Name: Centrosomes הדמיה באשכים טוס (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-20T19:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 41 s
Description: למד טכניקות הדמיה לחלבונים צנטרוזומליים בזרעיות Drosophila במהלך סpermatogenesis. שיטות אלה מאפשרות זיהוי חלבונים חדשים והבנת התפקיד שלהם בביולוגיית הצנטרוזום ובחלוקת התא.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מענק (R01GM098394) מ-NIH והמכון הלאומי למדעי רפואה כלליים, כמו גם מענק 1,121,176 מקרן הלאומית למדע.

1. הכנת א אחר אשכים בשידור חי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן PBS על ידי המסת 8.0 גרם NaCl, 0.2 גרם KCl, 1.44 גרם Na 2 HPO 4, 0.24 גרם KH 2 PO 4 ב800 מיליליטר של מים מזוקקים ולהתאים את ה-pH 7.4. תביא את הנפח לL 1 ולעקר ידי מעוקר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבודד את האשכים כ27 שתוארו קודם לכן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את חיץ מכתים DAPI על ידי דילול 1 מ&quot;ג / מיליליטר מניות ל1 מיקרוגרם / מיליליטר PBS. השתמש בנייר אלומיניום כדי להגן על הצינור מפני אור ולאחסן ב -20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר בידוד האשכים, לטבול את הדגימה ב6 μl של חיץ מכתים DAPI על גבי מטען חשמלי חיובי שקופיות הזכוכית מיקרוסקופ ל10 דקות. אשכים לדבוק גם לשקופיות טעונות חיובי זמינות באופן מסחרי, המאפשרים מניפולציה קלה של הדגימה. שקופיות במטען חיובי קוולנטית שונו להקנות מטען חיובי סטטי למשטח הזכוכית. בדומה לציפוי polylysine, זה מקדם את האינטראקציה של wi האשכיםה פני השטח של השקופית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף DAPI העודף על ידי החלפת החיץ מכתים פעמיים עם 6 μl של PBS. השתמש בפיסת נייר סינון לפתיל משם החיץ לאחר כל שלב כביסה. השתמש בזהירות כמו שלא להסיר בטעות את האשכים יחד עם החיץ במהלך כל שטיפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 6 μl של PBS לדגימה. הסכום של חיץ המשמש צריך להיות מותאם לגודל של coverslip. הכרכים הניתנים בפרוטוקול זה הם עבור coverslip מ&quot;מ 18 x 18. אופציונאלי: מומלץ לנקב את האשכים קרובים את המיקום היחסי של סוג התא של עניין. זה יבטיח כי יש לחץ מינימאלי על תאים אלה במהלך השלב למעוך, ובכך שמירה על שלמותם. פירסינג של האשכים יכול להתבצע באמצעות סכין מנתחים חדים, נקי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות במקום coverslip על גבי הדגימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותם את הקצוות של coverslip באמצעות לק ברור כדי להבטיח שהמאגר לא מתאדה מן דגימת החיה בעת imהזדקנות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש סמן כדי לייעד את העמדה של האשכים על מנת להקל באיתור הדגימה בשקופית ולהמשיך להדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף חיץ מכתים DAPI עודף על ידי החלפת החיץ פעמיים עם 6 μl של PBS. השתמש בפיסת נייר סינון לפתיל משם החיץ לאחר כל שלב כביסה. היזהר שלא להסיר בטעות הדגימה יחד עם החיץ במהלך כל שטיפה. </li></ol> 2. מסלול ב &#39;הכנת אשכים קבועים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את חיץ תקן על ידי דילול 37% מניות פתרון פורמלדהיד ב PBS לריכוז סופי של פורמלדהיד .3.7% ב 1x PBS </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את חיץ מכתים DAPI על ידי דילול מניות 1 מ&quot;ג / מיליליטר DAPI עד 1 מיקרוגרם / מיליליטר PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטבול את האשכים בירידת μl 6 של PBS על גבי מטען חשמלי חיובי שקופיות מיקרוסקופ הזכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באופן ידני לכוון את האשכים באופן ליניארי או אחרת מועדף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בפיסת נייר סינון לפתיל משם PBS ולהחליף אותו עם 6 μl של תקןחיץ במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בפיסת נייר סינון לפתיל משם חיץ תקן ולטבול את הדגימה ב6 μl של חיץ מכתים DAPI 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות במקום coverslip מ&quot;מ 18 x 18 על גבי הדגימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותם את הקצוות של coverslip באמצעות לק ברור כדי להבטיח שהמאגר לא מתאדה מן הדגימה בזמן ההדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש סמן כדי לייעד את העמדה של האשכים על מנת להקל באיתור הדגימה בשקופית ולהמשיך להדמיה. </li></ol> 3. מסלול ג הכנת אשכי immunostained siliconization coverslip: לטבול את coverslips מ&quot;מ מרובה 18 x 18 במגש קטן המכיל פתרון siliconizing דגירה במשך 1 דקות בטמפרטורת חדר מתחת למכסת מנוע קטר. ודא כי coverslips נחשפים באופן מלא ולא נערם על גב אחד את השני. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הדגימה ב5 טיפת μl של PBS על coverslip siliconized. אוריינטאשכים כרצויים ולנקב את האשכים באמצעות אזמל חד. מניח בעדינות במטען חיובי שקופיות מיקרוסקופ הזכוכית מעל coverslip, המאפשר PBS להפוך מפוזר באופן שווה בין coverslip והשקופיות. השתמש בפיסה קטנה של נייר סינון לפתיל משם עודפי החיץ בין coverslip והשקופיות. כחיץ הוסר על ידי נייר הסינון, העלייה בלחץ תהיה למחוץ את האשכים. צריכה להיות מוכנות דגימות רבות בו זמנית, כפי שחלקם עשוי להיות אבד או ניזוקו במהלך הפרוטוקול. חרט זכוכית ניתן להשתמש כדי לתייג את השקופיות אם סוגים שונים של דגימות יהיו מוכנים בו זמנית. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את coverslips 3x דקות 1 כל אחד במים, ואחריו 3x דקות 1 כל אחד ב70% אתנול, ולשטוף סופי ל1 דקות במים. לאפשר את coverslips siliconized אוויר יבש מתחת למכסת מנוע קטר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרוק את השקופיות לתוך חנקן נוזלי ולאפשר את הדגימה להקפאה ל5-10 דק &#39;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את השקופיות מliquid חנקן באמצעות מלקחיים גדולים. השתמש באזמל כדי להסיר את coverslip במהירות. הדגימה צריכה להישאר בשקופית. היזהר שלא למרוח את הדגימה במהלך תהליך זה על ידי הזזה coverslip לאורך השקופיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה השקופיות במתנול prechilled בצנצנת מכתים Coplin הזכוכית ב -20 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת השקופיות לצנצנת מכתים Coplin זכוכית המכילה אצטון prechilled ב -20 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את שקופיות דקות 1 ב PBS בטמפרטורת חדר באמצעות צנצנת מכתים Coplin זכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן PBST-B על ידי השלמת PBS עם 0.1% Triton-X100 ו1% סרום חלבון שור (BSA). 5% בסרום נורמלי מאותו מין המארח כנוגדנים משני (משלב 3.14) עשוי לשמש במקום BSA כדי להפחית את רעשי רקע המופקים משני נוגדנים ספציפיים מחייב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה השקופיות עבור 10 דקות בPBST-B בצנצנת מכתים Coplin זכוכית לחסום אתרים ספציפיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא את הבארות שלתא הלחות עם מים. לחות בתוך החדר תהיה למזער את האידוי של פתרונות נוגדן מהדגימה במהלך שלבי הדגירה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן PBST-BR ידי להשלים PBST-B עם 100 מיקרוגרם / מיליליטר RNase א RNase מדרדרת RNA בדגימה ומשמש גם כסוכן חסימה נוסף על ידי קליטה חזקה למשטח הזכוכית. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח חתיכת סנטימטר כ 1x1 של Parafilm על גבי הדגימה כדי להפיץ את פתרון הנוגדנים באופן שווה ולהגן על פתרון נוגדנים ממתאדים. סגור את תא הלחות ודגירת הדגימה בנוגדן הראשוני במשך שעה 1 בטמפרטורת חדר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את השקופיות מPBST-B. השתמש בפיסת נייר סינון לייבש את האזור של השקופית סביב הדגימה, תוך שימוש בזהירות לא לייבש את הדגימה עצמו. לבסוף, במקום להחליק בתא הלחות עם הדגימה פונה כלפי מעלה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות להוסיף של נוגדן ראשוני 100 μl בדילול מלא בPBST-BR על גבי המפרטimen (1:200 הוא בדרך כלל ריכוז התחלה טוב לנוגדני uncharacterized). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כסה את הדגימה עם פיסת 1 סנטימטר x 1 כ של Parafilm ולסגור את תא הלחות. דגירה הדגימה בשני נוגדנים במשך שעה 1 בטמפרטורת חדר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את תא הלחות ולהשתמש במלקחיים כדי להסיר בעדינות Parafilm מהשקופיות. דגירה השקופיות במשך 5 דקות בPBST בצנצנת מכתים Coplin זכוכית בטמפרטורת חדר לשטוף. חזור על תהליך זה עבור סכום כולל של שלושה שוטף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את השקופיות מPBST-B ולמקם אותם בתא הלחות עם הדגימה פונה כלפי מעלה. בעדינות להוסיף של נוגדנים משני 100 μl בדילול מלא בPBST-BR בחלק העליון של הדגימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את תא הלחות ולהשתמש במלקחיים כדי להסיר בעדינות Parafilm מהשקופיות. שוב, לשטוף 3x הדגימה במשך 5 דקות כל אחד בPBST בצנצנת מכתים Coplin זכוכית ואחריו 3x עבור 5 דקות כל אחד ב-PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש Kimwipe ונייר סינון כדי<html> לייבש היטב את פני השטח של השקופית, להיות זהיר, כדי למנוע מגע או ייבוש הדגימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 6 μl של מדיה הרכבה לדגימה, מכסה בcoverslip נקי (לא מצופה סיליקון), ואת חותם קצוות עם לק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש סמן כדי לייעד את העמדה של האשכים על מנת להקל באיתור הדגימה בשקופית ולהמשיך להדמיה. </li></ol> 4. הערות הדמיה הדמיה יכולה להיות מושגת באמצעות זקופה או הפוכה מיקרוסקופ אור רגילה או מיקרוסקופ confocal. זה חשוב שיהיה מצויד במיקרוסקופ שלב בניגוד, במיוחד עבור ההדמיה של דגימות אשכים חיים (מסלול א &#39;). תכונה זו הפכה זמינה לאחרונה על מיקרוסקופים confocal. כאשר האשכים לפרוץ באופן ספונטני (המסלול א &#39;), הקצה (נובע אזור תא) נשמר בדרך כלל בשלמות, והוא קל לזיהוי, המספק סמן טוב בתחילה לאתר ולהשתמש לשם התמצאות. _content &quot;&gt; Centrioles הם מבנים קטנים למדי ויש לקחת תמונות ולכן באמצעות 63X או 100X יעדים, גורם זום של 4-6X, ורזולוציה של לפחות 512 x 512 פיקסלים במידת האפשר.

