להקפיא בחנקן נוזלי ולאחסן בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס לניתוח עתידי.</li>
	<li>כלי הדם מקובעים על ידי זלוף כוח הכבידה לחדר השמאלי עם 10% פורמלין ניטרלי. 
	הערה: לאחר תחילת הזילוף, הזרימה של פורמלין ניטרלי 10% מותאמת לטפטוף איטי כך שהתהליך לוקח 1-2 דקות. איברים ורקמות שעברו קיבוע פרפוזיה יכולים לשמש לחקר ביטוי חלבונים באמצעות אימונופלואורסצנציה או היסטוכימיה, אך בדרך כלל הם אינם יכולים לשמש כדגימות לכתמים מערביים או לחקר ביטוי גנים.</li>
	<li>חלץ בזהירות את הלב וכ -2 מ"מ של אבי העורקים הפרוקסימלי מהפגר. ניתן לאסוף רקמות אחרות כולל אבי העורקים היורד ולאחסן אותן לניתוח עוקב. 
	הערה: אבי העורקים היורד (להתפצלות הכסל) יכול לשמש גם לבדיקת טרשת עורקים.</li>
	<li>בצע חתך רוחבי עם אזמל על הלב שהוסר באופן מאונך לאבי העורקים העולה. 
	הערה: זה מקל על ידי שימוש במיקרוסקופ מנתח וניתן לעשות זאת ביעילות על ידי חיתוך לאורך קו ישר המחבר את הקצוות התחתונים של הפרוזדורים הימניים והשמאליים (איור 1).</li>
	<li>אחסן את החלק האפיקלי (העליון) של הלב בקלטת הטבעה וטבל אותו בפורמלין ניטרלי מאגר לעיבוד.</li>
</ol>
2. הכנת אבי העורקים
<ol>
	<li>הנח את הקסטה עם הרקמה המנותחת לתוך מעבד הרקמות.</li>
	<li>עיבוד דגימות רקמה. 
	הערה: בדרך כלל, מעבדי רקמות מתוכנתים לעבוד בן לילה בגלל אורך הפעולה והפתרונות הכרוכים בתהליך זה. הדגימות מעובדות בהתאם לפרוטוקול שנקבע:
	<ol>
		<li>10% פורמלין ניטרלי חומצי למשך שעה אחת ב-42 מעלות צלזיוס.</li>
		<li>10% פורמלין ניטרלי חומצי למשך שעה אחת ב-42 מעלות צלזיוס.</li>
		<li>70% אתנול למשך 30 דקות בטמפרטורה של 40 מעלות צלזיוס.</li>
		<li>85% אתנול למשך 30 דקות בטמפרטורה של 40 מעלות צלזיוס.</li>
		<li>100% אתנול למשך 45 דקות בטמפרטורה של 40 מעלות צלזיוס.</li>
		<li>100% אתנול למשך 45 דקות בטמפרטורה של 40 מעלות צלזיוס.</li>
		<li>100% אתנול למשך 45 דקות בטמפרטורה של 40 מעלות צלזיוס.</li>
		<li>קסילן למשך שעה בטמפרטורה של 40 מעלות צלזיוס.</li>
		<li>קסילן למשך שעה בטמפרטורה של 40 מעלות צלזיוס.</li>
		<li>קסילן למשך שעה בטמפרטורה של 40 מעלות צלזיוס.</li>
		<li>שעוות פרפין למשך 45 דקות בטמפרטורה של 63 מעלות צלזיוס.</li>
		<li>שעוות פרפין למשך 45 דקות בטמפרטורה של 63 מעלות צלזיוס.</li>
		<li>שעוות פרפין למשך 45 דקות בטמפרטורה של 63 מעלות צלזיוס.</li>
		<li>שעוות פרפין למשך 45 דקות בטמפרטורה של 63 מעלות צלזיוס.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>ממיסים את שעוות הפרפין למשך הלילה בחום של 62 מעלות צלזיוס (איורים 1D-E). העריכו את הכמות הכוללת של שעוות פרפין לשימוש על סמך גרמים של שעוות פרפין הדרושים למילוי תבנית היסטולוגית ומספר הבלוקים שיש להכין. 
	הערה: תבנית היסטולוגיה עמוקה עדיפה על פני תבנית רדודה מכיוון שהיא מספקת זווית סיבוב פוטנציאלית רחבה יותר בעת החיתוך. תבנית היסטולוגיה עמוקה אחת דורשת 11 גרם שעוות פרפין.</li>
	<li>הניחו כל רקמה מעובדת לתוך תבנית היסטולוגית עמוקה, ואז שפכו שעוות פרפין מומסת כדי למלא את התבנית לחלוטין (איור 1F). מכסים את התבנית בקלטת פלסטיק מסומנת (איור 1G).</li>
	<li>מצננים את התבנית הממולאת על קרח, או על משטח קר (איור 1H), על מנת ליצור את הגוש המוצק ולהפריד את הבלוק מהתבנית (איורים 1I-J). 
	הערה: כאשר מניחים את הלב המנותח בתבנית, ודא שהפנים הפנימיות של הלב נוגעות בבסיס התבנית, ולאחר מכן המשך למלא את הבלוק בפרפין מומס. קלטת פלסטיק מסומנת מכסה את התבנית לפני שהיא מתמצקת על מנת לספק בסיס לטיפול בבלוק. לאחר הקירור, מסירים את התבנית וניתן לאחסן את גושי הפרפין ללא הגבלת זמן בטמפרטורת החדר.</li>
</ol>
3. חתך של אבי העורקים
<ol>
	<li>מקמו את הבלוק עם הלב במחזיק הדגימה של המיקרוטום כך שניתן יהיה לחתוך אותו מבפנים לכיוון החלק העליון של הלב (איור 2)</li>
	<li>התאם את המיקרוטום כדי לחתוך בעובי חתך של 10 מיקרומטר והמשך לחתוך את הלב.</li>
	<li>אסוף חלקים על שקופית זכוכית ובדוק תחת מיקרוסקופ אור כדי לקבוע מיקום וכיוון.</li>
	<li>כאשר מתגלים 1 או 2 שסתומים של סינוס אבי העורקים, כוונן את זווית הבלוק לפי הצורך (איור 3A). 
	הערה: הסינוס צריך להופיע כשלושה בסיסי שסתומים דו-חלקיים עם עלונים מחוברים. אם נצפים רק עלון שסתום אחד או שניים, יש לכוונן את זווית החיתוך בהתאם.</li>
	<li>כוונן את המיקרוטום לחיתוך ב-4-5 מיקרומטר ואסוף את החלקים על שקופיות זכוכית מצופות. 
	הערה: למרות שההליך יכול להיות מגוון, מומלצת גישה שיטתית, לפיה 10 החלקים הראשונים, מהסינוס של אבי העורקים המתקדם במעלה אבי העורקים העולה, נאספים על החלק העליון של שקופיות זכוכית מסומנות (שקופיות המסומנות 1-10). החלקים הבאים נאספים לפי אותו דפוס: #11-20, #21-30, #31-40 עד שהנגעים הטרשת כבר לא נצפים (איור 3B). בדרך זו ניתן לבחון ולאפיין את הנגעים הטרשת במיקומים מדויקים לאורך אבי העורקים העולה. לדוגמה, שקופית 1 מכילה קטעים 1, 11, 21, 31, 41 ו-51, המייצגים נגעים טרשת עורקים מהסינוס של אבי העורקים במעלה אבי העורקים העולה. ניתן לכלול שקופיות נוספות, המסומנות 11-20, אם הנגע גדול, כדי לאסוף חלקים דיסטליים יותר לפי אותו דפוס.</li>
	<li>המשך לאסוף חלקים עד שלא נצפה נגע טרשת עורקים. 
	הערה: ניתן לאחסן שקפים בטמפרטורת החדר למשך חודשים, לפני ניתוח נוסף.</li>
</ol>
4. צביעה וכימות של נגעים טרשת עורקים
ניתן לנתח נגעים טרשת עורקים בדרכים רבות ושונות באמצעות מגוון טכניקות. הניתוח הבסיסי ביותר כולל קביעת שטח חתך הנגע. על מנת להשוות במדויק את שטח הנגע, חשוב שנקודת ההתחלה למדידת הנגע תהיה עקבית ממדגם לדגימה. זה מקל על ידי שימוש בעלוני השסתום להתמצאות. כדי להקל על זיהוי וכימות מדויקים של אזור הנגע, חתכים נבחרים מוכתמים בהמטוקסילין ואאוזין. זה כרוך בטבילת השקופיות בסדרה של תמיסות לזמנים מוגדרים, שיפרשו / יכתמו את הרקמה.
פרוטוקול לצביעת המטוקסילין ואאוזין:
<ol>
	<li>הכניסו את השקופיות למייבש האוויר למשך 8 דקות ולאחר מכן הפזרו את החלקים על ידי שטיפה של 4× בקסילן, למשך 3 דקות לכל כביסה.</li>
