דגם תרבות רקמות תלת ממדי למחקר עיקרי עצם אדם מח וממאיר שלו
8 במרץ 2014
בשיטות סטנדרטיות תרבות תאים נלקחים מתוך הסביבה הפיזיולוגית שלהם וגדלו על משטח הפלסטיק של מנה. כדי לחקור את התנהגותם של תאים במח עצם אנושיים ראשוניים שיצרנו מערכת תרבות 3-D בו תאים גדלים בתנאים משחזרים microenvironment יליד הרקמות.
המטרה הכוללת של הליך זה היא להקים מערכת תרבית המסכמת מקרוב את המיקרו-סביבה התאית והתוך-תאית של מח העצם האנושי. ראשית, פני השטח של באר תרבית רקמות מצופים במטריצה התעשייתית. ואז תאים חד-גרעיניים של מח עצם, או תאים מעניינים אחרים מעורבבים עם מטריצת מח העצם.
מאוחר יותר מסירים את המטריצה התעשייתית ומוסיפים את תערובת מטריצת התאים לבאר. לאחר שהמטריצה צעקה, היא מכוסה במדיום גידול. בסופו של דבר, ניתן לדמיין תאים ישירות במטריצה או לבודד אותם לניתוחים במורד הזרם בהשוואה לשיטות הקיימות לתרבית תאים.
לדוגמה, שיטות תרבית רקמה סטנדרטיות או מודלים של תרבית משותפת שבהם מגדלים תאים על פלסטיק. היתרון העיקרי בשימוש בשיטת תרבית תלת מימד הוא שתאים גדלים בתוך סביבת המיקרו הפיזיולוגית ומכאן שהיא מאפשרת לך לחקור תאים בתנאים הטבעיים של הרקמה. הכינו צלחת 48 באר בה יצופו התאים.
על ידי הוספת 65 מיקרוליטר של תמיסת ציפוי תעשייתי לכל אחד, מורחים היטב את התמיסה באופן שווה כדי לכסות את כל שטח הבאר. שיטה זו ניתנת להרחבה גם למשטחים אחרים. הניחו לצלחות לדגור בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות לפחות.
בינתיים, הכינו את תרחיף התאים של 50,000 תאים למיקרוליטר PBS. התכוננו מספיק כדי להוסיף 10 מיקרוליטר לכל באר ואז בצינור איינור, ערבבו את תרחיף התא עם 100 מיקרוליטר של מטריצת עצם משוחזרת לכל . מערבבים היטב בעדינות והימנעו מהכנסת בועות.
שמור את התערובת על קרח כדי שהמטריצה לא תג'ל כשהצלחת הסתיימה. דגירה, הסר את כל תמיסת הציפוי הנוזלית והנקודתית באמצעות שאיפה. לאחר מכן הוסף 100 מיקרוליטר של מתלה תאים מעורבב היטב עם מטריצה לכל אחד.
ובכן, הטה במהירות את הצלחת בעזרת פיפטה כדי לכסות את כל שטח הבאר באופן שווה. המשך לערבב את המתלה בין מילויי בארות מכיוון שהתאים יתקבצו לאחר טעינה מלאה. דגרו את הצלחת למשך 30 עד 60 דקות ללא תסיסה עד שהמטריצה מתמצקת.
לאחר מכן, יש לחמם מראש את מדיום גידול מח העצם באמבט מים המוגדר ל -37 מעלות צלזיוס. לאחר 30 דקות של דגירה, בדוק שהמטריצה התייצבה כהלכה. מטריצה טובה יוצרת שכבה רכה דמוית ג'ל שאינה זזה כאשר הצלחת מוטה.
כאשר המטריצה מוכנה, כסה אותה בעדינות עם מיליליטר בינוני טיפתי באמצעות פיפטה סרולוגית. לאחר מכן החזר את תרבית מטריצת העצם המשוחזרת המורכבת לחממה עד 30 יום ללא שינויים בינוניים. אם נדרש שינוי בינוני, החלף רק מחצית מהמדיום בבת אחת.