<ol><li>Blachon, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+proximal+centriole-like+structure+is+present+in+Drosophila+spermatids+and+can+serve+as+a+model+to+study+centriole+duplication%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A proximal centriole-like structure is present in Drosophila spermatids and can serve as a model to study centriole duplication.</a> Genetics. 182, 133-144 (2009).</li>
<li>Hennig, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spermatogenesis+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+journal+of+developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Spermatogenesis in Drosophila.</a> The International journal of developmental biology. 40, 167-176 (1996).</li>
<li>Fabian, L., Brill, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+spermiogenesis%3A+Big+things+come+from+little+packages%5BTitle%5D)+AND+%22Spermatogenesis%22%5BJournal%5D)">Drosophila spermiogenesis: Big things come from little packages.</a> Spermatogenesis. 2, 197-212 (2012).</li>
<li>White-Cooper, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+gene+regulation+during+Drosophila+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of gene regulation during Drosophila spermatogenesis.</a> Reproduction. 139, 11-21 (2010).</li>
<li>Davies, E. L., Fuller, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+self-renewal+and+differentiation+in+adult+stem+cell+lineages%3A+lessons+from+the+Drosophila+male+germ+line%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Symp+Quant+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulation of self-renewal and differentiation in adult stem cell lineages: lessons from the Drosophila male germ line.</a> Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 73, 137-145 (2008).</li>
<li>Belote, J. M., Zhong, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Duplicated+proteasome+subunit+genes+in+Drosophila+and+their+roles+in+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Heredity%22%5BJournal%5D)">Duplicated proteasome subunit genes in Drosophila and their roles in spermatogenesis.</a> Heredity. 103, 23-31 (2009).</li>
<li>Xiao, X., Yang, W. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin-based+dynamics+during+spermatogenesis+and+its+significance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Zhejiang+University.+Science.+B%22%5BJournal%5D)">Actin-based dynamics during spermatogenesis and its significance.</a> Journal of Zhejiang University. Science. B. 8, 498-506 (2007).</li>
<li>Hennig, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomal+proteins+in+the+spermatogenesis+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">Chromosomal proteins in the spermatogenesis of Drosophila.</a> Chromosoma. 111, 489-494 (2003).</li>
<li>Wakimoto, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Doubling+the+rewards%3A+testis+ESTs+for+Drosophila+gene+discovery+and+spermatogenesis+expression+profile+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+research%22%5BJournal%5D)">Doubling the rewards: testis ESTs for Drosophila gene discovery and spermatogenesis expression profile analysis.</a> Genome research. 10, 1841-1842 (2000).</li>
<li>Avidor-Reiss, T., Gopalakrishnan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Building+a+centriole%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Building a centriole.</a> Curr Opin Cell Biol. , (2012).</li>
<li>Blachon, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+asterless+and+vertebrate+Cep152+Are+orthologs+essential+for+centriole+duplication%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Drosophila asterless and vertebrate Cep152 Are orthologs essential for centriole duplication.</a> Genetics. 180, 2081-2094 (2008).</li>
<li>Basto, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flies+without+Centrioles%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Flies without Centrioles.</a> Cell. 125, 1375-1386 (2006).</li>
<li>Mottier-Pavie, V., Megraw, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+bld10+is+a+centriolar+protein+that+regulates+centriole%2C+basal+body%2C+and+motile+cilium+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Drosophila bld10 is a centriolar protein that regulates centriole, basal body, and motile cilium assembly.</a> Mol Biol Cell. 20, 2605-2614 (2009).</li>
<li>Rodrigues-Martins, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DSAS-6+Organizes+a+Tube-like+Centriole+Precursor%2C+and+Its+Absence+Suggests+Modularity+in+Centriole+Assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">DSAS-6 Organizes a Tube-like Centriole Precursor, and Its Absence Suggests Modularity in Centriole Assembly.</a> Curr Biol. 17, 1465-1472 (2007).</li>
<li>Stevens, N. R., Dobbelaere, J., Brunk, K., Franz, A., Raff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+Ana2+is+a+conserved+centriole+duplication+factor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Drosophila Ana2 is a conserved centriole duplication factor.</a> J Cell Biol. 188, 313-323 (2010).</li>
<li>Gopalakrishnan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sas-4+provides+a+scaffold+for+cytoplasmic+complexes+and+tethers+them+in+a+centrosome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Sas-4 provides a scaffold for cytoplasmic complexes and tethers them in a centrosome.</a> Nat Commun. 2, 359(2011).</li>
<li>Gopalakrishnan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tubulin+nucleotide+status+controls+Sas-4-dependent+pericentriolar+material+recruitment%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Tubulin nucleotide status controls Sas-4-dependent pericentriolar material recruitment.</a> Nat Cell Biol. 14, 865-873 (2012).</li>
<li>Riparbelli, M. G., Callaini, G., Megraw, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+and+persistence+of+primary+cilia+in+dividing+Drosophila+spermatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Assembly and persistence of primary cilia in dividing Drosophila spermatocytes.</a> Dev Cell. 23, 425-432 (2012).</li>
<li>Maines, J. Z., Wasserman, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-transcriptional+regulation+of+the+meiotic+Cdc25+protein+Twine+by+the+Dazl+orthologue+Boule%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Post-transcriptional regulation of the meiotic Cdc25 protein Twine by the Dazl orthologue Boule.</a> Nat Cell Biol. 1, 171-174 (1999).</li>
<li>Herrmann, S., Amorim, I., Sunkel, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+POLO+kinase+is+required+at+multiple+stages+during+spermatogenesis+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">The POLO kinase is required at multiple stages during spermatogenesis in Drosophila melanogaster.</a> Chromosoma. 107, 440-451 (1998).</li>
<li>Yamashita, Y. M., Jones, D. L., Fuller, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orientation+of+asymmetric+stem+cell+division+by+the+APC+tumor+suppressor+and+centrosome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Orientation of asymmetric stem cell division by the APC tumor suppressor and centrosome.</a> Science. 301, 1547-1550 (2003).</li>
<li>Dix, C. I., Raff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+Spd-2+Recruits+PCM+to+the+Sperm+Centriole%2C+but+Is+Dispensable+for+Centriole+Duplication%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Drosophila Spd-2 Recruits PCM to the Sperm Centriole, but Is Dispensable for Centriole Duplication.</a> Curr Biol. , (2007).</li>
<li>Stevens, N. R., Dobbelaere, J., Wainman, A., Gergely, F., Raff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ana3+is+a+conserved+protein+required+for+the+structural+integrity+of+centrioles+and+basal+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Ana3 is a conserved protein required for the structural integrity of centrioles and basal bodies.</a> J Cell Biol. 187, 355-363 (2009).</li>
<li>Giansanti, M. G., Bucciarelli, E., Bonaccorsi, S., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+SPD-2+Is+an+Essential+Centriole+Component+Required+for+PCM+Recruitment+and+Astral-Microtubule+Nucleation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Drosophila SPD-2 Is an Essential Centriole Component Required for PCM Recruitment and Astral-Microtubule Nucleation.</a> Curr Biol. , (2008).</li>
<li>Januschke, J., Llamazares, S., Reina, J., Gonzalez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+neuroblasts+retain+the+daughter+centrosome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Drosophila neuroblasts retain the daughter centrosome.</a> Nat Commun. 2, 243(2011).</li>
<li>Cheng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centrosome+misorientation+reduces+stem+cell+division+during+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Centrosome misorientation reduces stem cell division during ageing.</a> Nature. 456, 599-604 (2008).</li>
<li>Zamore, P. D., Ma, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Drosophila+melanogaster+testes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of Drosophila melanogaster testes.</a> J. Vis. Exp. , e2641(2011).</li>
<li>Fuller, M. T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFuller%2C+MT+%22The+Development+of+Drosophila+melanogaster%22">The Development of Drosophila melanogaster</a>. Bate, M., Martinez-Arias, A. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 71-174 (1993).</li>
<li>Cenci, G., Bonaccorsi, S., Pisano, C., Verni, F., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+and+microtubule+organization+during+premeiotic%2C+meiotic+and+early+postmeiotic+stages+of+Drosophila+melanogaster+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci.+%22%5BJournal%5D)">Chromatin and microtubule organization during premeiotic, meiotic and early postmeiotic stages of Drosophila melanogaster spermatogenesis.</a> J Cell Sci. . 107 (Pt. 12), 3521-3534 (1994).</li>
<li>White-Cooper, H., Schafer, M. A., Alphey, L. S., Fuller, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+and+post-transcriptional+control+mechanisms+coordinate+the+onset+of+spermatid+differentiation+with+meiosis+I+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Transcriptional and post-transcriptional control mechanisms coordinate the onset of spermatid differentiation with meiosis I in Drosophila.</a> Development. 125, 125-134 (1998).</li>
<li>Yamashita, Y. M., Mahowald, A. P., Perlin, J. R., Fuller, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asymmetric+inheritance+of+mother+versus+daughter+centrosome+in+stem+cell+division%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Asymmetric inheritance of mother versus daughter centrosome in stem cell division.</a> Science. 315, 518-521 (2007).</li>
<li>Tates, A. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTates%2C+AD+%22Cytodifferentiation+during+Spermatogenesis+in+Drosophila+melanogaster%3A+An+Electron+Microscope+Study%22">Cytodifferentiation during Spermatogenesis in Drosophila melanogaster: An Electron Microscope Study</a>. , Rijksuniversiteit de Leiden. Leiden, Netherlands. (1971).</li>
<li>Baker, J. D., Adhikarakunnathu, S., Kernan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanosensory-defective%2C+male-sterile+unc+mutants+identify+a+novel+basal+body+protein+required+for+ciliogenesis+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Mechanosensory-defective, male-sterile unc mutants identify a novel basal body protein required for ciliogenesis in Drosophila.</a> Development. 131, 3411-3422 (2004).</li>
<li>Avidor-Reiss, T., Gopalakrishnan, J., Blachon, S., Polyanovsky, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAvidor-Reiss%2C+T+%22The+Centrosome%3A+Cell+and+Molecular+Mechanisms+of+Functions+and+Dysfunctions+in+Disease%22">The Centrosome: Cell and Molecular Mechanisms of Functions and Dysfunctions in Disease</a>. Schatten, H. , Humana Press. (2012).</li>
<li>Gopalakrishnan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembling+SAS-6+multimer+is+a+core+centriole+building+block%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Self-assembling SAS-6 multimer is a core centriole building block.</a> J Biol Chem. 285, 8759-8770 (2010).</li>
<li>Hassell, J., Hand, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+fixation+with+diimidoesters+as+an+alternative+to+aldehydes.+I.+Comparison+of+cross-linking+and+ultrastructure+obtained+with+dimethylsuberimidate+and+glutaraldehyde%5BTitle%5D)+AND+%22The+journal+of+histochemistry+and+cytochemistry+%3A+official+journal+of+the+Histochemistry+Society%22%5BJournal%5D)">Tissue fixation with diimidoesters as an alternative to aldehydes. I. Comparison of cross-linking and ultrastructure obtained with dimethylsuberimidate and glutaraldehyde.</a> The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 22, 223-229 (1974).</li>
<li>Pisano, C., Bonaccorsi, S., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+kl-3+loop+of+the+Y+chromosome+of+Drosophila+melanogaster+binds+a+tektin-like+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The kl-3 loop of the Y chromosome of Drosophila melanogaster binds a tektin-like protein.</a> Genetics. 133, 569-579 (1993).</li>
</ol>