	<li>שטפו שקופיות ב-100% אתנול 3× למשך 3 דקות כל אחת.</li>
	<li>שוטפים 3× באתנול 70% למשך 3 דקות כל אחד ולאחר מכן 2× באתנול 50% למשך 3 דקות כל אחד.</li>
	<li>שוטפים במים מזוקקים ולאחר מכן טובלים בהמטוקסילין של מאייר למשך 15 דקות.</li>
	<li>שטפו במי ברז זורמים למשך 5 דקות ולאחר מכן שטפו במים מזוקקים למשך 5 דקות.</li>
	<li>טבלו ב- Eosin Y למשך 1-5 דקות.</li>
	<li>שוטפים במים מזוקקים 3× למשך 5 דקות כל אחד, שוטפים פנימה 50% אתנול 2× למשך 2 דקות כל אחד, ואז 70% אתנול 3× למשך 2 דקות כל אחד.</li>
	<li>שוטפים פנימה 100% אתנול 3× למשך 2 דקות כל אחד ואז שוטפים בקסילן 4× למשך 2 דקות כל אחד.</li>
	<li>הרכיבו קטעים באמצעות מדיום הרכבה מבוסס קסילן וצלמו תמונות באמצעות מצלמה דיגיטלית המותקנת על מיקרוסקופ אור.</li>
	<li>זיהוי וכימות אזור הנגע באמצעות תוכנת הדמיה. 
	הערה: ניתן לקבוע את שטח הנגע במרחקים ספציפיים מהסינוס האאורטלי במרווחים של 40-50 מיקרומטר (תלוי בעובי של כל קטע). תרשים של מדידות שטח אלה לעומת מרחק נותן פרופיל של הנגע הטרשת (איור 4). השטח שמתחת לעקומה מייצג אומדן של הנפח הכולל של הנגע הטרשתי. אפיון נוסף של הנגע יכול לכלול קביעת השטח הנמק. הליבה הנמקית (nc) של נגע מתקדם נוצרת על ידי תאי קצף אפופטוטיים. עם תרגול, ניתן לקבוע זאת על ידי בחינת האזורים הא-תאיים של החלקים המוכתמים בהמטוקסילין ואאוזין (איור 4A). לנגעים מוקדמים יש מעט מאוד נמק בעוד שלנגעים מתקדמים יותר יש אזורים נמקיים מוגברים שעלולים לתרום לחוסר יציבות של הפלאק. יש לבחון חתכים סדרתיים של אותו אבי העורקים כדי לאשר נוכחות של אזור נמק.</li>
</ol>
5. אפיון נוסף של הנגע הטרשת
פרטים ספציפיים לגבי שלב ההתפתחות של טרשת עורקים יכולים להיקבע על ידי צביעה בנוגדנים המכוונים נגד סוגי תאים או סמנים ספציפיים. אימונוהיסטוכימיה על קטעי פרפין היא טכניקה סטנדרטית המשמשת לזיהוי סוגי תאים או סמנים ספציפיים בהקשר של הרקמה הלא מוכתמת שמסביב. זיהוי אנטיגן מושג בדרך כלל באמצעות מצע פרוקסידאז חזרת.
צביעה אימונופלואורסצנטית כרוכה בשימוש בנוגדנים מצומדים פלואורופור ודורשת מיקרוסקופ פלואורסצנטי ומסננים מתאימים לזיהוי. טכניקה זו מאפשרת צביעה בו זמנית של שני אנטיגנים (או יותר).
פרוטוקול כללי לצביעה אימונוהיסטוכימית:
<ol>
	<li>הנח את המגלשות במייבש האוויר למשך 8 דקות.</li>
	<li>Deparaffinize חלקים ב-4 שינויים של קסילן, 3 דקות כל אחד.</li>
	<li>שטפו פנימה 100% אתנול 3× למשך 3 דקות כל אחד כדי להסיר קסילן.</li>
	<li>שוטפים 3× ב-70% אתנול למשך 3 דקות כל אחד, ואז 2× ב-50% אתנול למשך 3 דקות כל אחד.</li>
	<li>שוטפים במים מזוקקים 5 דקות כל אחד ואז שוטפים 3× ב-PBS למשך 5 דקות כל אחד.</li>
	<li>בצע אחזור אנטיגן. ניתן להשיג זאת בשיטת אחזור אפיטופים המושרה בחום (HIER) בסיר לחץ מיקרוגל ובתמיסת אחזור אנטיגן (מאגר ציטראט 10 מ"מ, pH 6.0). 
	הערה: תהליך קיבוע הפורמלין עשוי להסוות את האנטיגנים המעניינים. מניסיוננו, ה-HIER משפר משמעותית את הביצועים של נוגדנים מסוימים, אך אינו נדרש עבור אחרים. בנוסף, ישנן חלופות זמינות אחרות לשיטת HIER לאחזור אנטיגן.</li>
	<li>כאשר סיר הלחץ התקרר, הנח שקופיות ב-PBS למשך 15 דקות.</li>
	<li>דגרו חלקים בסרום רגיל (מאותו המין שממנו נגזר הנוגדן המשני) למשך 30 דקות. אין לשטוף שקופיות - לנקז את הסרום.</li>
	<li>יש לדגור עם נוגדן ראשוני מדולל בסרום חוסם רגיל למשך שעתיים בטמפרטורת החדר או למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>יש לשטוף עם PBS 3× למשך 5 דקות כל אחד.</li>
	<li>דגרו חלקים עם הנוגדן המשני הביוטיניל שדולל ב-PBS למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>דגרו מגלשות עם חזרת פרוקסידאז סטרפטווידין למשך 30 דקות ואז שטפו עם PBS 3× למשך 5 דקות כל אחת.</li>
	<li>תגובה כרומוגנית- מגלשות דגירה ב-DAB טרי (3,3'-דיאמינובנזידין) למשך 5-30 דקות. יש לעקוב אחר תגובה זו באמצעות מיקרוסקופ. עצור את התגובה על ידי שטיפת שקופיות במי ברז.</li>
	<li>יש לטשטף עם המטוקסילין למשך דקה אחת. יש לשטוף במי ברז למשך 5 דקות ולאחר מכן לשטוף במים מזוקקים 3× למשך 5 דקות כל אחד.</li>
	<li>חזור על שלבים 4.7-4.9 להרכבת שקופיות.</li>
</ol>
6. פרוטוקול כללי לצביעה אימונופלואורסצנטית
ניתן לעקוב אחר פרוטוקול דומה, עם שינויים קלים, לצביעה אימונופלואורסצנטית.
<ol>
	<li>הנח שקופיות במייבש האוויר למשך 8 דקות ולאחר מכן הסר חלקים ב-4 החלפות של קסילן, 3 דקות כל אחד.</li>
	<li>שטפו פנימה 100% אתנול 3× למשך 3 דקות כל אחד כדי להסיר קסילן.</li>
	<li>שוטפים 3× ב-70% אתנול למשך 3 דקות כל אחד, ואז 2× ב-50% אתנול למשך 3 דקות כל אחד.</li>
	<li>שוטפים במים מזוקקים במשך 5 דקות כל אחד ואז שוטפים ב-PBS 3× למשך 5 דקות כל אחד.</li>
	<li>בצע אחזור אנטיגן. ניתן להשיג זאת בשיטת אחזור אפיטופים המושרה בחום (HIER) בסיר לחץ מיקרוגל ובתמיסת אחזור אנטיגן (מאגר ציטראט 10 מ"מ, pH 6.0). 
	הערה: תהליך קיבוע הפורמלין עשוי להסוות את האנטיגנים המעניינים. מניסיוננו, ה-HIER משפר משמעותית את הביצועים של נוגדנים מסוימים, אך אינו נדרש עבור אחרים. בנוסף, ישנן חלופות זמינות אחרות לשיטת HIER לאחזור אנטיגן.</li>
	<li>כאשר סיר הלחץ התקרר, הנח שקופיות ב-PBS למשך 15 דקות.</li>
	<li>דגרו חלקים בסרום רגיל (מאותו המין שממנו נגזר הנוגדן המשני) למשך 30 דקות. אין לשטוף שקופיות - לנקז את הסרום.</li>
	<li>יש לדגור עם נוגדן ראשוני מדולל בסרום חוסם רגיל למשך שעתיים בטמפרטורת החדר או למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>יש לשטוף עם PBS 3× למשך 5 דקות כל אחד.</li>
	<li>הוסף נוגדן מצומד פלואורופור משני המדולל בסרום חוסם רגיל (או PBS). יש לדגור למשך שעה וחצי בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>יש לשטוף עם PBS 3× למשך 5 דקות כל אחד.</li>
	<li>כתם נגד עם DAPI.</li>
	<li>שוטפים ב-PBS 3× למשך 5 דקות כל אחד.</li>
	<li>החל כיסוי באמצעות אמצעי הרכבה נגד דהייה.</li>
</ol>