הסר את המדיום בעדינות מבלי להפריע לשכבת המטריצה. הטה את הצלחת ונקז את המדיום בעדינות בעזרת פיפטה. אל תשאף את המדיה מעל המטריצה מאוחר יותר.
בעת צביעת התאים. השתמש בטכניקה זו לשינויים בפתרון. להסרת מדיה מהבארות של תרבות תלת מימדית, חיוני מאוד להסיר אותה מהצד של הבאר.
אחרת, המטריצה תופרע והתאים עלולים ללכת לאיבוד היצמדות לאותה טכניקה. שטפו את התאים פעמיים עם אחד סטרילי XPBS. לאחר מכן הוסף חצי מיליליטר של תמיסת התאוששות תאים קרים כקרח לכל אחד.
ובכן, הסר את כל שכבת המטריצה יחד עם התאים על ידי פיפטינג נמרץ למעלה ולמטה. עבור כל אחד, העבירו היטב את האוסף לצינור מיקרו צנטריפוגה והניחו אותו על קרח. לאחר מכן הוסף חצי מיליליטר נוסף של תמיסת התאוששות לאותה באר ואסוף את כל החומר שנותר.
מערבל את כל האוספים, ודוגר אותם במשך שעה על קרח. במהלך השעה, מערבל את הצינורות כל 15 דקות כדי להקל על שחרור התאים מהמטריצה. לאחר שעה, בדוק את התערובת אם יש גושי מטריצה גלויים.
אף אחד מהם לא אמור להיות נוכח, אך אם יש, העבירו את התערובת לצינור גדול יותר והוסיפו עוד שניים עד חמישה מיליליטר של תמיסת התאוששות תאים. לאחר מכן דגרו על התאים למשך 30 עד 60 דקות נוספות. מערבולת מעת לעת, ובדוק שוב אם אין גושי מטריצה.
כאשר המטריצה כבר לא מגובשת. צנטריפוגה את התערובת ב-1000 סל"ד למשך חמש עד 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן הסר את הסופרנטנט והשהה מחדש את כדור התא במיליליטר של XPBS קר.
חזור על הצנטריפוגה. החלף את הסופרנטנט ב-PBS טרי וחזור על הכביסה. פעם שלישית.
לאחר שטיפת ה- PBS השלישית, שחזר את התאים בתמיסה המתאימה להליך הבא. תאי מח עצם גודלו במטריצת עצם משוחזרת במשך 30 יום וצולמו מעת לעת במיקרוסקופ אור בהגדלה של פי 200. יסודות סטרומליים התגלו לראשונה ביום החמישי, אך הם היו ברורים ביום ה-14.
במהלך תקופת התרבית, תאים נדדו דרך המטריצה והצטברו לאשכולות נפרדים. מסות של תאים ממאירים התרחבו עם הזמן כדי להעריך את הרכב רכיבי הסטרומה שגדלים ב-RBM. נבדקה המורפולוגיה של התאים במעבר בין RBM לציפוי התעשייתי.
התאים נצבעו לפיברונקטין, אקטין וגרעינים. תאי הדמיה עם מורפולוגיה סטרומלית הוכחו כאוסטאובלסטים עם רמות גבוהות של פעילות פוספטאז אלקליין. הם היו מסוגלים למינרליזציה של סידן כפי שנקבע על ידי צביעה אדומה של זרין תאים עם נוכחות נראית לעין של טיפות שומן זוהו כאדיפוציטים על סמך צביעה חיובית בשמן.
תאים אדומים עם גרעינים מרובים מדי פעם זוהו כאוסטאוקלסטים והיו חיוביים לחומצה פוספטאז עמידה לטטרט. לאחר בידוד תאים מתרבית תלת מימדית, אתה יכול לעשות מגוון דברים. לדוגמה, אתה יכול לחקור את הפנוטיפים התאיים של תאים שונים הגדלים במיקרו-סביבה.