גישה חופשית לפרסום זה נתמכה על ידי Leica Microsystems.

לומד ביולוגיה centrosome באשכים לטוס באמצעות סמנים גנטי centrosomal מתויגים הוא שיטה יעילה להערכת תפקוד ופעילות centrosome בשני הקשר wild-type ו מוטציה. בפרט, המסלול מתאים לסינון מהיר של ליקויים centrosomal כגון מום, misegregation, חוסר יציבות, או אורך חריג במאמץ לזהות מוטציות חדשות. יתר על כן, cilia spermatid בהכנות חיות יישאר ניעה כ 15 דקות לאחר הנתיחה והשימוש באשכים חיים במסלול א &#39;מאפשר גם תנועתיות זרע להיות לטפל בקלות. מאז הפעילות של cilia ניעתי זרע קשור באופן ישיר לתפקוד centrosome, ניתן לבצע מבחני כדי לקבוע את ההשפעות של מוטציות centrosomal שונות על תפקוד הריסים. מסלול ב &#39;יכול לשמש לתצפיות ספציפיות יותר במיוחד כאשר הנתונים סטטיסטיים נדרשים כגון לספירת מספר centrioles לכל תא ואו מספר התאים לציסטה. מסלול C הוא הכי useful לתצפיות מפורטות הדורשות צביעה עם נוגדנים. דוגמאות כוללות תיוג של סוג תא מסוים, כגון תאי גזע, מכתים של חלבון שאין לו תג זמין כגון טובולין acetylated, או כדי לאמת את העדר או mislocalization של חלבון שבעבר מוטציה. כאשר ההדמיה centrosomes ומבנים הקשורים בcentrosome, באמצעות סמנים גנטי מתויגים ולא נוגדנים היא לא רק באופן ניסיוני קלה יותר, אלא גם מספק תוצאות חזקות יותר ושחזור. לכן, השימוש בחלבוני centrosomal גנטי מתויגים הוא גישה אמינה לניתוחים מכניסטית וכמותיים הדורשים סט נתונים גדול. לדוגמא, השימוש בסמנים גנטי centrosomal מתויגים כבר בעל ערך במיוחד עבור כימות של אורך centriole. ניתוח כזה גילה כי מוטציות שונות יכולות להיות מסווגת לשתי קטגוריות המבוססות על ההשתנות באורך centriole. קטגוריה אחת כוללת מוטציות שchanאורך centriole ge אך אינו משפיע על סטיית תקן 1 והקטגוריה השנייה כולל מוטציות שמשפיעות הן אורך centriole וסטיית התקן באורך 11. נתונים כמותיים מסוג זה יכול לספק תובנות שימושיות לפונקציה של גנים centrosomal מסוימים. מוטציות centrosomal כי תערוכת אורך centriole פגום עם עלייה בסטיית התקן עשויות להיות בשל התערערות מבנה centriolar. עם זאת, אורך centriole פגום עם שגיאה סטנדרטית רגילה עשוי להצביע על כך שהמוטציה אינה מבנית לערער centriole ויש יותר סיכוי להיות בגלל שינוי במנגנון ויסות שליטה אורך centriole. בשל חוסר עקביות בimmunostaining, ניתוחים כמותיים קשים עם השימוש בסמני נוגדן לבד. Centrosome הוא מבנה גדול ומורכב חלבוניים ורבים מהחלבונים שלה נמצאים רק בתוך הפנים שלה. שימוש centrosomal גנטי מתויגסמנים ולא הנוגדנים מאפשר לתייג באופן עקבי ברכיבים פנימיים של centrosome שאפיטופים עשויים להיות נגיש בדרך אחרת לסמני נוגדן. לדוגמא, מחקרי לוקליזציה של Bld10 באמצעות נוגדנים מוצאים את החלבון להיות מועשרים בקצות דיסטלי ופרוקסימלי של centriole 13, בעוד Bld10-GFP מציג התפלגות אחידה יותר 1. עם זאת, חשוב גם לקחת בחשבון את רמת ביטוי של חלבון גנטי בתיוג מסוים, כמו זה יכול להשפיע על חלוקת חלבון. לוקליזציה של Sas-4-GFP ו-SAS-6-GFP הביעה תחת אנדוגני מוגבל לקצוות הפרוקסימלי של centriole 1,16,35 מצד השני, Sas-4-GFP ו-SAS-6-GFP הביעו תחת אמרגן היוביקוויטין חזק הם נקודתיים לאורך כל אורכו של 12,14 centriole. שיקול חשוב נוסף הוא ההשפעה של התג הגנטי על תפקוד חלבון. ניתוח אם חלבונים גנטיים מתויגים הם פונקציונליים יכול להיות tesטד על ידי החדרת החלבון המהונדס לתוך רקע מוטציה ובודק אם החלבון המהונדס מציל פנוטיפ מוטנטי. קיבוע של האשכים דרוזופילה יכול להתבצע באמצעות מגוון של fixatives הכימי. כאן, אנו מתארים קיבעון עם שני פורמלדהיד (מסלול ב &#39;) ומתנול אצטון (המסלול C). עם זאת, גם מקבע ניתן להשתמש לסירוגין ומאז fixatives השונים עלול לשבש כימי אפיטופים נוגדנים מקומיים, מבחר של המקבע המתאים לimmunostaining חייב להיקבע באופן ניסיוני. Fixatives ותנאי הדגירה הבאים בדרך כלל מועסקים: פורמלדהיד .3.7%, 5 דקות בטמפרטורת חדר; מתנול, 15 דקות ב -20 מעלות צלזיוס; אצטון, 10 דקות ב -20 ° C; מתנול, 15 דקות ב -20 ° C. אחרי אצטון, 30 שניות ב-20 מעלות צלזיוס; אתנול, 20 דקות ב -20 ° C. למרות קיבעון עם אצטון, מתנול, אתנול ואינו דורש צעד permeabilization מורחב עבור immunostaining, wi קיבעוןפורמלדהיד ה צריך להיות מלווה דגירה 1 שעות בPBST-B בטמפרטורת חדר כדי permeabilize קרום תא ומאפשר גישת נוגדנים לאפיטופים תאיים. יתר על כן, fixatives מסוים הם מתאים יותר לאנטיגנים מסוימים. לדוגמא, פונקציות פורמלדהיד גם לקיבוע של חלבונים קטנים, ואילו מתנול ואצטון הם מתאימים היטב לקיבעון של קומפלקסים מולקולריים גדולים 36. Immunostaining של האשכים דרוזופילה כבר תואר בעבר על קיום מבני הכרומטין וmicrotubule שלד תא 29,37. כאן (המסלול C), ההליך כבר מותאם לניתוח של מבני centrosomal המכילים חלבונים גנטיים מתויגים. אנו מספקים תיאור מפורט של הליך זה כדי להנחות את האנשים שהם חסרי ניסיון בעבודה באשכי דרוזופילה. הליך זה כולל גם שינויים כדי לשפר את השימור ומורפולוגיה של אשכים, כגון על ידי שימוש שלiliconized coverslips ומטען חשמלי חיובי שקופיות מיקרוסקופ הזכוכית.