<ol><li>Zadelaar, S., Kleemann, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+for+atherosclerosis+and+pharmaceutical+modifiers%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler.+Thromb.+Vasc.+Biol%22%5BJournal%5D)">Mouse models for atherosclerosis and pharmaceutical modifiers.</a> Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 27 (8), 1706-1721 (2007).</li>
<li>Daugherty, A., Rateri, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+experimental+designs+for+atherosclerosis+studies+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Development of experimental designs for atherosclerosis studies in mice.</a> Methods. 36, 129-138 (2005).</li>
<li>Getz, G. S., Reardon, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diet+and+murine+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler.+Thromb.+Vasc.+Biol%22%5BJournal%5D)">Diet and murine atherosclerosis.</a> Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 26 (2), 242-249 (2006).</li>
<li>Zhang, S. H., Reddick, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+hypercholesterolemia+and+arterial+lesions+in+mice+lacking+apolipoprotein+E%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Spontaneous hypercholesterolemia and arterial lesions in mice lacking apolipoprotein E.</a> Science. 258 (5081), 468-471 (1992).</li>
<li>Ishibashi, S., Goldstein, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massive+xanthomatosis+and+atherosclerosis+in+cholesterol-fed+low+density+lipoprotein+receptor-negative+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Massive xanthomatosis and atherosclerosis in cholesterol-fed low density lipoprotein receptor-negative mice.</a> J. Clin. Invest. 93 (5), 1885-1893 (1994).</li>
<li>Kunjathoor, V. V., Wilson, D. L., LeBoeuf, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+atherosclerosis+in+streptozotocin-induced+diabetic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Increased atherosclerosis in streptozotocin-induced diabetic mice.</a> J. Clin. Invest. 97 (7), 1767-1773 (1996).</li>
<li>Hartvigsen, K., Binder, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+diet-induced+hypercholesterolemic+murine+model+to+study+atherogenesis+without+obesity+and+metabolic+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler.+Thromb.+Vasc.+Biol%22%5BJournal%5D)">A diet-induced hypercholesterolemic murine model to study atherogenesis without obesity and metabolic syndrome.</a> Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 27 (4), 878-885 (2007).</li>
<li>King, V. L., Hatch, N. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+murine+model+of+obesity+with+accelerated+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Obesity%22%5BJournal%5D)">A murine model of obesity with accelerated atherosclerosis.</a> Obesity. 18 (1), 35-41 (2004).</li>
<li>Taylor Weiss, D. &, R, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deoxycorticosterone+acetate+salt+hypertension+in+apolipoprotein+E-%2F-+mice+results+in+accelerated+atherosclerosis%3A+the+role+of+angiotensin+II%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension%22%5BJournal%5D)">Deoxycorticosterone acetate salt hypertension in apolipoprotein E-/- mice results in accelerated atherosclerosis: the role of angiotensin II.</a> Hypertension. 51 (2), 218-224 (2008).</li>
<li>Gairola, C. G., Drawdy, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sidestream+cigarette+smoke+accelerates+atherogenesis+in+apolipoprotein+E-%2F-+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Atherosclerosis%22%5BJournal%5D)">Sidestream cigarette smoke accelerates atherogenesis in apolipoprotein E-/- mice.</a> Atherosclerosis. 156 (1), 49-55 (2001).</li>
<li>Pynn, M., Schäfer, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exercise+training+reduces+neointimal+growth+and+stabilizes+vascular+lesions+developing+after+injury+in+apolipoprotein+e-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Exercise training reduces neointimal growth and stabilizes vascular lesions developing after injury in apolipoprotein e-deficient mice.</a> Circulation. 109 (3), 386-392 (2004).</li>
<li>Nakashima, Y., Plump, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ApoE-deficient+mice+develop+lesions+of+all+phases+of+atherosclerosis+throughout+the+arterial+tree%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler.+Thromb%22%5BJournal%5D)">ApoE-deficient mice develop lesions of all phases of atherosclerosis throughout the arterial tree.</a> Arterioscler. Thromb. 14 (1), 133-140 (1994).</li>
<li>Reddick, R. L., Zhang, S. H., Maeda, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atherosclerosis+in+mice+lacking+apo+E.+Evaluation+of+lesional+development+and+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler.+Thromb%22%5BJournal%5D)">Atherosclerosis in mice lacking apo E. Evaluation of lesional development and progression.</a> Arterioscler. Thromb. 14 (1), 141-147 (1994).</li>
<li>Tangirala, R. K., Rubin, E. M., Palinski, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+of+atherosclerosis+in+murine+models%3A+correlation+between+lesions+in+the+aortic+origin+and+in+the+entire+aorta%2C+and+differences+in+the+extent+of+lesions+between+sexes+in+LDL+receptor-deficient+and+apolipoprotein+E-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Quantitation of atherosclerosis in murine models: correlation between lesions in the aortic origin and in the entire aorta, and differences in the extent of lesions between sexes in LDL receptor-deficient and apolipoprotein E-deficient mice.</a> J. Lipid Res. 36 (11), 2320-2328 (1995).</li>
<li>Paigen, B., Morrow, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+assessment+of+atherosclerotic+lesions+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Atherosclerosis%22%5BJournal%5D)">Quantitative assessment of atherosclerotic lesions in mice.</a> Atherosclerosis. 68 (3), 231-240 (1987).</li>
<li>Baglione, J., Smith, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Assay+for+Mouse+Atherosclerosis+in+the+Aortic+Root%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Quantitative Assay for Mouse Atherosclerosis in the Aortic Root.</a> Methods in Molecular Medicine. 129, (2006).</li>
<li>Lee, T. Y., Muschal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiostatin+regulates+the+expression+of+antiangiogenic+and+proapoptotic+pathways+via+targeted+inhibition+of+mitochondrial+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Angiostatin regulates the expression of antiangiogenic and proapoptotic pathways via targeted inhibition of mitochondrial proteins.</a> Blood. 114 (9), 1987-1998 (2009).</li>
<li>Ballon, G., Chen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kaposi+sarcoma+herpesvirus+%28KSHV%29+vFLIP+oncoprotein+induces+B+cell+transdifferentiation+and+tumorigenesis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Kaposi sarcoma herpesvirus (KSHV) vFLIP oncoprotein induces B cell transdifferentiation and tumorigenesis in mice.</a> J. Clin. Invest. 121 (3), 1141-1153 (2011).</li>
<li>Khallou-Laschet, J., Varthaman, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+plasticity+in+experimental+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Macrophage plasticity in experimental atherosclerosis.</a> PLoS One. 5 (1), e8852(2010).</li>
<li>Rotzius, P., Thams, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+infiltration+of+neutrophils+in+lesion+shoulders+in+ApoE-%2F-+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Distinct infiltration of neutrophils in lesion shoulders in ApoE-/- mice.</a> Am. J. Pathol. 177 (1), 493-500 (2010).</li>
<li>Kanellakis, P., Agrotis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-mobility+group+box+protein+1+neutralization+reduces+development+of+diet-induced+atherosclerosis+in+apolipoprotein+e-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler.+Thromb.+Vasc.+Biol%22%5BJournal%5D)">High-mobility group box protein 1 neutralization reduces development of diet-induced atherosclerosis in apolipoprotein e-deficient mice.</a> Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 31 (2), 313-319 (2011).</li>
<li>Schwartz, C. J., Mitchell, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Observations+on+localization+of+arterial+plaques%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Observations on localization of arterial plaques.</a> Circ. Res. 11, 63-73 (1962).</li>
<li>Won, D., Zhu, S. N., Chen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relative+reduction+of+endothelial+nitric-oxide+synthase+expression+and+transcription+in+atherosclerosis-prone+regions+of+the+mouse+aorta+and+in+an+in+vitro+model+of+disturbed+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Relative reduction of endothelial nitric-oxide synthase expression and transcription in atherosclerosis-prone regions of the mouse aorta and in an in vitro model of disturbed flow.</a> Am. J. Pathol. 171 (5), 1691-1704 (2007).</li>
<li>Rosenfeld, M. E., Polinsky, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+atherosclerotic+lesions+in+the+innominate+artery+of+the+ApoE+knockout+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler.+Thromb.+Vasc.+Biol%22%5BJournal%5D)">Advanced atherosclerotic lesions in the innominate artery of the ApoE knockout mouse.</a> Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 20 (12), 2587-2592 (2000).</li>
<li>McAteer, M. A., Schneider, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+and+3Dreconstruction+of+atherosclerotic+plaque+components+in+apolipoprotein+E+knockout+mice+using+ex+vivo+high-resolution+MRI%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler.+Thromb.+Vasc.+Biol%22%5BJournal%5D)">Quantification and 3Dreconstruction of atherosclerotic plaque components in apolipoprotein E knockout mice using ex vivo high-resolution MRI.</a> Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 24 (12), 2384-2390 (2004).</li>
<li>Martinez, H. G., Prajapati, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Images+in+cardiovascular+medicine%3A+Microscopiccomputedtomography-based+virtual+histology+for+visualization+and+morphometry+of+atherosclerosis+in+diabetic+apolipoprotein+e+mutant+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Images in cardiovascular medicine: Microscopiccomputedtomography-based virtual histology for visualization and morphometry of atherosclerosis in diabetic apolipoprotein e mutant mice.</a> Circulation. 120 (9), 821-822 (2009).</li>
<li>Kirkby, N. S., Low, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+3-dimensional+imaging+of+murine+neointimal+and+atherosclerotic+lesions+by+optical+projection+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Quantitative 3-dimensional imaging of murine neointimal and atherosclerotic lesions by optical projection tomography.</a> PLoS One. 6 (2), e16906(2011).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