אתם יכולים לחקור את ביטוי הגנים והחלבונים, ואתם יכולים אפילו לקבוע איזה סוג של מולקולות מופרשות על ידי התאים האלה בתנאים תלת-ממדיים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג מערכת תרבית בת תלת-ממד שנועדה לבחון תאי מחית עצם אנושיים ראשוניים בסביבה המדמה את המיקרו-סביבה הטבעית שלהם. השיטה מאפשרת ויזואליזציה ישירה של התאים או בידודם לצורך ניתוחים נוספים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- טכניקות תרביות תאים
- התנהגות תאי מוח עצם
- הנדסת רקמות תלת-ממדית
רקע
- שיטות תרבית סטנדרטיות מסירות לעיתים קרובות תאים מהסביבה הפיזיולוגית שלהם.
- תאי מח עצם דורשים תנאים ספציפיים כדי לשמור על התפקוד שלהם.
- מערכות תרבית בתלת-ממד (3-D) יכולות לשחזר טוב יותר את הסביבה in vivo.
- מחקר זה נועד לשפר את ההבנה של התנהגות תאי מח עצם.
מטרת המחקר
- פיתוח מערכת תרבית הדמה קרוב ככל הניתן את מיקרו-הסביבה של מחית העצם האנושית.
- מתן אפשרות למחקר של תאי מחית עצם אנושיים ראשוניים בהקשר רלוונטי יותר מבחינה פיזיולוגית.
- הקלת ניתוחים המשכיים (downstream) של התאים המטופחים.
השיטות שנעשה בהן שימוש
- ציפוי בארות לתרבית רקמה במטריקה תעשייתית.
- ערבוב תאי מונונוקלאריים ממחול השומן עם המטריקה של מחול השומן.
- הסרת המטריקה התעשייתית לאחר ההגלה.
- כיסוי תערובת התאים והמטריקה במצע גידול.
תוצאות עיקריות
- ניתן להדמיות של תאים ישירות בתוך המטריצה.
- ניתן להשתמש בתאים מבודדים למגוון אנליזות המשך.
- מערכת תרביות התלת-ממד משפרת את חקר התנהגות תאי מחול השומן.
- התוצאות מעידות על רלוונטיות פיזיולוגית מוגברת בהשוואה לשיטות מסורתיות.
מסקנות
- מערכת התרביות התלת-ממדית שפותחה מחקה ביעילות את סביבת מחול השומן.
- שיטה זו עשויה לקדם את המחקר על תפקוד תאי מחול השומן.
- מחקרים עתידיים יכולים לנצל מערכת זו להשגת תובנות עמוקות יותר לגבי ההמטופואזה.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
תאי מחית עצם אנושיים ראשוניים קשים לתחזוקה ex vivo בשל אובדן רמזים מהמטריקס החוץ-תאי טבעי, מה שמגביל מודלים פרה-קליניים של ממאירות המטולוגיות ואינטראקציות סטרומליות. מערכת ה-rBM מספקת מיקרו-סביבה תלת-ממדית רלוונטית פיזיולוגית המשמרת את החיות והתפקוד של מחית עצם ראשונית למשך עד 30 ימים, ובכך מאפשרת הפחתת סיכונים מכניסטית של מועמדים טיפוליים. הדבר תומך בתיקוף מטרות ובהמשכיות פרה-קלינית על ידי שימור ההרכב התאי ואפשרות לוויזואליזציה של התנהגות תאים ותגובה לתרופות בתוך המטריקס בזמן אמת.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות בהקשר סטורמלי דמוי-טבעי, ובכך מבהיר תלויות של מסלולים במח עצם אנושי ראשוני.
- ערך תפעולי: תומך בתיקוף פונקציונלי של מטרות על ידי שמירה על אינטראקציות פיזיולוגיות בין תאים ובין תאים למטריקס, שהן קריטיות לפנוטיפים ממאירים וסטורמליים.
- ערך ניבוי: מגביר את הביטחון בתוצאות של מעורבות מטרות וסינונים פנוטיפיים על ידי הפחתת ארטיפקטים הנובעים מתנאי תרבית מלאכותיים.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay Development)
- מוכנות הבדיקה: יוצר תרביות תלת-ממדיות סטנדרטיות וניתנות לשחזור, המתאימות לסריקת תרכובות עם קריאות כמותיות של הישרדות תאים, שגשוג ומורפולוגיה.