האשכים דרוזופילה הם מערכת איברים מתאימה ללמוד מגוון רחב של תהליכים תאיים והתפתחותית וכבר נסקרו בהרחבה לאורך השנים 1-9. כתב יד זה מתמקד בשימוש באשכי דרוזופילה ללמוד centrosome, אברון סלולארי שימור. כמו במערכות אחרות, centrosome של פונקצית האשכים דרוזופילה במיטוזה, מיוזה, וciliogenesis 10. Centrosomes מורכב של זוג מבנים מבוסס microtubule המכונים centrioles המוקף ברשת חלבון מורכבת התייחסה לחומר pericentriolar כ( PCM). צמד centriole מורכב מcentriole אמא מבוגרת וcentriole בת צעירה יותר. כתא מתקדם לקראת מיטוזה, שני centrioles להפריד, לשכפל, ולרכוש כמות גדולה של PCM כדי ליצור סופו של דבר שני centrosomes מובחן. Centrosome מכיל centriole אמא המקורית שמכונה centrosome האמא וcentrosome מכיל centriole הבת המקורית שמכונה centrosome הבת. האשכים דרוזופילה הם אידיאליים ללימוד הבסיס המולקולרי של הביולוגיה centrosome ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי עבור מגוון רחב של סיבות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רוב חלבוני דרוזופילה הנדרשים לביולוגיה centrosome באשכים הם נשמרים בין אאוקריוטים, המצביעים על כך תובנה רלוונטית לביולוגיה centrosome בבני אדם ומינים אחרים יכולה להיות שנרכשו על ידי לימוד centrosome בדרוזופילה אשכים 1,11-14. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביצוע ניתוח שעבר מוטציה בדרוזופילה מספק יתרון משמעותי שכן, שלא כמו דגמים רבים אחרים, מוטציות centrosomal בדרוזופילה אינן עובריים קטלניות, ובכך מאפשרות לניתוח גנטי קלאסי של תפקוד centrosome. תכונה ייחודית זו של דרוזופילה היא בשל נוכחותם של תרומה אימהית שנמשכת בשלבים הקריטיים של develo העובריpment. 1,11-14. לכן, אפשר) מוטציות מחקר שמונעות לחלוטין היווצרות centrosome וב) ללמוד את גורלו של centrosome נורמלי שהוקם בעובר המוקדם על ידי תרומה אימהית בהקשר מוטציה לאחר התרומה האימהית מוצתה עד תום (העיקרון של השיטה מתואר ב11). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> transgenes פונקציונלי עם תגי ניאון מקודדים גנטי שתווית centrosome זמין. רבים מקווים אלה להשתמש אמרגנו של החלבון לנהוג שעתוק של transgene כדי למנוע ביטוי יתר חזק. הדבר חשוב במיוחד משום שביטוי יתר של חלבונים לעתים קרובות תוצאות חפצים המפריעים לניתוח של תפקוד centrosome 1,11. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Centriole וcentrosome הם ייחודי ארוך לאורך spermatogenesis דרוזופילה, ובכך מאפשר לניתוח מהיר וקל של centrosome ידי הדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צעדים רצופים בתאי זרע וב centrosomeiology מאורגן כרונולוגי לאורך האשכים, שמתחיל בקצה האשך עם centrosomes של תאי גזע זרע ומסתיים בחלק התחתון של האשכים עם גודל מופחת centrosome ופעילות בתאי זרע בוגרים (איורים 1 ו -2). זה מאפשר זיהוי קל וניתוח של פונקצית centrosome במהלך שלבים שונים של התפתחות זרע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אשכים בקלות גזורים מזחלי זכר, גלמים, ומבוגרים 27. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך spermatogenesis, centrosome וcentrioles להמשיך דרך הלחנה מרובה, מבנית ותפקודיות מדינות לתפקד במיטוזה, מיוזה, והיווצרות cilium. במהלך תהליכים אלה, מרכיב centrosome, כפילויות, נודד, עוגנים לחלקים ספציפיים של התא, מתבגר, חילוק, ויוצר cilium. יתר על כן, centriole של spermatid הבוגר מוליד מבשר centriolar בשם PCL 1. גם בspermatid הבוגר, centrosome עובר תהליך גalled הפחתת centrosome לפיה היא מאבדת את מרכיבים רבים של PCM וcentriole (איורים 1 ו -2). לפיכך, מחקרים באשכים לאפשר אחד כדי לטפל בהיבטים רבים של החיים centrosome כגון שמירת centrosome בתאי הגזע, שכפול centriole, יציבות centriole, התארכות centriole, הפרדה והפרדת centriole, גיוס PCM, ciliogenesis, היווצרות PCL, הפחתת centrosome, ו התגרענות microtubule האסטרלי בין יתר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבסוף, מחקרים של הביולוגיה centrosome נעזרים במאפיינים ידועים האחרים של דרוזופילה שהפכו אותו לאורגניזם מודל מועדף למחקרים ביולוגיים. אלה כוללים זמן דור קצר, קל גנטיקה, כמו גם mutagenesis האקראי ומכוון באתר. </li></ol> יחד, המאפיינים שצוינו לעיל של האשכים דרוזופילה מספק מודל שבו centrosome ניתן ללמוד על ידי הדמיה קלה, מהירה, ומפורטת. הטכניקות מתוארותבמאמר זה יושמו כדי לחקור היבטים רבים של הביולוגיה centrosome הכוללים השקעת centriole 11, שכפול centriole 15, גיוס PCM 16, הרגולציה centrosome 17, וciliogenesis 18. טכניקות אלה גם יושמו ללמוד centrosome בתחומים אחרים של ביולוגיה כגון ויסות meiotic 19, הרכבה ציר 20, ופעילות centrosome בתאי גזע סימטרי חלוקת 21 בקרב רבים אחרים. הדמיה של אשכים בהתחלות centrosome עם קבלת זבובים המבטאים חלבוני centrosomal גנטיים מתויגים ולבודד את האשכים מזחלי זכר, גלמים, או זבובים בוגרים. זבובים אלה זמינים ממספר קבוצות מחקר 1,11,15,22-25. האשכים הזחל מכילים את כל השלבים של תאי זרע לפני מיוזה ושימושיים בעת ניתוח מוטציות שאינן קטלניים בגולם או מבוגר. עם זאת, גלמים המאוחר או אדיו צעיריםהאשכים LT הם חזקים ביותר ומכילים את כל מראש ופוסט meiotic השלבים של תאי זרע, ובכך הופכים אותם עדיפים לניתוח. מאז את מספר תאי זרע יורד ככל שהגיל לטוס, השימוש באשכים למבוגרים מתאים גם ללימוד centrosome בהקשר של הזדקנות. 