טרשת עורקים היא מחלה כרונית מורכבת של עורקי השרירים הגדולים המהווה גורם בסיסי עיקרי לאוטם שריר הלב ושבץ מוחי. התקדמות המחלה כרוכה באינטראקציה של סוגי תאים רבים ושונים בתוך דופן העורק, עם תאי דם במחזור הדם, חלקיקי ליפופרוטאין וגורמים אחרים הנישאים בדם שאנו רק מתחילים להבין. חלק גדול מהידע הנוכחי שלנו לגבי התפתחות והתקדמות של טרשת עורקים הגיע ממחקרים שבוצעו במערכות מודלים של עכברים המועדים לטרשת עורקים שתוכננו במיוחד.
חשוב לזכור שלמודלים של עכברים של טרשת עורקים יש כמה מגבלות משמעותיות. ברור שבה...

בשני העשורים האחרונים הפיתוח והשימוש במודלים של עכברים המועדים לטרשת עורקים באמצעות מניפולציה תזונתית ו/או גנטית הגדילו משמעותית את הבנתנו את המנגנונים המולקולריים והתאים המעורבים בהתפתחות נגעים טרשת עורקים1-3. חלק גדול מהידע וההבנה שלנו על אטרוגנזה מגיע ממחקרים שבוצעו באפוליפופרוטאין (Apo)-E חסר 4 עכברים, שבהם נגעים טרשת עורקים מתפתחים באופן ספונטני וחסר קולטן ליפופרוטאין בצפיפות נמוכה (LDLR)5 עכברים, בהם טרשת עורקים נגרמת על ידי תזונה. יתרון חשוב של מודלים אלה הוא שהם מאפשרים לחקור מספר גדול יחסית של בעלי חיים מוגדרים גנטית בתנאים תזונתיים וסביבתיים מבוקרים. בנוסף, נראה כי הנגעים הטרשת המתקדמים המתפתחים בחלק מזני העכברים הללו דומים מאוד לאלה שנצפו בבני אדם, המכילים ליבות נמקיות מלאות בשומנים וכובעים סיביים. טרשת עורקים מתפתחת במהירות במודלים אלה של עכברים, מה שהופך את זה לאפשרי מאוד לחקור את התפתחות הנגעים, מפס שומני ועד רובד מתקדם, תוך מספר שבועות. יתר על כן, גורמי סיכון ידועים למחלות לב וכלי דם בבני אדם, כולל סוכרת6, דיסליפידמיה7, השמנת יתר8, יתר לחץ דם9, עשן סיגריות10 וסביבה יושבנית11 הוכחו כמאיצים עוד יותר את התפתחות הנגעים.
ברוב דגמי העכברים המועדים לטרשת עורקים, אם לא בכולם, ניתן לזהות תחילה התפתחות נגעים בסינוס אבי העורקים. זמן ההופעה תלוי בזן העכבר ובתזונה. ככל שהנגעים גדלים הם נוטים לגדול במעלה אבי העורקים העולה. בעכברי ApoE-/- ו-LDLR-/-, ניתן לזהות התפתחות נגע לאחר מכן בהתפצלות אבי העורקים בקשת אבי העורקים, באבי העורקים היורד ובעורקים גדולים אחרים12-14. ד"ר בוורלי פייגן ועמיתיה, בנוסף לפיתוח כמה מהמודלים המוקדמים ביותר של טרשת עורקים הנגרמת על ידי תזונה, הקימו גם מבחן לכימות נגעים טרשת עורקים בסינוס אבי העורקים שהפך לסטנדרט למדידת נגעים במודלים של עכברים15. במהלך השנים טכניקה זו שוכללה ותוארה בפירוט16. כאן אנו מציגים גרסה שונה של "שיטת פייגן" לכימות ואפיון של נגעים טרשת עורקים בעכבר. ניתוח חתכי אבי העורקים הסדרתי מאזור כלי דם ספציפי ובכיוון מוגדר וקבוע, מאפשר איסוף נתונים מדויק ומאפשר זיהוי מדויק של שינויים בהתפתחות הנגע בקבוצות טיפול שונות. השיטות המוצגות כאן מתבססות על הטכניקות הקודמות. באופן ספציפי, אנו מתארים כיצד אפיון הנגע במונחים של שטח, נפח, תוכן נמק ותאי אפשרי באמצעות בחינת חתכים סדרתיים באמצעות שילוב של היסטוכימיה ואימונוהיסטוכימיה.