- قابליות להרחבה: תואם לפורמטים של פלטות בעלות 48 בארות וניתן להתאמה לזרימות עבודה בעלות תפוקה גבוהה יותר עבור קמפיינים לזיהוי מובילים (lead identification).
- ערך הסריקה: מאפשר הערכה מהימנה של טיפולים חדשניים במערכת רלוונטית למחלה, המשמרת את ההטרוגניות של תאים ראשוניים ואת האינטראקציות עם הסטרומה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- המשכיות תרגומית: שומר על ההרכב התאי של מחית עצם ראשונית מתורמים בריאים וממטופלים עם עמילואידוזיס וממאירות המטולוגיות, ובכך תומך במחקרים פרה-קליניים המותאמים לסמנים ביולוגיים.
- תועלת פרה-קלינית: מאפשר בידוד של תאים מתרביות לצורך השתלה in vivo, ציטומטריה של זרימה, ואנליזה של חומצות גרעין וחלבונים, ובכך מגשר בין שלב הגילוי לשלב התיקוף.
- קבלת החלטות מותאמת סיכונים: מסייע בהערכת השפעות של תרופות התלויות בסטרומה ומנגנוני עמידות, ובכך משפר את קריטריוני ה-go/no-go בשלבי פיתוח מוקדמים.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
מערכת ה-rBM משתלבת ברצף הגילוי, החל מתיקוף המטרה, דרך זיהוי מוביל ועד להערכה פרה-קלינית, ובייחוד עבור גידולים המטולוגים ממאירים וטיפולים התלויים בסביבה המיקרוסקופית.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת היפותזות ובבירור מסלולים על ידי גידול תאי מחול לשד עצם ראשוניים במיקרו-סביבה המשחזרת את העצם האנושית.
- סריקה: מספק תוצאות כמותיות וניתנות לשחזור לגבי חיוניות תאים, התקבצות ושינויים מורפולוגיים לאורך זמן, מה שמאפשר השוואה בין תרכובות.
- אנליזה: מאפשר ויזואליזציה בזמן אמת ואנליזת נקודת סיום של פנוטיפים של תאים סטורמליים ומגוליים, כוללו דיפרנציאציה של אוסטאובלסטים, אדיפוציטים ואוסטאוקלסטים.
- מחקר תרגומי: מאפשר רצף מגידול בתלת-ממד לבדיקות תפקודיות המשך, כגון השתלה ופרופילינג מולקולרי.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמה רב-פעמית לחקר ביולוגיה של מחול לשד עצם ראשוני במגוון פרויקטים ושיטות טיפוליות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי על ידי הפחתת עמימות מכניסטית בתגובות לתרופות המכוונות למחית העצם.
- ערך תפעולי: מספק מערכת סטנדרטית וניתנת להרחבה עם נהלי הכנה של מטריצה ותחזוקת תרביות מוגדרים.
- ערך אסטרטגי: משפר את יעילות ההון על ידי כך שמאפשר זיהוי מוקדם של חוסר יעילות או רעילות בלתי צפויה במודלים רלוונטיים פיזיולוגית.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מועמדים מותאם סיכון בהתבסס על פרופילי אינטראקציה עם הסטרומה והתנהגות תאים ממאירים בתנאים הרלוונטיים לבני אדם.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטכניקות של תרביות תאים בתלת-ממד וטיפול במטריצה חוץ-תאית.
- תלוי בגישה למטריצת עצם משוחזרת ומצעי גידול מתאימים המועשרו בפלסמה אנושית.
- מחייב הכשרה סטנדרטית להכנת המטריצה, השקעת תאים והנחת שכבת מצע כדי להבטיח הדירות.
- דורש התאמה של פרוטוקולי בידוד במורד התהליך כדי להוציא תאים חיים ממטריצת הג'ל מבלי לפגוע בחיוניותם או בפנוטיפ שלהם.
- מוגבל בשל הצורך להימנע מהחלפות מצע המפריעות למטריצה, מה שדורש טכניקות זהירות של החלפת חצי כמות המצע בעת הצורך.