26. שיטה של בידוד אשך מזבובים בוגרים כבר תוארה בעבר 27. הדמיה של centrosomes ותפקודם באשכי דרוזופילה יכולה להיות מושגת באמצעות שלושה מסלולים נלווים שמוצגים כאן (איור 3). בחירת המסלול שהוא מתאים ביותר תלויה באופי השאלה החוקר הוא פונה. המסלול כולל הדמיה של אשכים בשידור חי. זה המהיר ביותר מבין שלושת המסלולים, אבל יכול להיות מיושם רק כאשר דגימות לא צריכה להישמר וכאשר immunostaining אינו נדרש. במסלול א &#39;, אשכים הם רכובים (שלמים, פירסינג או לחתוך) בשקופיותומעך בזהירות מתחת coverslip כדי ליצור שכבה אחת של תאים לזיהוי בקלות. לאחר מכן התאים מדגימים בעזרת שני מיקרוסקופ שלב בניגוד ומיקרוסקופ פלואורסצנטי. השימוש בשלב בניגוד חשוב במיוחד עבור הניתוח של האשכים דרוזופילה משום שהוא חושף מידע סלולארי שאינו גלוי עם צורות אחרות של תאורה משודרת ובכך מאפשר זיהוי מהיר של שלבים שונים של התפתחות זרע 28,29. עם זאת, יש לעקוב אחר שני חסרונות עיקריים. ראשית, את השלמות הצורנית של תאים היא לעתים קרובות בסכנה ברגע שהאשכים מקרע. שנית, תאים מבולבל לעתים לנוע בתוך הדגימה, מה שהופך את ההדמיה של שכבות confocal מרובות בתוך אזור מוגדר קשה. על מנת לקדם את הניתוח של סוגי תאים ספציפיים, אשכים עשויים להיות פירסינג או לחתוך כדי לכוון את דרך קרעי האשך כזה שמועך תחת מינימאלי coverslip משפיע על המורפולוגיה של סוג התא של עניין. מסלול ב &#39;כולל קיבוע כימי של האשכים. מסלול זה דורש סכום ביניים של זמן להכנת דגימה ויש לו היתרון כי דגימות קבועות ניתן לשמור לניתוח מאוחר יותר. יתר על כן, קיבוע משמש להכנת מבנים תאיים נוקשה יותר, צמצום תנועה של הדגימה במהלך הדמיה. עם זאת, במיקרוסקופ שלב בניגוד הופך להיות הרבה פחות אינפורמטיבי לאחר קיבוע כימי, מה שהופך כמה שלבים של התפתחות הזרע קשה לזהות. מסלול C הוא הזמן האינטנסיבי ביותר, אבל יש יתרון הנוסף שמבנים הסלולר הם קבועים וimmunostained, המאפשר ההדמיה של חלבונים שאינם זמינים עם תגי הגנטיקה המתאימים. יש נוגדנים רבים זמינים באופן מסחרי והן מקבוצות מחקר שונות לimmunostaining centrosomes ומבנים הקשורים בcentrosome באשכי דרוזופילה.

<table><tbody><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>שקופיות טעונות חיובית</td><td>AZER Scientific</td><td>EMS200A +</td><td></td></tr> <tr><td>נוצה מיקרואזמל</td><td>אלקטרונים מיקרוסקופיה מדעית</td><td>72045-30</td><td></td></tr><tr><td>37% פורמלדהיד או פרפורמלדהיד</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>BP531-500</td><td></td></tr><tr><td>פוספט חוצץ מלח (PBS)</td><td>Boston Bioproducts</td><td>BM-220</td><td></td></tr><tr><td>18x18 מ"מ כיסויים מספר 1.5</td><td>VWR</td><td>48366 205</td><td></td></tr><tr><td>לק</td><td>אלקטרונים מדעי</td><td>72180</td><td></td></tr><tr><td>Sigmacote</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SL2-100 מ"ל</td><td></td></tr><tr><td>מתנול</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>A412-4</td><td></td></tr><tr><td>אצטון</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>A949-1</td><td></td></tr><tr><td>טריטון-X100</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>T9284-100ML</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>ג'קסון ImmunoResearch</td><td>001-000-162</td><td></td></tr><tr><td>RNAse A</td><td>5 פריים</td><td>2900142</td><td></td></tr><tr><td>נייר סינון</td><td>Whatman</td><td>1001-055</td><td></td></tr><tr><td>חרט זכוכית</td><td>Dremel</td><td>290-01</td><td></td></tr><tr><td>TCS SP5 מיקרוסקופ קונפוקלי</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>הרכבה מדיה</td><td>אלקטרונית מדעי המיקרוסקופיה</td><td>17985-10</td><td></td></tr><tr><td>תא לחות כתמים חיסוניים,</td><td>מדעי מיקרוסקופיית אלקטרונים</td> שחורים <td>62010-37</td><td></td></tr><tr><td>צנצנת מכתים מזכוכית קופלין, מדעי</td><td>מיקרוסקופיית אלקטרונים</td> עם מכסה בורג <td>70315</td><td></td></tr></tbody></table>

centrosomes הדמיה באשכים טוס

Imaging Centrosomes in Fly Testes

Centrosomes הם נשמרים האברונים מבוססי microtubule מבנו ותפקודו שינוי באופן דרמטי לאורך מחזור התא והתמיינות תאים. Centrosomes הם חיוני כדי לקבוע את ציר חלוקת תאים במהלך מיטוזה וכדי nucleate cilia בשלבי ביניים. זהותם של החלבונים המתווכים שינויים הדינמיים אלה נותר ידועים רק באופן חלקי, ותפקודם של רבים מהחלבונים שהיו מעורבים בתהליכים אלה הוא עדיין בסיסי. מחקר שנערך לאחרונה הראה כי תאי זרע דרוזופילה מספק מערכת רבת עוצמה לזיהוי חלבונים חדשים חיוניים לתפקוד והיווצרות centrosome כמו גם לקבל תובנות לתוך הפונקציה המסוימת של שחקנים ידועים בתהליכים הקשורים לcentrosome. דרוזופילה היא אורגניזם מודל גנטי שהוקם בו מוטציות ב ניתן להשיג בקלות גנים centrosomal בקלות ובנותחו. יתר על כן, ההתקדמות ברגישות וברזולוציה של מיקרוסקופ אורפיתוח של סמני centrosomal מתויגים גנטי חזקים הפכו את היכולת להשתמש באשכי דרוזופילה כמערכת מודל פשוטה ונגישה ללמוד centrosomes. מאמר זה מתאר את השימוש בסמנים גנטי centrosomal מתויגים לבצע מסכי גנטיים למוטציות centrosomal חדשות ולקבל תובנות לתוך התפקיד הספציפי של גנים שזוהו לאחרונה.