<table><tbody><tr><td>עכברים חסרי LDLR&nbsp;( D2.129S7(B6)-Ldlrtm1Her/J)</td>מלאי <td>מעבדת ג'קסון</td><td>#002207</td><td></td></tr><tr><td>פורמלין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>HT5011</td><td></td></tr><tr><td>תבניות היסטולוגיה</td><td>טד פלה בע"מ</td><td>27195</td><td></td></tr><tr><td>פרפין</td><td>פרמט</td><td>19286-10</td><td></td></tr><tr><td>שקופיות מצופות</td><td>פישר</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>מיכלי ממס</td><td>רקמות טק II</td><td>4457</td><td></td></tr><tr><td>Microtome</td><td>Leica</td><td>RM22S5</td><td></td></tr><tr><td>אמבט מים</td><td>VWR</td><td>80086-982</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ</td><td>אולימפוס</td><td>BX41TF</td><td></td></tr><tr><td>מצלמה</td><td>אולימפוס</td><td>DP72</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td>www.rsbweb.nih.gov/ij/</td><td></td></tr> <tr><td>מעבד</td><td>סאקורה פינטק</td><td>VIP6-A1</td><td></td></tr><tr><td>קלטות עיבוד</td><td>VWR</td><td>18000-134</td><td></td></tr><tr><td>Preassure סיר</td><td>נורדי כלים</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coverslip</td><td>פישר</td><td>12-545-M</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3813</td><td></td></tr><tr><td>להב מיקרוטום</td><td>Thermo Scientific</td><td>30-518-35</td><td></td></tr><tr><td>Antifade הרכבה בינונית</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>F-4680</td><td></td></tr><tr><td>קסילן בינוני&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>44581</td><td></td></tr><tr><td>מדיום הרכבה אקוואלי</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I1161</td><td></td></tr><tr><td>Mac-3 anbody</td><td>BD Pharmingen</td><td>553322</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>F4/80 נוגדן</td><td>Abcam</td><td>Ab6640</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן אלפא אקטין</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-32251</td><td></td></tr><tr><td>Mayer&rsquo; s המטוקסילין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>E4382</td><td></td></tr><tr><td>eosin y</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>MHS16</td><td></td></tr><tr><td>DAB (3,3'-דיאמינובנזידין)</td><td>דקו</td><td>K3468</td><td></td></tr></tbody></table>

ניתוח כמותי ואפיון של נגעים טרשת עורקים בסינוס אבי העורקים של העכברים

Quantitative Analysis and Characterization of Atherosclerotic Lesions in the Murine Aortic Sinus

טרשת עורקים היא מחלה של העורקים הגדולים וגורם בסיסי עיקרי לאוטם שריר הלב ושבץ מוחי. מספר מודלים שונים של עכברים פותחו כדי להקל על חקר הפתופיזיולוגיה המולקולרית והתאית של מחלה זו. בכתב יד זה אנו מתארים טכניקות ספציפיות לכימות ואפיון של נגעים טרשת עורקים בסינוס אבי העורקים של העכברים ובאבי העורקים העולה. היתרון של הליך זה הוא בכך שהוא מספק מדידה מדויקת של שטח החתך והנפח הכולל של הנגע, שניתן להשתמש בו כדי להשוות התקדמות טרשת עורקים בין קבוצות טיפול שונות. זה אפשרי באמצעות שימוש בעלוני השסתום כציון דרך אנטומי, יחד עם התאמה קפדנית של זווית החיתוך. אנו מתארים גם שיטות צביעה בסיסיות שניתן להשתמש בהן כדי להתחיל לאפיין התקדמות טרשת עורקים. ניתן לשנות אותם עוד יותר כדי לחקור אנטיגנים בעלי עניין ספציפי לחוקר. הטכניקות המתוארות ישימות בדרך כלל למגוון רחב של מודלים תזונתיים וגנטיים קיימים וחדשים של עורקים.

עכברים מסוג LDLR-/- בני חמישה שבועות הוכשילו בתזונה סטנדרטית או בתזונה עשירה בשומן למשך עשרה שבועות. העכברים נשחטו ועברו פרפוזיה עם פורמלין כפי שתיאר לעיל. הוכנו חתכים רוחביים של הסינוס האורטלי אשר נצבעו בהמטוקסילין ואאוזין כדי לקבוע את שטח ונפח הנגעים (איור 4). כאשר עכברים מוזנים בתזונה סטנדרטית, התפתחות האתרוסקלרוזיס מוגבלת מאוד ועשויה שלא להיות ניתנת לגילוי בגיל 15 שבועות. תזונה עשירה בשומן מאיצה באופן משמעותי את האתרוגנזה במודל זה ומשרה היווצרות של נגעים מתקדמים וגדולים המכילים ליבות נמקרוטיות חסרות...

אנו מתארים הליכים לכימות ואפיון נגעים טרשת עורקים במודלים של עכברים באמצעות חתך מדויק של סינוס אבי העורקים ואבי העורקים העולה בשילוב עם ניתוח היסטוכימי ואימונוהיסטוכימי.

Atherosclerosis is a disease of the large arteries and a major underlying cause of myocardial infarction and stroke. Several different mouse models have ...