Centrosomes לעבור טרנספורמציות מורפולוגיות ופונקציונליות מרובות במהלך spermatogenesis. תכונה זו של תאי זרע הופכת את האשכים מערכת שימושית ללמוד היבטים שונים של הביולוגיה centrosome. תהליך נצפה בקלות אחד כזה הוא התארכות centrosome. בspermatogonia, סמן centriolar Ana1-GFP מסמן (איור 4 א) 0.6 מיקרומטר centriole הארוך. centriole זה מתארך במהלך spermatogenesis ומגיע באורך של 2.5 מיקרומטר בspermatids כמעט בוגר. מאז centrioles בזרע דרוזופילה הוא ארוך באופן ייחודי, הדמיה יכולה לשמש כדי להפוך את ההצהרות כמותיים לגבי התארכות centrosome (איור 4). ניתוח של אורך centriole יכול גם להתבצע ברקע מוטציה ומוטציות שונות זוהו לשנות צמיחת centriole (איור 5). דוגמאות לכך הן תמיד מוקדם (aly) ותותח (יכול), מוטציות שarresתאי זרע לא לפני תחילת המיוזה 30 אך לא לחסום את התארכות centriole. במוטציות האלה, centrioles של spermatocyte הבוגר לגדול לכ ~ מיקרומטר 2.4 בהשוואה לcentrioles של תאי שליטה בי להגיע למקסימום של 1.8 מיקרומטר. <img src="/files/ftp_upload/50938/50938fig1.jpg" alt="איור 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50938/50938fig1highres.jpg"> איור 1. תאי זרע וביולוגיה centrosome. א) פיתוח של תאי גזע וSpermatogonia. כל תאי הזרע שמקורם בתאי גזע נמצאו בקצה הקודקוד של האשכים. כל תא גזע מתחלק סימטרי כדי ליצור תאי גזע שיורש את centrosome אמו ואב זרע אב שיורש את centrosome בת 31 ב. כצורת Spermatogonia, הם הופכים להיות מוקפים 2 תאי ציסטה, שממשיכים להקיף את Spermatocytes וSpermatids ברחבי spermatogenesis. פעמים פער Spermatogonia 4 לייצר 16 Spermatogonia, המכיל שתי centrioles. B) פיתוח Spermatocytes ומיוזה. במהלך פיתוח Spermatocyte, centrioles לשכפל פעם נוספת כדי לייצר ארבע centrioles מאורגן בשני זוגות לכל תא ו64 centrioles לציסטה. מוקדם במהלך התפתחות Spermatocyte, כל centriole עובר לקרום הפלזמה, רציפים לזה, ומתארך ליצור מבנה שדומה לcilium עיקרי 18,32-34. בSpermatocytes הבוגר, אורך centriole מגיע ~ 1.8 מיקרומטר. Centrosomes לשחק תפקיד חיוני במיוזה. במהלך אני מיוזה, זוגות centriole שעדיין מחוברים למהלך קרום פלזמה לכיוון מרכז התא וליצור invaginations קרום תא בקצה הדיסטלי שלהם. PCM סביב centrioles גדל, nucleates microtubules האסטרלי, וcolocalizes עם מוט הציר. במהלך המעבר למיוזה השני, צמד centriole מפריד כך שרק centriole בודד presenלא בכל מוט ציר. C) Spermiogenesis. בסוף המיוזה השני, יש לו את סיבוב המוקדם Spermatid centriole אחד מצורף קרום הפלזמה invaginated. נגזר המיטוכונדריה עגולה גדול נמצא בקרבת הגרעין ומאוחר יותר מתחיל להאריך לאורך axoneme גדל בSpermatids העגול בהמשך. במהלך spermatogenesis, צורות axoneme ומתארך בתוך הציטופלסמה. בנוסף מבנה centriolar חדש המכונה PCL (הפרוקסימלי Centriole כמו) מופיע ליד centriole קיים מראש 1. בסופו של תאי זרע, תאי שיתוף ציסטה נפוצה להפריד אחד מהשני כדי להפוך זרע נעים לבגרות מלאה. דיאגרמות של פיתוח Spermatocyte (B) וSpermiogenesis (C) מתארת ​​רק תא אחד מתוך 16 Spermatocytes ו64 Spermatids, בהתאמה לציסטה, ולא מתארת ​​את תאי ציסטה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50938/50938fig1large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גדול</a> דמות r. <img src="/files/ftp_upload/50938/50938fig2.jpg" alt="איור 2" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50938/50938fig2highres.jpg"> איור 2. אשכי דרוזופילה. כיסוי של מיקרוסקופ שלב בניגוד וקרינת ה-GFP של אשך כל ההר המבטא את הסמן הפאן centriolar אנה-1-GFP. האזור נפרד המתאים ללוחות 1-3 של איור 1 מופרדים על ידי קו אדום מקווקו) בתאי גזע וSpermatogonia, B) Spermatocytes ומיוזה, C) Spermiogenesis. <img src="/files/ftp_upload/50938/50938fig3.jpg" alt="איור 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50938/50938fig3highres.jpg"> איור 3. מסלולים לקראת centrosomes ההדמיה בדרוזופילה אשכים. : לשמור-together.within-page = "תמיד"&gt; <img src="/files/ftp_upload/50938/50938fig4.jpg" alt="איור 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50938/50938fig4highres.jpg"> איור 4. Centrosome התארכות במהלך spermatogenesis. א) כל שלב מציג תמונת שלב בניגוד (משמאל), תמונת הקרינה (באמצע), ותמונה מוגדלת של centrosome (מימין). תמונת שלב בניגוד מדגימה את שלב תא המסוים המבוסס על המיקום והמורפולוגיה של התא, גרעין, הגרעינון, ומיטוכונדריה. תמונת הקרינה תערוכות DNA מוכתם בDAPI (כחול). תמונת centrosome תערוכות centrosomes מתויג על ידי Asterless-GFP (ASL, תמונות למעלה) וAna1-GFP (Ana1, תמונה למטה). עיגול לבן מדגיש את קרום התא בשני תמונות שלב בניגוד וקרינה. העיגולים לבנים המקווקו והעיגול האפור בתמונה הקרינה להדגיש את עמדתו של הגרעין והגרעינון, בהתאמה. נקודות חץ צהובה לY-כרומוכמה לולאות. אדום מקווקו חוגים לסמן את המיטוכונדריה. השלבים 1-6 מתייחס ל29 ושלבי 13-17 מתייחס לתיאור של שלבי תא ב32. שלב 1: היסודי Spermatocyte. זוהה כתאים קטנים קצה של האשך. 2a שלב: פולאר Spermatocyte. שזוהה על ידי נוכחותו של כובע מיטוכונדריה בצד אחד של הגרעין. שלב 3: Apolar Spermatocyte. זוהה על ידי הגודל הגדול יחסית שלה מאשר spermatocyte וחוסר כובע מיטוכונדריה העיקריים. שלב 4: היסודי Spermatocyte. שזוהה על ידי המראה של כל: כל 3 לולאות כרומוזום Y. שלב 5: למבוגרים ראשוניים Spermatocyte. Spermatocyte הגדול ביותר המיוצר בתאי זרע שנוצר על ידי עלייה נוספת בגודל גרעיני. שלב 6: Premeiotic הראשי Spermatocyte. לולאות כרומוזום Y להתפורר והגרעין נעלם. שלב 13: בצל שלב Spermatid. תא עגול המכיל גרעין ומיטוכונדריה שווה בגודלן. שלב 17: spermatid המאוחר. זוהה כspermatid מוארך שנשאר חלק מbundlדואר של 64 spermatids עם גרעינים שנמצאו ליד הבסיס של האשכים., גרעינים הם מעט רחבים יותר מבוגר spermatids נמצא בשלפוחית ​​הזרע. ברים סולם, 10 מיקרומטר ו1 מיקרומטר. B) גרף מתאר סטייה עבור כל שלב ממוצעת וסטנדרטית, כפי שנמדד על ידי Asterless-GFP (כחול) וAna1-GFP (ירוק). בשלב 6, Asterless-GFP (כחול) וAna1-GFP ממוצעים (ירוקים) וסטיות תקן החפיפה וAsterless-GFP בלבד (כחול) הוא נראית לעין. החל מהשעה 13 השלב, Asterless-GFP לא לקשט את כל centriole ומדידות לא נקבעו (ND). <img src="/files/ftp_upload/50938/50938fig5.jpg" alt="איור 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50938/50938fig5highres.jpg"> איור 5. Centrioles באופן חריג לזמן בשלב מוטאנטים 6 Spermatocytes של aly ויכול. AC) מיקרוסקופ אור של אשכים כולו ולוח ניאון של la centrosome נציגbeled ידי Ana1-GFP. שים לב לצורה נורמלית של האשכים בaly ויכול מוטציות, הנובעת ממחסור בspermatids כתוצאה ממעצר meiotic. ד) גרף מתאר ממוצע, סטיית תקן, והפצת נתונים של אורך centriole בwild-type, אליי ויכול . מספר לדוגמא עבור כל נקודת נתונים הוא בסוגריים. סרגל קנה מידה, 1 מיקרומטר.

הדמיה של חלבוני centrosomal במהלך spermatogenesis דרוזופילה היא שיטה רבת עוצמה לזיהוי חלבונים חדשים חיוניים לביולוגית centrosome, כמו גם על מנת להבהיר את הפונקציה המסוימת של שחקנים ידועים בתהליך זה.

Centrosomes הדמיה באשכים טוס

Centrosomes are conserved microtubule-based organelles whose structure and function change dramatically throughout the cell cycle and cell ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא להשתמש בסמני סנטרו סומלים מתויגים גנטית כדי לסנן מוטציות גנטיות חדשות ולחשוף את התפקוד של גנים סנטרו סומליים שזוהו לאחרונה. ניתן להשיג זאת על ידי שלוש אסטרטגיות הדמיה שונות. עקוב אחר הדמיה של אשכים חיים, מסלול B, קיבוע כימי של האשכים או עקוב אחר צביעה חיסונית C.השלב הראשון של ההליך הוא לבודד את האשכים של זבובים המבטאים חלבונים סומליים מרכזיים מתויגים גנטית, שאחריהם ניתן לבצע הדמיה מיידית. השלב השני הוא קיבוע כימי של האשכים, שאחריו ניתן גם להדמיה. שלישית, האשכים יכולים להיות מוכתמים במערכת החיסון ולאחר מכן לדמות.בסופו של דבר, מיקומם של חלבונים צנטריים מזוהים על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום האזור המרכזי, כגון בסיס מולקולרי של היווצרות מרכזית, התארכות מרכזית והפרדה מרכזית. התחל בבידוד אשכי דרוזופילה כמפורט בפרסום JoVE 2 6 4 1.לאחר בידוד האשכים, טבלו את הדגימה בשישה מיקרוליטרים של מאגר מכתים טרי בטמפרטורת החדר על שקופית מיקרוסקופ זכוכית טעונה חיובית. המתן 10 דקות, ולאחר מכן שטוף בעדינות את עודפי ה-DPI על ידי החלפת מאגר הצביעה פעמיים. עם שישה מיקרוליטר PBS.היזהר לא לשטוף את האשכים. הסר את התמיסות מהשקף באמצעות פיסת נייר סינון כדי לנדף אותה. שישה נפחי מיקרוליטר עובדים היטב עבור החלקות כיסוי של 18 מילימטר רבוע.כעת זה עוזר להשתמש באזמל חד כדי לנקב את האשכים ליד סוג התא המעניין, וזה ממזער את הלחץ על תאים אלה במהלך שלב הריסוק. לאחר מכן הניחו בזהירות תלוש כיסוי על גבי הדגימה ואטמו אותה עם לק. לאחר מכן סמן את מיקום האשכים על השקופית בעזרת עט והמשך להדמיה.לאחר בידוד האשכים, טבלו אותם בטיפה של שישה מיקרוליטר של PBS על גבי שקופית מיקרוסקופ זכוכית טעונה חיובית. כיוון ידני את האשכים בצורה ליניארית או לפי העדפה אחרת. לאחר מכן השתמש בפיסת נייר סינון כדי לנדף את ה-PBS ולהחליף אותו בשישה מיקרוליטרים של מאגר קבוע טרי שהוכן מראש.לאחר חמש דקות במאגר הקבוע, נדפו אותו בעזרת פיסת נייר פילטר. כעת טבלו את הדגימה בשישה מיקרוליטרים של מאגר צביעה DPI טרי שהוכן למשך 10 דקות. שטפו את ה-DPI על ידי החלפתו בשני נפחים של שישה מיקרוליטר של PBS.לאחר מכן הניחו בזהירות כיסוי בגודל 18 מילימטר מרובע על גבי הדגימה ואטמו אותה עם לק. לאחר מכן סמן את מיקום האשכים בשקופית והמשך בהדמיה. עבור הליך זה תחילה, הכינו כמה פתקי כיסוי סיליקון.ראשית, טבלו את החלקות הכיסוי במגש קטן של תמיסה סיליקונית למשך דקה בטמפרטורת החדר מתחת למכסה אדים, וודאו שהחלקות הכיסוי חשופות לחלוטין ואינן נערמות זו על גבי זו. לאחר מכן, שטפו את הכיסוי שלוש פעמים במים למשך דקה אחת לכל כביסה. לאחר מכן יש שלוש שטיפות של דקה אחת באתנול 70% ושטיפה אחרונה של דקה במים.לאחר מכן אפשר להחלקות הכיסוי הסיליקון להתייבש באוויר מתחת למכסה אדים. לאחר ניתוח מספר אשכים וקבר שקופית עם סוג הדגימה, הוסף חמישה מיקרוליטר של PBS לכיסוי הסיליקון והעביר את האשכים לטיפה של PBS. יש צורך במספר פתקי כיסוי שלכל אחד מהם אשך בודד כדי להבטיח הצלחה.לאחר מכן, תחת מיקרוסקופ דיסקציה, חודרים בזהירות כל אחד מהאשכים כפי שהודגם קודם לכן. כעת, הניחו בעדינות מיקרוסקופ זכוכית טעון חיובית. החלק מעל החלקת הכיסוי, ואפשר ל-PBS להתפזר באופן שווה בין החלקת הכיסוי למגלשה.לאחר מכן נדפו את המאגר העודף בין החלקת הכיסוי להחלקה, מה שיגביר את הלחץ על האשכים וימעך אותם. כעת זרוק את השקופית המוכנה לחנקן נוזלי. כעת ניתן להכין מגלשות נוספות ולהוסיף למיכל.לפני שתמשיך להשתמש במלקחיים גדולים, הסר את אחת השקופיות מהחנקן הנוזלי והשתמש במהירות באזמל כדי להסיר את החלקת הכיסוי. הדגימה צריכה להישאר על השקופית תוך הסרת החלקת הכיסוי מהדגימה. היזהר לא למרוח אותו על פני שקופית ה-S.ניתן להשיג זאת על ידי שימוש באזמל כדי להחליק את הכיסוי בתנועה מהירה אחת. כעת דגרו את השקופיות בצנצנת זכוכית מזכוכית מלאה במתנול. צונן במינוס 20 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.לאחר הדגירה מעבירים את השקופיות לצנצנת המכילה אצטון. צונן במינוס 20 מעלות צלזיוס לאחר 30 שניות באצטון. שוטפים את השקופיות למשך דקה ב- PBS בטמפרטורת החדר.לאחר מכן, דגרו את המגלשות למשך 10 דקות ב-PBST טרי שהוכן כדי לחסום אתרים לא ספציפיים במהלך הדגירה של PBS TB, מלאו את הבארות של תא לחות במים לאחר 10 דקות, הסר את המגלשות מה-PBST וייבש כל מגלשה סביב הדגימה. היזהר לא לייבש את הדגימה עצמה. כאשר כל מגלשה מיובשת.הניחו אותו בתא הלחות. חשוב לייבש את אזור המגלשה המקיפה את הדגימה לפני הוספת תמיסת הנוגדנים. זה מבטיח שהנוגדן יישאר ממוקם על הדגימה, ובכך מונע ייבוש במהלך שלב הדגירה.לאחר מכן זרוק בעדינות 100 מיקרוליטר של נוגדן ראשוני מדולל ב-P-B-S-T-B-R שהוכנו לאחרונה על הדגימות. השתמש בדילול של 1 עד 200 עבור נוגדנים לא אופייניים. לאחר מכן הניחו חתיכה מרובעת של פרפורם בסנטימטר אחד על גבי הדגימה כדי לפזר את תמיסת הנוגדנים ולהגן על תמיסת הנוגדנים מפני אידוי.אפשר לדגימות לדגור במשך שעה בטמפרטורת החדר. לאחר שעה, השתמש במלקחיים כדי להסיר בעדינות את הפרפורם מהשקופיות. לאחר מכן שטפו את השקופיות שלוש פעמים ב-PBST בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות לכל כביסה.לאחר מכן, העבירו את השקופיות לתא הלחות כשהדגימה פונה כלפי מעלה הוסיפו בעדינות 100 מיקרוליטר של נוגדן משני מדולל ב-PBST, BR על הדגימות. כמו קודם, יש למרוח פרפורם ולהמתין שעה לשטוף את המשני עם שלוש שטיפות של חמש דקות ב-PBST ולאחר מכן שלוש שטיפות של חמש דקות ב-PBS. לאחר מכן מחק בזהירות את השקופיות יבשות מבלי לגעת בדגימות.הוסף שישה מיקרוליטר של מדיית הרכבה והחל החלקת כיסוי סטנדרטית. לאחר איטום החלקת הכיסוי עם לק וסימון מיקום האשכים, המשך בהדמיה. צנטרוזומים עוברים טרנספורמציות מורפולוגיות ותפקודיות מרובות במהלך הזרע.תהליך אחד שנצפה בקלות הוא התארכות צנטרוזום בזרעונים, סמן ה-LAR ANA GFP אחד מסמן את ה-ole באורך 0.6 מיקרון ש-ole זה מאריך במהלך הזרע ומגיע לאורך של 2.5 מיקרון בזרעונים כמעט בוגרים. מכיוון ששמני צנטרי של זרע דרוזופילה הם ארוכים במיוחד, ניתן להשתמש בהדמיה כדי להצהיר הצהרות כמותיות לגבי התארכות צנטרוזום. בהשוואה למורפולוגיה של סוג הבר, זוהו מוטציות שונות המשנות את הצמיחה המרכזית.שתי דוגמאות הן תמיד מוטציות מוקדמות וכדורי תותח שעוצרות את הזרע לפני הופעת המיוזה, אך אינן חוסמות את התארכות הסנט במוטציות אלה שמנים של הזרעונים הבוגרים גדלים לכ-2.4 מיקרון בהשוואה לשמני סנט של תאי ביקורת, המגיעים לאורך מקסימלי של 1.8 מיקרון. לאחר שליטה ניתן לבצע את רצועה A תוך 20 דקות, רצועה B תוך 30 דקות ומסלול C תוך שלוש עד חמש שעות בהתאם לגודל המדגם. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לדמיין צנטרוזום בטיסה.