המטרה הכללית של הליך זה היא לאפיין ולכמת נגעים טרשוזיים בסינוס האאורטלי של ה-MI. מטרה זו מושגת תחילה על ידי נתיחה של לב שהוצא, כדי להפריד את החלק האפיקלי ולאתר את הסינוס האאורטלי. לאחר מכן, מוכנים בלוקי פאראפין עם החלק האפיקלי המעובד של הלב.לאחר מכן, הסינוס האאורטלי נחתך ומועבר למשקופיות. לבסוף, נזבחי הרקמה נצבעים. בסופו של דבר, ניתן להפיק תוצאות המראות גדלים והרכבים שונים של נגעים אתרוסקלרוטיים באמצעות אנליזה היסטוכימית ואימונוהיסטוכימית.את הפרוצדורה ידגים דניאל ונגה פנל, סטודנט לתואר שני מהמעבדה שלי. ועדת אתיקת המחקר בבעלי חיים של אוניברסיטת מקמסטר אישרה מראש את כל ההליכים המתוארים כאן; לאחר הרדמה של עכבר LDLR double negative ושאיבת דם, יש לבצע הריגה וקיבוע לפני בידוד הלב בהתאם לפרוטוקול הכתוב. השתמש בסכין מנתחים כדי לבצע חיתוך רוחבי של הלב, בניצב לאורטה העולה. הנח את החלק האפיקלי או העליון של הלב בקסטת הטמעה והטבל אותו בפורמלין.לאחר מכן, הכניסו את הקסטה למעבד רקמות ובצעו עיבוד במהלך הלילה. בהתאם לתוכנית המפורטת בפרוטוקול הטקסט עבור תבניות ההיסטולוגיה, המיסו שעוות פראפין במהלך הלילה בטמפרטורה של 62 °C. מקמו כל רקמה שעובדה בתוך תבנית היסטולוגיה עמוקה, תוך וידוא שממשק הלב נוגע בתחתית התבנית, ולאחר מכן מזגו שעוות פראפין מומסת עד למילוי מלא של התבנית.השתמשו בקסטה פלסטית מסומנת כדי לכסות את התבנית. לאחר קירור התבניות על קרח או על משטח קר, הפרידו את הבלוק מהתבנית כדי לבצע חיתוכים של האורטה. מקמו את הבלוק במחזיק הדגימות של המיקרוטום כך שניתן יהיה לחתוך אותו מהחלק הפנימי לכיוון החלק העליון של הלב.כווננו את המיקרוטום ל-10 microns ובצעו חיתוך של הלב. אספו את החתכים על עלית זכוכית ובחנו אותם תחת מיקרוסקופ אור כדי לקבוע את המיקום והאוריינטציה. הסינוס אמור להיראות כשלושה בסיסי מסתמים דו-חלקיים עם עלונים צמודים.כאשר אחד או שניים מהמסתמי הסינוס האורטלי הופכים גלויים, התאימו את זווית הבלוק לפי הצורך. עם ההגעה למסתמים, כווננו את המיקרוטום לחיתוך של 4 עד 5 מיקרון. הצמידו את 10 החתכים הראשונים, כל אחד בראשן של שקופיות זכוכית נפרדות, ולאחר מכן הצמידו כל קבוצה עוקבת של 10 חתכים במיקום הבא.על השקופיות. המשיכו לאסוף חתכים עד שלא ייראו יותר נגעים אתרוסקלרוטיים. לצביעת החתכים ב-hematin ו-eosin לצורך ויזואליזציה של הנגעים, הכניסו את השקופיות למייבש אוויר למשך שמונה דקות.לאחר מכן, בצעו דה-פראליזציה (deparaffinization) של החתכים על ידי שטיפה עם xylene ארבע פעמים למשך שלוש דקות בכל פעם. שטפו את השקופיות ב-100% ethanol שלוש פעמים למשך שלוש דקות בכל פעם. לאחר מכן, שטפו ב-70% ethanol וב-50% ethanol.שלוש פעמים למשך שלוש דקות בכל פעם. השתמש במים מזוקקים כדי לשטוף את השקופיות ולאחר מכן טבול אותן ב-MA's hematin למשך 15 דקות.שטוף תחת זרימה של מי ברז למשך חמש דקות. לאחר מכן, שטוף במים מזוקקים למשך חמש דקות לאחר טבילה ב-eoin Y למשך אחת עד חמש דקות.שטוף במים מזוקקים שלוש פעמים למשך חמש דקות בכל פעם. שטוף ב-50% ethanol פעמיים למשך שתי דקות בכל פעם. לאחר מכן, שטוף ב-70% ethanol שלוש פעמים למשך שתי דקות בכל שטיפה, וב-100% ethanol.שלוש פעמים למשך שתי דקות בכל פעם. לאחר מכן, שטפו וטבלו ב-xylene ארבע פעמים למשך שתי דקות בכל פעם. השתמשו בחומר הרכבה מבוסס xylene להרכבת הסרטים וצלמו תמונות תחת מיקרוסקופ אור.השתמשו בתוכנת דימות כדי לזהות ולכמת נגעים, אותם ניתן לקבוע במרחקים ספציפיים מהסינוס האורטלי במרווחים של 40 עד 50 מיקרון, בהתאם לעובי החתכים; עיינו בפרוטוקול הטקסט עבור צביעה אימונוהיסטוכימית ואימונופלואורסצנציה. עכברים LDLR-positive בני חמישה שבועות הוכזנו בתזונה סטנדרטית או בתזונה עשירה בשומן למשך 10 שבועות לפני שhearts שלהם קובעו, בודדו ונחתכו כפי שמוצג כאן.כאשר עכברים ניזונים מתזונה סטנדרטית (standard chow), התפתחות העקתורים היא מוגבלת מאוד ועשויה שלא להיות ניתנת לגילוי בגיל 15 שבועות. תזונה עשירה בשומן מאיצה משמעותית את התהליך האתרוגני במודל זה ומשרה היווצרות של נגעים מתקדמים וגדולים המכילים ליבות א-תאיות כרוניות וכיסויים סיביים. ניתן לאפיין את הנגעים האתרוסקלרוטיים באופן נוסף באמצעות צביעה לנוכחות של סוגי תאים וגורמים ספציפיים המגדירים את שלבי התפתחות הנגע.חדירה של מונוציטים אל האינטימה מייצגת את אחד האירועים המוקדמים ביותר של האתרוגנזה באינטימה. מונוציטים מבדילים למקרופאגים הבולעים פסולת תאית וליפידים. מקרופאגים רוויים בליפידים, הידועים כתאי קצף, יוצרים פס ליפידי בדופן העורק כפי שניתן לראות כאן.ניתן לזהות תאי קצף מאקרופאגיים בכל שלבי התפתחות הנגע על ידי צביעה בנוגדנים כנגד סממני מאקרופאג ספציפיים כגון F4/80 ו-MAC3. תאי שריר חלק וסקולריים (vSMCs) מוגבלים לשכבה המדיאלית של עורק בריא. תאי vSMCs מונעים להגר ולשכפל את עצמם באינטימה במהלך התפתחותו של נגע מתקדם.כפי שניתן לראות בלוח זה, ניתן לזהות SMCs של ורידים באמצעות צביעה בנוגדן נגד alpha actin לאחר פיתוחה. טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום מחלות כלי הדם והלב לחקור את הפיתוח וההתקדמות של נגעי טריוסיקלרוזיס בחולדות.