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

שיטות לבידוד והכנת דגימות דרוזופילה אשכים (לחיות וקבוע) להדמיה על ידי שלב בניגוד ומיקרוסקופ פלואורסצנטי מתוארים במסמך זה.

ניתוח ציטולוגית של תאי זרע: הכנות בשידור חי והקבועות של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; אשכים

צביעה חיסונית היא טכניקה יעילה להמחשת סוגי תאים וחלבונים ספציפיים בתוך רקמות. על ידי שימוש בסוניקציה, הפרוטוקול המתואר כאן מקל על הצורך לנתח רקמות Drosophila melanogaster מעוברים וזחלים בשלב מאוחר לפני צביעה חיסונית. אנו מספקים מתודולוגיה יעילה לצביעה חיסונית של זחלי הר שלמים קבועים בפורמלדהיד.

הקל Sonication Immunofluorescence הכתמה של שלב מאוחר עוברי וזחל<em&gt; דרוזופילה</em&gt; רקמות<em&gt; באתר</em

כאן, פותחה בדיקת פלואורסצנציה כמותית חדשה כדי למדוד שינויים ברמת חלבון במיוחד בצנטרוזומים על ידי נורמליזציה של עוצמת הקרינה של החלבון לזו של תקן פנימי מתאים.

כמותי Immunofluorescence Assay למדוד הווריאציה ברמות חלבון בCentrosomes

כאן אנו מדווחים על פרוטוקולים לאיתור חלבוני צנטרומר-קינטוכור אנדוגניים ואקסוגניים בתאים אנושיים ולכמת את רמות החלבון הללו בצנטרומר-קינטוכור על ידי צביעה אימונו-פלואורסצנטית עקיפה באמצעות קיבוע (קיבוע פרפורמלדהיד, אצטון או מתנול).

חלבונים Immunofluorescence ניתוח של אנדוגני אקסוגניים centromere-קינטוכור

אנו מציגים פרוטוקולים לאיסוף, הכנה והדמיה של ביציות דרוזופילה בוגרות. שיטות אלו מאפשרות הדמיה של התנהגות הכרומוזומים והרכבת הציר ותפקודו במהלך מיוזה.

טכניקות הדמיה prometaphase ו Metaphase של המיוזה ואני קבוע<em&gt; תסיסנית</em&gt; ביציות

מטרת טכניקה זו סקווש צנורית הוא להעריך במהירות תכונות cytological של פיתוח העכבר spermatocytes תוך שמירה על תקינות הסלולר. שיטה זו מאפשרת הלימוד בכל שלבי יצירת זרע, ניתן ליישם בקלות לצד הביוכימי והמולקולרי ביולוגי גישות אחרות לצורך המחקר של העכבר מיוזה.

טכניקה סקווש צנורית וכמה לניתוח Cytological של יצירת זרע שימוש במודל עכבר

המטרה של פרוטוקול זה היא לנתח את חלוקת התא ברקמה שלמה על ידי מיקרוסקופ התאים החיים והקבוע באמצעות דרוסוילה מיוטיק מאיוציטים. הפרוטוקול מדגים כיצד לבודד את כל האשכים שלמים, מזחלים מדרוזופילה ומהגלמים המוקדמים, וכיצד לעבד ולטעון אותם למיקרוסקופיה.

הכנת מדרוזופילה זחל ופופל אשכים לניתוח חטיבת תאים בשידור חי, רקמה שלמה

אנו מציגים כאן פרוטוקול משופר להכנה וחיסון של כל ההר של אשכי דרוזופילה, מתאים למיקרוסקופיה קונפוקלית וגם מאפשר תיוג ניתן לשחזור ואמין. אנו ממחישים פרוטוקול זה על ידי ייצוג תלת מימדי וכימות של ניסויי קולוקליזציה על זרעונים S4-S5 גדולים.

חיסון של אשכי דרוזופילה הר שלם לניתוח קונפוקלי תלת מימדי של זרעונים גדולים

מוצג כאן פרוטוקול להדמיית תאים חיים ברזולוציית-על ברקמה שלמה. התקנו את התנאים להדמיית אוכלוסיית תאי גזע בוגרים רגישים מאוד בסביבת הרקמה הטבעית שלה. טכניקה זו כרוכה באיזון רזולוציה זמנית ומרחבית כדי לאפשר תצפית ישירה של תופעות ביולוגיות ברקמה חיה.

הדמיית תאים חיים ברזולוציה סופר-רזולוציה של מבנים תת-תאיים

מאמר זה מדווח על עיכוב in vivo של CENP-E באמצעות ניתוח בטן והזרקת GSK923295 באשכים, מודל רב ערך לחלוקה מיוטית גברית. באמצעות בדיקות אימונופלואורסצנטיות, ציטומטריית זרימה ומיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת, אנו מראים כי עיכוב CENP-E גורם לחוסר תיאום כרומוזומים וחוסר יציבות גנומית בזרעונים של עכברים.

הערכה תפקודית של קינזין-7 CENP-E בזרעונים באמצעות עיכוב Vivo , אימונופלואורסנציה וציטומטריית זרימה

תנועת כרומוזומים במהלך פרופאזה מיוטית היא תופעה לא מובנת היטב שהיא בסיסית להיווצרות נבגים. פרוטוקול זה מתאר שיטה לרכישה, ניתוח וכימות של תנועות צנטרומר במהלך פרופאזה מיוטית במיוציטים זכריים של Arabidopsis thaliana .

אפיון הדמיה חיה של תנועות צנטרומר במהלך פרופאזה מיוטית זכרית ב- Arabidopsis thaliana

למד טכניקות הדמיה לחלבונים צנטרוזומליים בזרעיות Drosophila במהלך סpermatogenesis. שיטות אלה מאפשרות זיהוי חלבונים חדשים והבנת התפקיד שלהם בביולוגיית הצנטרוזום ובחלוקת התא.

Centrosomes הדמיה באשכים טוס

גלה סרטונים נוספים