quantitative-analysis-characterization-atherosclerotic-lesions-murine

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

ניתוח כמותי ומאפיינים של נגעים טרשת עורקים בסינוס אבי העורקים של עכברים

ניתוח Ex vivo של נגעים עורקיים ממודלים של בעלי חיים של מחלות לב וכלי דם מסתמך באופן קלאסי על טכניקות היסטולוגיות ואימונוהיסטוכימיות. אלה מספקים מדידות דו-ממדיות בנגעים תלת מימדיים. כתב יד זה מתאר יצירת נגעים עורקיים לניתוח כמותי בתלת מימד באמצעות טומוגרפיה של הקרנה אופטית.

דור וQuantitation 3 ממדים של עורקי פצעים בעכברים באמצעות טומוגרפיה הקרנה אופטית

וידאו זה מראה שני מודלים של פיתוח פלאק בעורקי intimal עכבריים ומדגיש את ההבדלים בהיפרפלזיה myointimal וטרשת עורקת.

גרימת Myointimal היפרפלזיה נגד טרשת עורקים בעכברים: מבוא של שני מודלים חוקיים

מאמר זה מתאר מתודולוגיה מפורט של שימוש של גומי סיליקון עופרת ריתוך perfuse את להערכת מאתר על קוטר אבי העורקים כימות במודל של עכברים של מפרצת אבי העורקים, לנתיחה.

ניתוח כמותי מיקרו-CT Aortopathy במודל של עכברים של β-aminopropionitrile-induced מפרצת אבי העורקים, דיסקציה

אנו מתארים פרוטוקול לזירוז טרשת עורקים אצל שורש אבי העורקים ספקיות- / - עכברים שקיבלו עם דיאטה atherogenic, באמצעות שחרור רצוף של אלדוסטרון. שיטות לאפיון הרכב הפלאק מתוארים גם.

אינדוקציה של הפלאק טרשת עורקים באמצעות הפעלה של מינרלוקורטיקואידים הקולטנים בעכברים אפוליפופרוטאין E לקויה

אנו מציעים פרוטוקול מתוקננים כדי לאפיין את ההרכב הסלולר של נגעים טרשת עורקים מאתר בשלב מאוחר, כולל שיטות שיטתית של דיסקציה בעלי חיים, רקמות הטבעה, חלוקתה, מכתים, וניתוח של העורקים brachiocephalic מ atheroprone שריר חלק תא שושלת היוחסין עקיבה עכברים.

ניתוח כמותי של הרכב הסלולר בנגעים טרשת עורקים מתקדמת של שריר חלק תא שושלת היוחסין-עקיבה עכברים

מודלים murine של טרשת עורקים הם כלים שימושיים כדי לחקור מסלולים פתוגניים ברמה מולקולרית, אבל דורשים קוונפיקציה סטנדרטית של פיתוח נגעים. פרוטוקול זה מתאר שיטה ממוטבת כדי לקבוע את גודל הנגעים בכלי העורקים העיקריים, כולל שורש אבי העורקים, קשת אבי העורקים, ועורק ברככתית.

קוונפיקציה של טרשת עורקים בעכברים

פרוטוקול זה מספק הליך שלב אחר שלב לניתוח נטל טרשת עורקים בעכברים. חוקרים יכולים להשתמש בפרוטוקול זה כדי להשוות את השפע, המיקום והגודל של נגעים טרשת עורקים בבעלי חיים שונים.

הדמיה וניתוח של שמן אדום O מוכתם כולו אבי העורקים נגעים במודל עכבר היפרליפידמיה מפרצת

כאן, אנו מציגים פרוטוקולים אופטימליים לניקוי רקמות כדי לדמות את אבי העורקים העכברי בתלת מימד (3D). אנו מתארים נהלים חדישים לצביעה חיסונית, ניקוי אופטי והדמיה מתוך כוונה להגדיר את הקרבה האנטומית של מערכת העצבים ההיקפית עם פלאק טרשת עורקים והאדוונטיטיה בטרשת עורקים.

הדמיה תלת מימדית של רקמות אבי העורקים בטרשת עורקים

פרוטוקול זה מספק מתודולוגיה מקיפה לניתוח כמותי של פלאק טרשת עורקים כדי להקל על מחקר מעמיק יותר על המנגנונים וההתקדמות של טרשת עורקים.

בידוד וניתוח של נגעי קשת אבי העורקים ושורש במודל עכבר טרשת עורקים

התקדמות בספקטרומטריית מסות אפשרה ניתוח התפוקה הגבוהה של ביטוי חלבון ושינוי בשורה של רקמות. בשילוב עם חלוקת subcellular ומודלי מחלות, מסה כמותית ספקטרומטריית וביואינפורמטיקה יכולות לחשוף נכסים חדשים במערכות ביולוגיות. השיטה המתוארת כאן מנתחת חלבוני הכרומטין הקשורים בהגדרה של מחלות לב, והוא בקלות ישימה...

ניתוח הכמות של Proteomes הכרומטין במחלות

למד שיטות לאפיון וכימות נגעים טרשתיים בסינוס אבי העורקים של עכברים באמצעות היסטוכימיה ואימונוהיסטוכימיה. טכניקות אלו מאפשרות ניתוח מפורט של גודל ורכב הנגעים למחקר קרדיולוגי.

ניתוח כמותי ואפיון של נגעים טרשת עורקים בסינוס אבי העורקים של העכברים

גלה סרטונים נוספים